该协议旨在简化早期胚胎低输入、小型RNA测序库的制备，以准确描述调节胚胎发育的微RNA。此技术的优点是，它避免了低输入样本的池化，并且可以很容易地应用于非排序单元格和排序单元格。我们还演示了仔细的胚胎分期，以避免复制之间的变异。
此方法可应用于时间、遗传和发育研究或其他输入RNA浓度低的应用。将来，这种方法可能用于诊断微RNA不管制的发育障碍。这个协议在技术上最具挑战性的部分是胚胎解剖。
因为每个胚胎必须被解剖，阶段，图像，然后迅速分离，以确保细胞的生存能力。要解剖胚胎，用PBS冲洗怀孕雌性小鼠的子宫，并放在无菌塑料10厘米的培养皿中。使用微切除剪刀分离含有的德奎亚区域，并剥离子宫肌肉，以暴露所有十分多。
要解剖胚胎，用PBS冲洗怀孕雌性小鼠的子宫，并放在无菌塑料10厘米的培养皿中。使用微切除剪刀分离含有区域的脱膜。将所有胚胎放入一个新的培养皿中，用干净的PBS，并拍摄整个垃圾的图像。
然后分别对每个胚胎进行成像，并计算卵石的数量，在实验之间保持放大和曝光恒定。对于年龄超过 E8.0 的胚胎，斩首在 oticplacode 的上方，然后将头部转移到 48 井板的干净井中。将250微升的木瓜添加到井中，轻轻上下移液器。
使用显微镜检查团块，并继续上下移液，直到实现单个细胞悬浮。然后向电池中加入 250 微升 FBS，并通过 35 微米尼龙网过滤器过滤 500 微升悬浮液。将滤热剂移动到新的 1.5 毫升管中，以 200 x g 向下旋转 5 分钟。
将上一液转移到新管中，用 BSA 将 300 微升 PBS 中的细胞颗粒重新暂停。当准备通过滤波管再次对细胞进行分拣过滤，并添加DAPI来染色活细胞时。使用带 70 微米喷嘴的细胞分拣器将每个样品分拣成 500 微升的 RNA 提取解解溶液，然后在负 80 摄氏度下混合和储存样品。
在每个样品中加入五升 6 倍装载染料的微升，然后通过移液混合。将样品装载到 6%TBE 聚丙烯酰胺凝胶上，从第一个井中的后者开始，并在每个样品之间留下一条通道。在 0.5X TBE 运行缓冲器中以 150 伏运行凝胶 30 到 40 分钟。
凝胶运行完成后，小心地将其从玻璃板中取出，并将其从原始包装中放在托盘中，注意方向。拆下运行缓冲液并弄脏凝胶 15 分钟。然后在 UV 透光器上成像它。
识别 150 个碱基对的带子，并使用干净的剃须刀刀片进行切除。确保避免适配器在 130 个基对下调暗产品。将凝胶片放入微离心管中，以最大速度旋转 30 秒。
接下来，使用 P200 尖端将凝胶片粉碎成尽可能小的位，然后将尖端喷射到管中。在每个管中加入300微升洗涤缓冲液，从侧面清洗凝胶位。重新连接移液器尖端并洗掉，然后将其从管子上拆下。
在25摄氏度下孵育样品，并摇动1000 RPM。第二天，以最高速度旋转它们 10 分钟，然后将上看液转移到无 RNase 的 96 井板。在每个样品和移液器中加入50微升的清洁珠子进行混合。
然后加入350微升异丙醇，混合样品，在室温下孵育板10分钟，同时摇动。孵育后，拉旋转板并磁化两分钟。丢弃上一杯，用 950 微升 80%乙醇洗涤珠子 30 秒。
干燥样品三分钟，然后清除井底的所有残留液体。从磁性支架上拆下板。将珠子重新在13微升的再增缓冲液中。
孵育板两分钟，然后将其转移回磁性支架三分钟。将12微升的上清液转移到一个干净的管中，并在4摄氏度或长期储存在负20摄氏度下过夜。E7.5、E8.5和E9.5的胚胎被收获。
和索米特上演，以解决六小时的时间间隔。当使用原理分量分析基于相似性对样品进行分组时，发现样本按年龄分组。预生长和迁移神经波峰细胞被标记为E8.5与Wnt1-Cre和E9.5与Sox10-Cre。
两个CRE驱动程序的比较证实，他们标记在早期小鼠胚胎的不同种群。RNA用分光光度计和毛细管电泳进行量化。虽然分光光度计微量显示RNA不含污染蛋白和高细胞浓度，但它不够敏感，无法检测RNA浓度随年龄的变化。
毛细管电泳微量可用于估计RNA片段的浓度和大小。2000和5，100核苷酸的峰值分别是18S和28S核糖体RNA。而小RNA区域位于约150核苷酸。
凝胶提取可用于将小型RNA测序库与适配器底片分离开。切除前，每个样品中都有多种产品尺寸。毛细管电泳在尺寸选择之前和之后的痕迹表明，凝胶纯化后150基对库产品的纯度有所改善。
我们设计了此协议，将RNA制备从单个样品拆分为小型RNA测序库和散装mRNA测序库。这将不仅解决有关微RNA表达的问题，而且哪些mRNA靶点可能由表达的微RNA调节。这项技术使我们能够获得对表达最高的微RNA的全面视图，并在胃化和神经管闭合之间调节其颅神经波峰细胞的目标。
