Tredimensionell avbildning av vertebral lymfatiska Vasculature och dränering med hjälp av iDISCO⁺ och Ljus sheet fluorescensmikroskopi

Vårt protokoll ger tredimensionella och storskaliga vyer av vertebral lymfkärl och deras dränerande lymfkörtlar, underlätta studiet av lymfatiska dränering och lymfatiska trafiken av immunceller. iDISCO+clearing-protokollet bevarar vävnadsintegriteten, vilket möjliggör lokalisering av de neurala, vaskulära och immuncellerna i kotpelaren, inklusive ryggmärgen, hjärnhinnorna, epiduralutrymmet och dränerande lymfkörtlar. Efter att ha bekräftat en brist på svar på pedalreflex i en sövd 8 till 12 veckor gammal mus, placera musen i en stereotaxisk ram.

Och använd en skalpell för att göra ett hudanser i lämplig region för den planerade injektionen. Använd en spinal adapter för att immobilisera ryggmärgen på Th12-L1 kotnivå och trubbig dissekera paracerviska eller paraspinal muskler som täcker halsen och kolumnen för att visualisera ytan av dura mater. Använd sedan en 26 gauge nål för att noggrant punktera det centrala området av dura mater och under-laying arachnoid.

Därefter skär två millimeter från en glas kapillär spets och anslut kapillären till en kanyl kopplad till en 10 microliter spruta. Ladda mikro kapillären med två till åtta mikroliter av den fluorescerande spårämne val. Och införa en mikro kapillär i den mediala regionen i dura mater i lämplig vinkel för den planerade injektionen.

Trycka kapillären 1,5 millimeter under dura mater, stäng snittet runt kapillären med 10 mikroliter av kirurgiskt lim. När limmet har torkat injektion långsamt lysrör med en hastighet av en mikroliter per minut. När hela volymen har levererats lämna kapillären på plats i en minut innan du drar tillbaka mikro-kapillären.

Och stäng injektionshålet med ytterligare lim. Vid lämplig tidpunkt punkt efter injektionen använda dissekering sax för att göra hud och peritoneal snitt från nedre delen av buken till bröstkorgen bur. Öppna bröstkorgen för att komma åt hjärtat och sätt in en 26 gauge nål i den vänstra hjärtkammaren.

Genomsyra med 20 milliliter iskall 4%paraformaldehyd i PBS, med en hastighet av två milliliter per minut. Och använd sax för att snabbt skära rätt atrium släppa perfusionsvätskan ström. Använd forceps för att helt ta bort huden och ta bort armar och ben med sax.

Ta bort alla de inre organen, var noga med att lämna lymfkörtlarna intakta och skär revbenen. Sänk ned de dissekerade vävnaderna i iskall 4%paraformaldehyd i PBS i enskilda 50 milliliterrör över natten vid fyra grader Celsius, innan du tvättar de fasta vävnaderna tre gånger i 50 milliliter färsk PBS, i fem minuter per tvätt. För iDISCO+märkning av helfästeprover först, dehydrera vävnaderna med på varandra följande nedsänkningar i stigande koncentrationer av metanol i PBS under en timme per nedsänkning med agitation vid rumstemperatur.

Efter den sista nedsänkningen inkubera proverna i en 33%metanol, 66%diklormetanlösning över natten med agitation. Nästa morgon, tvätta proverna två gånger med 100%metanol i en timme per tvätt i rumstemperatur. Följt av en övernattning inkubation i 5%väteperoxid i metanol vid fyra grader Celsius.

Nästa morgon rehydrera proverna gradvis i sekventiella nedsänkningar i fallande koncentrationer av metanol i PBS under en timme per koncentration med agitation vid rumstemperatur. För att dekalcify kotorna inkubera proverna i Morses lösning i 30 minuter vid rumstemperatur. Följt av två sköljningar i PBS och två, en timmes inkubationer, i 0,2%Triton X-100 i PBS, med agitation vid rumstemperatur.

Efter den andra Inkuberingen av Triton X-100, behandla proverna med permeabiliseringslösning i 24 timmar vid 37 grader Celsius. Följt av en 24 timmars inkubation i blockerande lösning vid 37 grader Celsius. I slutet av den blockerande lösningen inkubation etikett proverna med primära antikroppar, utspädd i en 0,2%Tween-20 och 0,1%heparin i PBS kompletteras med 5%dimetylsulfoxid och 3%åsneserum lösning vid 37 grader Celsius i sex dagar.

Vid inkuberingens tvättar du proverna med fyra till fem inkubationer över natten i färska 2%Tween-20 och 0,1%heparin i PBS per tvätt i rumstemperatur med agitation. Inkubera sedan proverna med sekundära antikroppar enligt manuskriptriktningar. Efter den sista tvätten dehydrate prover med successiva nedsänkningar i stigande koncentrationer av metanol i PBS under en timme per koncentration.

Följt av en inkubation över natten i 33%metanol 66%diklormetanlösning. Nästa morgon, tvätta proverna med två 15-minuters diklormetan tvättar. Och rensa proverna i dibenzyleter utan att skaka i fyra timmar.

För ljusplåtsfluorescensmikroskopi imaging placera de rensade proverna i ett tvärgående plan i mikroskopet skede under en 4X, 0,3 mål. Och välj en enda sidig tre ark eliminering konfiguration med en fast X-position utan dynamisk fokusering. Använd LED-lasrar inställda på 561 nanometer och 100 milliwatt och 639 nanometer och 70 milliwatt.

Och ställ in den numeriska ljusarköppningen till 0,03. Ställ in lämpliga utsläppsfilter och fyll mikroskopkammaren med dibenzyleter. Därefter använder kameran för att förvärva stackar med 2,5 mikrometer Z stackar och en 30 millisekunder exponeringstid per steg med hjälp av de två X optisk zoom och 0,8 mikrometer per pixel.

Och utföra mosaik förvärv med en 10%överlappning på hela ramen. Skaffa bilder i TIF-format och omvandla dem till 3D-format med en lämplig fullständig konvertering program. Att rekonstruera mosaik förvärv med Stitcher programvara öppna bilderna och manuellt ordna bilderna för att rekonstruera hela mosaik bilden, med hjälp av 10%överlappning mellan bilderna som en guide.

Använd sedan 3D-programvara för att generera ortogonala prognoser av data. Lägga till en färg-kod attribut till lymfkärlen och de andra anatomiska strukturer på displayen. Och ställ in en gammakorrigering på 1,47 till de rådata som erhålls från ljusbladet fluorescensmikroskopi.

enligt tillverkarens anvisningar. Kombinationen av iDISCO+med ljusplåtsfluorescensmikroskopi bevarar vertebratanatomi och möjliggör infångande av den lymfatiska vasculaturen inom omgivande ben, ligament, muskler och nerv ganglier. Injektionen av en liten röd fluorescerande spårämne i antingen cerebral spinal vätska, cisterna magna eller regionen thoracolumbar av ryggmärgen resulterar i spårämne ackumulering inom den djupa livmoderhalscancer lymfkörtlar 45 minuter efter injektion, som anger upptag och dränering av spårämne av lymfsystemet.

Tracer injektion i bröstkorgen spinal parenkym resulterar i spårämne ackumulering inom ryggmärgen vävnader och djupa massundersökning dränera lymfkörtlar, men inte i livmoderhalscancer och bröst lymfatisk vasculature märkt med anti-LYVE-1 antikroppar. Anti-LYVE injektion i thoracolumbar spinal parenkym resulterar i märkning av både vertebral lymphatics och deras extra-vertebral lymfatiska anslutningar. Som underbygger spårämnet upptag av vertebral lymfkärl och lymfdränage mot extra-vertebral lymfsystemet.

Utför spårinjektionen mycket noggrant för att inte störa den CSF-cirkulationen. Den iDISCO +-protokollet är mycket officious men du måste anpassa sig till storleken på dina prover. Efter spår injektion i centrala nervsystemet immunfärgning eller levande bildframställning experiment kan AUS-utföras.

IDISCO+-protokollet kan användas för att studera olika celler, populationer och vävnader.