Name: discovery of driver genes in colorectal ht29-derived cancer stem-like tumorspheres
Uploaded: 2020-07-22T13:00:00
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Los autores agradecen el Laboratorio Básico de Biología radiológica del Instituto de Investigación Radiológica, Chang Gung Memorial Hospital, por su apoyo técnico. Este estudio fue apoyado por subvenciones del hospital Chang Gung Memorial (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06), y Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 y MMH-106-61). Los organismos de financiación no tuvieron ninguna influencia en el diseño del estudio y la recopilación, análisis e interpretación de datos o en la escritura del manuscrito.

1. Cultivo celular y formación de la tumoral
<ol><li>Cultivo de células HT29 en un plato de 10 cm que contiene el medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de antibiótico de penicilina-estreptomicina (P/S).</li>
	<li>Cultivar las células en una incubadora a 37oC con 5% de CO2 y 95% de humedad en condiciones asépticas, hasta que alcancen el 80% de confluencia.</li>
	<li>Trypsinize HT29 cells with 1 mL of 0.25% trypsin for 5 min at 37 oC and asly neutrally the...

<ol>
	<li>Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+colorectal+cancer:+incidence,+mortality,+survival,+and+risk+factors.">Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors.</a> Przegl&#261;d Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).</li><li>Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+genes+and+miRNAs+in+the+apoptosis+pathway+in+colorectal+cancer+patients.">Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients.</a> Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).</li><li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERBB+receptors:+from+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics.">ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).</li><li>Yarden, Y., Pines, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ERBB+network:+at+last,+cancer+therapy+meets+systems+biology.">The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).</li><li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YM155+as+an+inhibitor+of+cancer+stemness+simultaneously+inhibits+autophosphorylation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+G9a-mediated+stemness+in+lung+cancer+cells.">YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells.</a> PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).</li><li>Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-tumor+heterogeneity+from+a+cancer+stem+cell+perspective.">Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+expression+may+be+useful+as+a+prognostic+indicator+in+colorectal+cancer,+a+tool+for+optimizing+therapy+and+supportive+evidence+for+the+cancer+stem+cell+hypothesis:+a+meta-analysis.">CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).</li><li>Choi, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+markers+in+colorectal+adenocarcinoma:+Clinicopathological+significance.">Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance.</a> Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).</li><li>Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+stem+cell-targeted+treatment:+elimination+or+differentiation.">Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation.</a> Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).</li><li>Grillet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+from+patients+with+colorectal+cancer+have+cancer+stem+cell+hallmarks+in+ex+vivo+culture.">Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture.</a> Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).</li><li>Dallas, N. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+exacerbates+survival+of+cancer+stem-like+tumorspheres+in+EGFR-positive+colorectal+cancers:+RNAseq+analysis+and+therapeutic+screening.">STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).</li><li>Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+adult+intestinal+stem+cell+marker+Lgr5+in+the+metastatic+cascade+of+colorectal+cancer.">Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).</li><li>Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Colorectal+Cancer+Stem+Cell.">Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell.</a> New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).</li><li>Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cancer+stem+cell+markers+CD133,+CD44,+CD24:+association+with+AKT+isoforms+and+radiation+resistance+in+colon+cancer+cells.">Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells.</a> PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).</li><li>Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. 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The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), (2000).</li><li>The Gene Ontology Collective. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gene+Ontology+Resource:+20+years+and+still+GOing+strong.">The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong.</a> Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER+in+2013:+modeling+the+evolution+of+gene+function,+and+other+gene+attributes,+in+the+context+of+phylogenetic+trees.">PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees.</a> Nucleic Acids Research. 41, 377-386 (2013).</li><li>Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+genetic+variations+assisted+by+Ingenuity+Pathway+Analysis+to+comprehensively+investigate+potential+genetic+targets+associated+with+the+progression+of+hepatocellular+carcinoma.">Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).</li><li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetworkAnalyst+3.0:+a+visual+analytics+platform+for+comprehensive+gene+expression+profiling+and+meta-analysis.">NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).</li><li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induces+STAT1+expression+to+exacerbate+the+IFNr-mediated+PD-L1+axis+in+epidermal+growth+factor+receptor-positive+cancers.">Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers.</a> Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li></ol>

En este estudio, se utilizaron tumores de tipo tallo cultivado como modelo en el análisis de datos RNAseq con bioinformática disponible. Para un modelo de enfermedad, se utilizaron tumores timóferas derivadas de HT29. Debido a que las tumoresferas tienen resistencia a los medicamentos contra las terapias tumorales, el modelo establecido se puede utilizar para investigar los mecanismos detallados de resistencia mediante la investigación de las diferencias en la expresión génica. Además, la tecnología genómica que...

El cáncer colorrectal (CRC) es una de las principales causas de muerte con alta prevalencia y mortalidad en todo el mundo1,,2. Debido a mutaciones genéticas y amplificaciones, las células cancerosas crecen sin control proliferativo, lo que contribuye a la supervivencia celular3,la antipoptosis4y la íltividad del cáncer5,,6,,7. Dentro de un tejido tumoral, la heterogeneidad tumoral permite que las células tumorales se adapten y sobrevivan durante los tratamientos terapéuticos8. Las células madre cancerosas (CSC), con una mayor tasa de auto-renovación y pluripotencia que los tipos diferenciales de cáncer, son principalmente responsables de la recurrencia tumoral9,,10 y la CRC metastásica11. Los CCC presentan más resistencia a los medicamentos12,13,14 y propiedades anti-apoptosis15,16, sobreviviendo así a las quimioterapias tumorales.
Aquí, con el fin de investigar el mecanismo potencial para el tallo en las células madre CRC seleccionadas, RNAseq se realizó para examinar los genes expresados diferencialmente en los esferoides tumorales. Las células cancerosas pueden formar esferoides (también llamados tumoresferas) cuando se cultivan en condiciones de baja adherencia y estimuladas por factores de crecimiento añadidos al medio cultivado, incluyendo EGF, bFGF, HGF, y IL6. Por lo tanto, seleccionamos células tumorales CRC HT29 que resisten las quimioterapias con un aumento de STAT3 fosforilado cuando se tratan con oxaliplatina e irinotecon17. Además, HT29 expresó marcadores de tallo más altos cuando se cultiva en las condiciones de cultivo descritas. El modelo CSC derivado de HT29 expresaba mayores cantidades de receptor acoplado por proteína G rico en leucina 5 (LGR5)18, un marcador específico de células madre CRC19,20. Además, CD133, considerado un biomarcador general para las células madre cancerosas, también está muy expresado en la línea celular HT2921. El propósito de este protocolo es descubrir grupos de genes conductores en las tumoresferas similares al cáncer establecidas basadas en conjuntos de datos bioinformáticos en lugar de investigar oncogenesindividuales 22. Investiga posibles mecanismos moleculares a través del análisis RNAseq seguido de análisis bioinformáticos disponibles.
La secuenciación de próxima generación es un método de secuenciación de ADN de alto rendimiento, fácil de disponible y fiable basado en la ayuda computacional, utilizado para examinar exhaustivamente los genes del conductor para guiar las terapias tumorales23. La tecnología también se utiliza para detectar la expresión génica a partir de la transcripción inversa de una muestra de ARN aislada24. Sin embargo, al realizar el cribado con RNAseq, los genes más importantes a atacar con terapia pueden no tener el diferencial de expresión más alto entre las muestras experimentales y de control. Por lo tanto, se desarrollaron algunas bioinformáticas para clasificar e identificar genes basados en conjuntos de datos actuales como KEGG25,GO26,,27o PANTHER28,incluyendo Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 y NetworkAnalyst30. Este protocolo muestra la integración de RNAseq y NetworkAnalyst para descubrir rápidamente un grupo de genes en los esferoides derivados de HT29 seleccionados en comparación con las células HT29 parentales. También se sugiere la aplicación de este método a otros modelos de enfermedades para descubrir diferencias en genes importantes.
En comparación con la investigación de la expresión génica individual, una técnica de alto rendimiento proporciona ventajas para encontrar genes potenciales del conductor fácilmente para la medicina de precisión tumoral. Con conjuntos de datos útiles como KEGG, GO o PANTHER, se pueden identificar genes específicos basados en los modelos de la enfermedad, las vías de señalización o funciones específicas, y esto permite centrarse rápidamente en genes específicos e importantes, ahorrando tiempo y costos de investigación. Una aplicación similar se utiliza en estudios anteriores14,18,31. En particular, un tumor es más complicado porque diferentes tipos de tumores expresan genes y vías distintivas para la supervivencia y la proliferación. Por lo tanto, este protocolo puede detectar genes que distinguen diferentes tipos de tumores en diferentes circunstancias. Existe el potencial de encontrar estrategias eficaces contra el cáncer mediante la comprensión del mecanismo de expresión génica específica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>iRiS Digital Cell Imaging System</td>
			<td>Logos Biosystems, Inc</td>
			<td>I10999</td>
			<td>for observing the formation of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LGR5-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>373803</td>
			<td>LGR5 detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD133-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>372803</td>
			<td>CD133 detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z00333</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03116</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HGF</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03229</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL6</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03034</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183025</td>
			<td>isolate total RNA for RNAseq analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseq performance</td>
			<td>Biotools, Taiwan</td>
			<td></td>
			<td>RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NetworkAnalyst</td>
			<td>Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada</td>
			<td></td>
			<td>http://www.networkanalyst.ca/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>a statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovery of driver genes in colorectal ht29-derived cancer stem-like tumorspheres

Las células madre cancerosas desempeñan un papel vital contra las terapias clínicas, contribuyendo a la recaída tumoral. Hay muchos oncogenes involucrados en la tumorigenesis y el inicio de las propiedades del tallo del cáncer. Dado que la expresión génica en la formación de tumores tirectales derivados del cáncer no está clara, se necesita tiempo para descubrir los mecanismos que trabajan en un gen a la vez. Este estudio demuestra un método para descubrir rápidamente los genes conductores implicados en la supervivencia de las células similares al cáncer colorrectal in vitro. En este estudio se seleccionaron y utilizaron células cancerosas HT29 colorrectales que expresan el LGR5 cuando se cultivan como esferoides y acompañan a un aumento de los marcadores de vástago CD133. El protocolo presentado se utiliza para realizar RNAseq con bioinformática disponible para descubrir rápidamente los genes controladores sobreexpresados en la formación de tumores tirásticos derivados del tallo colorrectal. La metodología puede detectar y descubrir rápidamente posibles genes conductores en otros modelos de enfermedades.

Para establecer el modelo para investigar el mecanismo en las células madre cancerosas, se utilizaron células TI29 colorrectales para cultivar las tumoresferas similares al cáncer in vitro en una placa de baja unión que contiene B27, EGF, bFGF, HGF e IL6. Las tumoresferas >100 m de diámetro se formaron en 7 días(Figura 1A). Las tumoresferas se tripsinaronizaron a células individuales y se analizaron utilizando citometría de flujo para detectar la expresión LGR5 y CD133. LGR5 aument?...

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Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Aquí se presenta un protocolo para descubrir los genes conductores sobreexpresados que mantienen las células similares al cáncer derivadas de las células HT29 colorrectales. RNAseq con bioinformática disponible se realizó para investigar y examinar las redes de expresión génica para esclarecer un mecanismo potencial implicado en la supervivencia de las células tumorales dirigidas.

Descubrimiento de genes conductores en tumores timos similares al cáncer de 29 años de origen colorrectal

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Nuestro protocolo utilizó ARN-Seq y herramientas bioinformáticas para descubrir rápidamente los genes controladores sobreexpresados que contribuyen a la formación de tumores colorrectales similares a tallos. Este protocolo se utiliza para examinar un gen expresado diferencialmente y vías de señal para investigar un mecanismo molecular para el tallo del cáncer en un cáncer colorrectal selectivo. En el séptimo día de cultivo, utilice un microscopio invertido con un sistema de imágenes celulares digitales para observar y medir el diámetro de las tumoresferas.Cuando las tumoresferas alcancen un diámetro superior a 100 micrómetros, trate el cultivo con 0,25% de trippsina. Después de cinco minutos a 37 grados Celsius, neutralice la trippsina con el doble de volumen de medio de crecimiento y cuente las células usando un hemocitociómetro. Recoger las células por centrifugación.Y resuspender el pellet a cinco veces 10 a las cuatro células por cada 100 microlitros de concentración media. Añadir dos microlitros del anticuerpo primario de interés a cada tubo e incubar las células durante 30 minutos a temperatura ambiente y 200 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, lavar cada tubo con 900 microlitros de PBS y analizar las células para la expresión de la proteína de interés por citometría de flujo de acuerdo con protocolos estándar.Para el aislamiento de ARN después de la recolección de tripina como acaba de demostrar, resuspender las células a dos veces 10 a las células quintas por 50 microlitros de concentración de PBS y lise cada muestra con 200 microlitros de tampón de lisis complementado con dos microlitros de tubo de peraptoetanol beta. Después de un breve vórtice y una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, recoger los licatos por centrifugación y añadir 200 microlitros de 70% etanol a cada tubo. Transfiera las muestras a columnas rápidas y retire el disolvente por centrifugación.Lavar las muestras con 400 microlitros de solución de lavado uno y 600 microlitros de solución de lavado dos para eliminar completamente cualquier no ARN por centrifugación, seguido de dos minutos adicionales centrifugación en las mismas condiciones de centrífuga para eliminar cualquier etanol residual. A continuación, resuspender los pellets en 50 microlitros de agua destilada por tubo y centrifugar la muestra durante un minuto antes de recoger el ARN que contiene sobrenadantes. Investigar la expresión génica diferencial entre las células de la tumorsfera en comparación con las células tumorales parentales después del análisis de secuenciación de ARN.Seleccione genes con un cambio de pliegue de más de uno a menos un log2 con recuentos de lectura superiores a 100 en la tumorsfera y los grupos parentales. Y usa los comandos como se indica. Obtener una gráfica volcánica de los datos para determinar la expresión génica diferencial.Para la selección de genes de accionamiento en el analista de red, seleccione la entrada de un solo gen y copie y pegue los genes sobreexpresados seleccionados con el ser humano especificado como el organismo y el símbolo genético oficial como el tipo de identificación. Haga clic en Cargar y continúe. Para insertar y analizar los datos mediante la interacción proteína-proteína, después de la interacción proteína-proteína genética, utilice la base de datos de interactoma STRING con una puntuación de confianza cortada de 900 para mostrar los genes de semillas.Cruzar los genes cargados. Los genes de semillas que se asocian con más genes individuales se pueden seleccionar como genes conductores que pueden estar involucrados en el mantenimiento de la formación de la tumorsfera. Seleccione Continuar en la vista general de asignación en blanco en el Fondo y Forzar Atlas en el botón Diseño.A continuación, seleccione par base PANTHER para analizar el grupo genético de regulación ascendente. Tumoresesferas de más de 100 micrómetros de diámetro se forman dentro de los siete días de cultivo. El análisis citométrico de flujo revela un aumento en la expresión LGR5 y CD133 en tumores de origen HT29 en comparación con las células HT29 parentales.Después de la secuenciación de ARN, los genes con un cambio de plegado de log2 superior en su regulación hacia arriba o hacia abajo con un valor P inferior a 0,05 según lo determinado por el mapa de calor se pueden trazar para distinguir los genes significativos entre las tumoresferas derivadas de HT29 y las células HT29 parentales. En este experimento representativo, el análisis de los genes regulados con un pliegue de log2 superior a un máximo de 10 genes de semillas, que reticulaban las redes genéticas. El análisis del par base de PANTHER indicó que dos genes estaban asociados con la regulación negativa de la apoptosis.Además, los genes seleccionados fueron validados por PCR cuantitativo confirmando su mayor expresión en tumoresferas derivadas de HT29. La selección diferencial del gen es el paso más importante de los procedimientos. Recuerde utilizar un cambio de pliegue log2 mayor que uno con recuentos mayores que 100 como criterios.Usando este protocolo, los genes seleccionados de las tumoresferas de origen colorrectal pueden ser derribados o sobreexpresados para descubrir sus funciones potenciales en la formación de tumoresferas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Un modelo de ratón de ingeniería genética de cáncer colorrectal esporádico

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Buscando vías de controlador de adquirir resistencia a la terapia dirigida: sensibilidad restaurar por Gene Knock-down y generación Subclone resistente a los medicamentos

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Aislamiento de células endoteliales humanas de Colon Normal y el Carcinoma colorrectal - un protocolo mejorado

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Detección de un Panel personalizado de microARN circulantes en pacientes con cáncer colorrectal metastásico

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Evaluación del riesgo y la prevalencia del cáncer colorrectal mediante la detección de la integridad del ADN de las heces

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Aislamiento de células similares a tallos de cultivos esferoides tridimensionales

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluación de la muerte celular utilizando sobrenadante libre de células de probióticos en cultivos esferoides tridimensionales de células de cáncer colorrectal

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-cultivo De Glioblastoma Células Madre-como En Las Neuronas Modeladas Para Estudiar La Migración Y Las Interacciones Celulares

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...