우리의 프로토콜은 척추 림프관과 배수 림프절의 입체적이고 대규모보기를 제공하여 림프 배수 및 면역 세포의 림프 트래픽 연구를 용이하게합니다. iDISCO+클리어링 프로토콜은 척수, 수막, 경막외 공간 및 배수 림프절을 포함하여 척추 컬럼의 신경, 혈관 및 면역 세포의 국소화를 허용하여 조직의 무결성을 보존합니다. 마취 된 8 ~ 12 주 된 마우스에서 페달 반사에 대한 응답의 부족을 확인 한 후, 스테레오 탁스 프레임에 마우스를 배치합니다.
그리고 메스를 사용하여 계획된 주입에 적합한 부위에 피부 절개를 합니다. 척추 어댑터를 사용하여 Th12-L1 척추 수준에서 척수를 고정하고 목과 컬럼을 덮는 기생충 또는 기생충 근육을 무딘 해부하여 두라 마터의 표면을 시각화합니다. 그런 다음 26 게이지 바늘을 사용하여 두라 마터의 중앙 영역과 언더 누워 거미를 조심스럽게 구두점합니다.
다음으로, 유리 모세관 끝에서 2 밀리미터를 자르고 10 마이크로 리터 주사기에 연결된 캐뉼라에 모세관을 연결합니다. 마이크로 모세관을 2~8개의 마이크로리터로 적재합니다. 그리고 계획된 주입에 적합한 각도로 듀라 마터의 내측 부위에 마이크로 모세관을 도입한다.
듀라 마터 아래 1.5 밀리미터 의 모세관을 밀어 수술 접착제 의 10 마이크로 리터와 모세관 주위 절개를 닫습니다. 접착제가 건조되면 분당 1 마이크로리터의 속도로 형광 추적기를 천천히 주입하십시오. 전체 부피가 전달되면 미세 모세관을 철회하기 전에 모세관을 1 분 동안 제자리에 둡니다.
그리고 추가 접착제로 사출 구멍을 닫습니다. 주사 후 적절한 시점에서 해부 가위를 사용하여 하복부에서 흉부 케이지로 피부와 복막 절개를 합니다. 흉부 케이지를 열어 심장에 접근하고 26 게이지 바늘을 심장의 왼쪽 심실로 삽입합니다.
PBS에서 20 밀리리터의 얼음 차가운 4 % 파라 포름알데히드를 분당 2 밀리리터의 비율로 퍼퓨즈합니다. 그리고 가위를 사용하여 관류 유체 스트림을 방출하는 올바른 아트리움을 신속하게 절단합니다. 집게를 사용하여 피부를 완전히 제거하고 가위로 팔다리를 제거하십시오.
림프절을 그대로 두고 갈비뼈를 자르는 주의를 기울여 내부 장기를 모두 제거하십시오. PBS의 얼음 차가운 4% 파라포름알데히드에 40밀리리터 튜브를 4도에서 하룻밤 동안 담그고, 신선한 PBS50 밀리리터에서 3회, 세척당 5분간 고정된 조직을 세 번 세척합니다. iDISCO+전체 마운트 샘플의 라벨링을 먼저 위해 PBS의 메탄올 농도상승에 연속적인 몰입으로 조직을 실온에서 교반하여 침수당 1시간 동안 탈수합니다.
마지막 침수 후 33%의 메탄올에 샘플을 배양한 후, 66%의 디클로로메탄 용액을 하룻밤 동안 교반으로 배양합니다. 다음날 아침, 실온에서 세척당 1시간 동안 100%의 메탄올로 샘플을 두 번 세척합니다. 그 다음으로 4도에서 메탄올에서 과산화수소 5%의 하룻밤 배양이 이어졌습니다.
다음날 아침 PBS에서 메탄올 농도가 순차적으로 침전되어 실온에서 동요하여 농도당 1시간 동안 시료를 순차적으로 재수화합니다. 척추를 탈칼로피하려면 실온에서 30 분 동안 모스의 용액의 샘플을 배양하십시오. PBS에서 두 개의 헹구기와 2 개의 1 시간 인큐베이션이 PBS에서 0.2 % Triton X-100으로, 실온에서 동요합니다.
두 번째 Triton X-100 배양 후, 섭씨 37도에서 24 시간 동안 투과화 용액으로 샘플을 처리하십시오. 그 다음에 는 섭씨 37도에서 블로킹 용액에 24시간 인큐베이션이 있습니다. 차단용의 끝에서 배양 라벨은 1차 항체를 가진 시료를, PBS에서 0.2%Tween-20 및 0.1%헤파린으로 희석하여 6일 동안 섭씨 37도에서 5%디메틸 설프리산화물 및 3%당나귀 혈청 용액으로 보충하였다.
인큐베이션이 끝나면, 4~5개의 하룻밤 잠복기로 시료를 신선 2%Tween-20, 0.1%헤파린으로 씻어 내며 실온에서 세척당 PBS에서 0.1%의 헤파린을 교반한다. 그런 다음 원고 방향에 따라 이차 항체로 샘플을 배양합니다. 마지막 세척 후 농도 당 1 시간 동안 PBS에서 메탄올의 상승 농도에 연속 몰입과 탈수 샘플.
그 다음으로 33%의 메탄올 66%의 디클로로메탄 용액으로 하룻밤 잠복이 뒤따랐다. 다음 아침, 두 개의 15 분 디클로로 메탄 세척으로 샘플을 씻어. 그리고 4 시간 동안 흔들리지 않고 디벤질 에테르로 샘플을 치웁울 수 있습니다.
광시트 형광 현미경 이미징의 경우 4배, 0.3 목표 하에서 현미경 단계에서 지워진 샘플을 현미경 단계에서 지워진 평면에 배치한다. 그리고 동적 초점 없이 고정된 X 위치로 단일 면 3시트 제거 구성을 선택합니다. 561 나노미터및 100 밀리와트 및 639 나노미터 및 70 밀리와트로 조정된 LED 레이저를 사용합니다.
그리고 라이트 시트 수치 조리개를 0.03으로 설정합니다. 적절한 방출 필터를 설정하고 dibenzyl 에테르로 현미경 챔버를 채웁니다. 다음으로 카메라를 사용하여 2.5 마이크로미터 Z 스택과 2개의 X 광학 줌 및 픽셀당 0.8 마이크로미터를 사용하여 단계당 30밀리초 노출 시간을 가진 스택을 획득합니다.
그리고 전체 프레임에 10 %의 중복으로 모자이크 인수를 수행합니다. TIF 형식으로 이미지를 획득하고 적절한 전체 변환 소프트웨어 프로그램을 통해 3D 형식으로 변환합니다. Stitcher 소프트웨어로 모자이크 인수를 재구성하려면 이미지를 열고 이미지 간에 10%가 겹치는 것을 사용하여 전체 모자이크 그림을 재구성하기 위해 이미지를 수동으로 정렬합니다.
그런 다음 3D 소프트웨어를 사용하여 데이터의 직교 투영을 생성합니다. 림프용기와 디스플레이에 있는 다른 해부학 적 구조물에 색 코드 특성을 추가합니다. 및 광시트 형광 현미경검사법으로부터 얻어진 원시 데이터에 1.47의 감마 보정을 설정한다.
제조업체의 지침에 따라. iDISCO+와 라이트 시트 형광 현미경 검사법의 조합은 척추 해부학을 보존하고 주변 뼈, 인대, 근육 및 신경 신경질 내에서 림프 혈관을 포착 할 수 있습니다. 작은 적색 형광 추적기를 뇌척수액, 시스테나 마그나 또는 척수의 흉부 근육부 부위로 주입하면 주입 후 45분 후 깊은 자궁 경부 림프절 내에서 추적자가 축적되어 림프계에 의한 추적자의 섭취및 배수를 나타냅니다.
흉부 척추 겨자내 트레이서 주사는 척수 조직 과 깊은 자궁 경부 배수 림프절 내에서 추적자 축적을 초래하지만, 항 LYVE-1 항체로 표시된 자궁 경부 및 흉부 림프 혈관분과는 그렇지 않습니다. 투라콜룸바 척추 부렌치마에 대한 안티 LYVE 주사는 척추 림프와 그들의 여분의 척추 림프 연결 둘 다의 라벨을 초래합니다. 척추 림프관 및 림프 배수로 인해 트레이서 섭취를 입증하여 초척추 림프 시스템을 향한 것입니다.
CSF 순환을 방해하지 않도록 추적 주입을 매우 신중하게 수행하십시오. iDISCO +프로토콜은 매우 불쾌하지만 샘플의 크기에 적응해야합니다. 중추 신경계 면역 염색 또는 라이브 이미징 실험에 미량 주입 후 AUS-수행될 수 있다.
iDISCO+프로토콜은 다른 세포, 인구 및 조직을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
