Detta protokoll syftar till att förenkla utarbetandet av låg input, små RNA sekvensering bibliotek från tidiga embryon att noggrant profilera microRNAs som reglerar embryonal utveckling. Fördelen med denna teknik är att den undviker poolning av låginmatade prover och lätt kan tillämpas på både icke-sorterade och sorterade celler. Vi visar också noggrann embryo mellanstationer för att undvika varianter mellan replikat.
Denna metod kan tillämpas på tidsmässiga, genetiska och utvecklingsmässiga studier eller andra tillämpningar där ingående RNA-koncentrationer är låga. I framtiden skulle denna metod potentiellt kunna användas för att diagnostisera utvecklingsstörningar där mikroRNA är dysregulated. Den mest tekniskt utmanande delen av detta protokoll är embryot dissekering.
Eftersom varje embryo måste dissekeras, stadium, bild, och sedan dissocieras snabbt för att säkerställa cellens livskraft. För att dissekera embryona, skölj livmodern hos en gravid kvinnlig mus med PBS och placera den i en steril plast 10 centimeter maträtt. Använd microdissection sax för att separera decidua som innehåller region och skala av livmoderns muskel för att exponera alla decidua.
För att dissekera embryona, skölj livmodern hos en gravid kvinnlig mus med PBS och placera den i en steril plast 10 centimeter maträtt. Använd mikrodissektion sax för att separera den decidua som innehåller region. Flytta alla embryon i en ny maträtt med ren PBS och ta en bild av hela kullen.
Sedan bild varje embryo individuellt, och räkna antalet somiter, hålla förstoring och exponering konstant mellan experiment. För embryon äldre än E8.0, halshugga strax ovanför otic placode och överföra huvudet till en ren brunn av en 48-brunnsplatta. Tillsätt 250 mikroliter papain till brunnen och pipetten upp och ner försiktigt.
Använd mikroskopet för att kontrollera om det finns klumpar och fortsätt pipettering upp och ner tills en enda cell suspension uppnås. Tillsätt sedan 250 mikroliter FBS till cellerna och filtrera 500 mikroliter av suspensionen genom ett 35 mikrometer nylonnätfilter. Flytta filtratet till ett nytt 1,5 milliliterrör och snurra ner det i 200 x g i fem minuter.
Överför supernatanten till ett nytt rör, och resuspend cellpelletsen i 300 mikroliter av PBS med BSA. När redo att sortera filtrera cellerna igen genom ett filter lock röret och lägga TILL DAPI att fläcka levande celler. Använd en cellsorterare med ett 70-mikrometermunstycke för att sortera varje prov i 500 mikroliter av RNA extraktionslyslösning, blanda och förvara sedan provet vid negativa 80 grader Celsius.
Tillsätt fem mikroliter av 6X lastning färgämne till varje prov och blanda genom pipettering. Ladda proverna på en 6%TBE polyakrylamid gel som börjar med den senare i den första brunnen och lämnar ett körfält mellan varje prov. Kör gelen på 150 volt i 30 till 40 minuter i 0,5 X TBE-körbuffert.
När gelen har kört klart ska du försiktigt ta bort den från glasplattorna och placera den i facket från originalförpackningen, och där man kan lägga till med orienteringen. Ta bort löpbufferten och färga gelen i 15 minuter. Och sedan bild det på en UV-trans illuminator.
Identifiera bandet på 150 baspar och använd ett rent rakblad för att punktskattebelägga det. Se till att undvika adaptern dimer produkt vid 130 baspar. Sätt gelskivorna i mikrocentrifugrör och snurra ner dem med maximal hastighet i 30 sekunder.
Använd därefter en P200-spets för att krossa gelskivan i minsta möjliga bitar och mata ut spetsen i röret. Tillsätt 300 mikroliter elueringsbuffert till varje rör, tvätta gelbits från sidan. Sätt fast pipettspetsen igen och tvätta av den innan du tar ut den ur röret.
Inkubera proverna över natten vid 25 grader Celsius med 1, 000 RPM skakningar. Nästa dag snurrar du ner dem med maximal hastighet i 10 minuter och överför supernatanten till en RNase-fri 96-brunnsplatta. Tillsätt 50 mikroliter av sanering pärlor till varje prov och pipett att blanda.
Tillsätt sedan 350 mikroliter isopropanol, blanda provet och inkubera plattan i rumstemperatur i 10 minuter medan du gungar. Efter inkubationen drar du snurra plattan och magnetiserar den i två minuter. Kassera supernatanten och tvätta pärlorna med 950 mikroliter på 80%etanol i 30 sekunder.
Torka provet i tre minuter, ta sedan bort all kvarvarande vätska i botten av brunnen. Ta bort plattan från magnetstativ. Och resuspend pärlorna i 13 mikroliter av resuspension buffert.
Inkubera plattan i två minuter, överför den sedan tillbaka till magnetstället i tre minuter. Överför 12 mikroliter av supernatanten till ett rent rör och förvara den över natten vid fyra grader Celsius eller långsiktigt vid negativa 20 grader Celsius. Embryon vid E7.5, E8.5, och E9.5 skördades.
Och somite iscensatt för att lösa de sex timmars tidsintervall. När principkomponentanalys användes för att gruppera prover baserat på likhet, konstaterades att prover kluster efter ålder. Premigratory och flyttande neurala crest celler var märkt att E8.5 med Wnt1-Cre och en E9.5 med Sox10-Cre.
En jämförelse av de två CRE-förarna bekräftar att de markerar olika populationer i tidiga musembryon. RNA kvantifierades med en spektrofotometer och kapillärelektrofores. Medan spektrofotometer spår visade att RNA innehåller inga förorenande proteiner och en hög cellkoncentration, det var inte tillräckligt känslig för att upptäcka förändringar i RNA koncentration med åldern.
Kapillärelektroforesspåret kan användas för att uppskatta koncentrationen och storleken på RNA-fragmenten. Toppar på 2, 000 och 5, 100 nukleotider är 18S och 28S ribosomal RNA, respektive. Medan den lilla RNA-regionen ligger på cirka 150 nukleotider.
Gelutsug kan användas för att isolera de små RNA-sekvenseringsbiblioteken bort från adapterprimrarna. Före excision finns en mängd produktstorlekar i varje prov. Kapillärelektroforesspår före och efter storleksval visar förbättringen av renheten hos 150 basparbiblioteksprodukten efter gelrening.
Vi har utformat detta protokoll för att dela upp en RNA prep från ett enda prov i både små RNA sekvensering bibliotek och bulk mRNA sekvensering bibliotek. Detta kommer att behandla frågor kring inte bara mikroRNA uttryck, men också vilka mRNA-mål kan regleras av de uttryckta microRNAs. Denna teknik gjorde det möjligt för oss att få en omfattande bild av de mest uttrycks microRNAs och regleringen av sina mål i kraniala neurala crest celler mellan gastrulation och neuralrör stängning.
