Name: separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method
Uploaded: 2020-06-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method at JoVE.com

ونحن ممتنون لمصادر التمويل من شعبة علم الأحياء ومركز جونسون لأبحاث السرطان لجوائز BRIEF و IRA ، على التوالي إلى GV. كما نشكر جائزة K-INBRE ما بعد الدكتوراه إلى RV. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل جائزة التنمية المؤسسية (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم منحة P20 GM103418. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة أو المعاهد الوطنية للصحة. نشكر المراجعين المجهولين على تعليقاتهم المفيدة.

1. الإعداد والطور المسبق لوحدة IEF القياسية السائلة المرحلة
<ol><li>تجميع الأقطاب الكهربائية IEF السائل المرحلة (زر الأنود الأحمر وزر الكاثود الأسود) مع أغشية التبادل الخاصة بها وفقا لدليل التعليمات (انظر جدول المواد). اكويت أغشية تبادل أنيون مع 0.1 M NaOH وأغشية تبادل الموجبة مع 0.1 M H3</sub...

<ol>
	<li>Jankowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedure+of+extraction,+purification+and+proteomic+analysis+of+nuclear+proteins+from+mouse+brain.">Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).</li><li>Pergande, M. R., Cologna, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+Point+Separations+of+Peptides+and+Proteins.">Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins.</a> Proteomes. 5 (1), (2017).</li><li>Stoyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IEF-based+multidimensional+applications+in+proteomics:+toward+higher+resolution.">IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution.</a> Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).</li><li>Vesterberg, O. A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method of Isoelectric Fractionation. , (1964).</li><li>Vesterberg, O., Svensson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+fractionation,+analysis,+and+characterization+of+ampholytes+in+natural+pH+gradients.+IV.+Further+studies+on+the+resolving+power+in+connection+with+separation+of+myoglobins.">Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins.</a> Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).</li><li>Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , 1 (1983).</li><li>Vesterberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Isoelectric+Fractionation+of+Carrier+Ampholytes.">Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes.</a> Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).</li><li>Bier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+isoelectric+focusing+and+isotachophoresis.">Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis.</a> Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).</li><li>Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis:+mathematical+modeling+and+computer+simulation.">Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation.</a> Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).</li><li>Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Rotofor+preparative+isoelectrofocusing+cell+in+protein+purification+procedure.">Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).</li><li>Wagner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+dipeptidyl+peptidase+IV+(DP+4)+isoforms+from+porcine+kidney+by+preparative+isoelectric+focusing+to+improve+crystallization.">Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization.</a> Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).</li><li>Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Monoclonal+Antibody+Charge+Variants+by+Free+Flow+Isoelectric+Focusing.">Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing.</a> Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).</li><li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+T-cell+antigen+identification+using+humanized+HLA-DR4+transgenic+mice.">Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice.</a> Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).</li><li>Riyong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+charge+antigens+of+Dirofilaria+immitis+adult+worm+for+IgG-ELISA+diagnosis+of+bancroftian+filariasis.">Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis.</a> Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).</li><li>Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+proteins+of+Candida+albicans:+preparation+of+extracts+and+improved+detection+of+proteins.">Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins.</a> Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).</li><li>Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+acids+inhibit+hyphal+growth+and+virulence+in+Candida+albicans.">Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans.</a> PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+ampholytes+used+for+isoelectric+focusing+may+interfere+with+bioactivity+based+purification+of+antimicrobial+peptides.">Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).</li><li>Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-Acid-Sequence+of+Sweet-Taste-Suppressing+Peptide+(Gurmarin)+from+the+Leaves+of+Gymnema-Sylvestre.">Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre.</a> Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).</li><li>Craik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry.+Seamless+proteins+tie+up+their+loose+ends.">Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends.</a> Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).</li><li>Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cyclotides:+A+unique+family+of+cyclic+and+knotted+proteins+that+defines+the+cyclic+cystine+knot+structural+motif.">Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif.</a> Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).</li><li>Stoecklin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+physiological+properties+of+gymnemic+acid,+the+antisaccharine+principle+of+the+leaves+of+Gymnema+sylvestre.">Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).</li><li>Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+elucidation+of+gymnemic+acids,+antisweet+principles+of+Gymnema+sylvestre.">Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre.</a> Chemical &amp; Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).</li><li>Veerapandian, R., Vediyappan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+Acids+Inhibit+Adhesive+Nanofibrillar+Mediated+Streptococcus+gordonii-Candida+albicans+Mono-Species+and+Dual-Species+Biofilms.">Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).</li><li>Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+cell+wall+proteins.">Candida albicans cell wall proteins.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).</li></ol>

وتشمل الجزيئات الصغيرة من مصادر المنتجات الطبيعية (مثل النباتات) نواتج مستقلبات ثانوية معقدة شديدة التنوع في التركيب الكيميائي. ويعتقد أنها تشارك في آليات الدفاع النباتية. وبالإضافة إلى ذلك، توجد أيضا في الأنسجة النباتية polypeptides22. هذه الجزيئات الصغيرة المنتج الطبيعي هي مصاد?...

تنقية الجزيئات الحيوية من العينات البيولوجية المعقدة هي خطوة أساسية وصعبة في كثير من الأحيان في التجارب البيولوجية1. تركيز الأزوية (IEF) هو مناسب تماما لفصل عالية الدقة من الجزيئات الحيوية المعقدة حيث يسافر أمبيروليت الناقل وفقا لشحنتها وإنشاء التدرج درجة الH في مجال كهربائي3. تم تطوير أول ناقلة تجارية أمفوليت لـ IEF من قبل أولوف فيستربيرغ في عام 1964 وبراءة اختراع4،5. ampholytes الناقل هي أليفاتية ألتيجو أمينوية oligo-carboxylic حمض جزيئات متفاوتة الطول والمتفرعة6. في وقت لاحق، فيستربرغ وغيرها تحسين أمبيروليت الناقل لاستخدامها الموسع في فصل الجزيئات الحيوية6،7.
وتشمل أساليب فصل الجزيئات الحيوية agarose و polyacrylamide هلام الكهربائي، ثنائي الأبعاد هلام electrophoresis (2-DE)، تركيز isoelectric، الشعيرات الكهربائية، isotachophoresis وغيرها من تقنيات الكروماتوغرافي (على سبيل المثال، TLC، FPLC، HPLC)2. تم اختراع المرحلة السائلة IEF التي أجريت في أداة تسمى "Rotofor" من قبل ميلان بير8. وكان رائدا في مفهوم وتصميم هذه الأداة وساهم على نطاق واسع في نظرية الهجرة الكهربائية. كما طور فريقه نموذج رياضي لعملية الفصل الكهربائي للمحاكاة الحاسوبية9.
جهاز IEF في المرحلة السائلة هو خلية أسطوانية دوارة أفقيًا تتكون من نواة نايلون مقسمة إلى 20 مقصورة مسامية وقضيب سيراميك تبريد مياه متداول. تسمح الغرف المسامية للجزيئات بالهجرة عبر المرحلة مائي بين الأقطاب الكهربائية وتسمح بجمع العينات النقية تحت فراغ في الكسور. يمكن أن يوفر نظام التنقية هذا ما يصل إلى 1000 ضعف تنقية جزيء معين في < 4 ساعات. ومن السمات القيمة لهذا الصك هو أنه يمكن تطبيقه كخطوة أولى لتنقية من خليط معقد أو كخطوة نهائية لتحقيقنقاء 10. إذا كان جزيء الفائدة هو بروتين ، فإن ميزة أخرى هي أنه سيتم الحفاظ على تركيبها الأصلي أثناء الفصل.
وقد تم الإبلاغ عن استخدام السائل المرحلة IEF على نطاق واسع للبروتينات والإنزيمات وتنقية الأجسام المضادة6,10,11,12,13,14. هنا وصفنا استخدام هذا النهج لفصل وتنقية الجزيئات الصغيرة والببتيدات من النبات الطبي Gymnema sylvestre. سيساعد هذا البروتوكول الباحثين على تركيز وتنقية الجزيئات الصغيرة النشطة من مستخلص نباتي لتطبيقات المصب بتكلفة منخفضة. بالإضافة إلى ذلك، نبرهن أيضًا على أن إثراء البروتينات من مستخلص بروتين معقد من فطر المبيضات ألبيكان 15 في هذا النظام القائم على IEF كمثال ثان.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisher scientfic</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207861-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 3/10 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 5/8 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact low temperature thermostat</td>
			<td>Lauda -Brinkmann</td>
			<td>RM 6T</td>
			<td>Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (3,500 MWCO)</td>
			<td>Spectrum Spectra/Por</td>
			<td>132112T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gymnema plant leaf extract powder (&#62;25% Gymnemic acids)</td>
			<td>Suan Farma, NJ USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Lab companion</td>
			<td>SI 300R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM 6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean electrophoresis</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S20</td>
			<td>Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotofor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2972</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>DH30255.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2960</td>
			<td>Scotch tape may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall legend micro 17 centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>75002432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP tissue culture plate -96 well flat bottom</td>
			<td>TPP</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method

المنتجات الطبيعية المشتقة من النباتات والميكروبات هي مصدر غني للجزيئات النشطة بيولوجيا. قبل استخدامها، يجب تنقية الجزيئات النشطة من مستخلصات معقدة لتطبيقات المصب. هناك طرق كروماتوغرافية مختلفة متاحة لهذا الغرض حتى الآن لا يمكن لجميع المختبرات تحمل أساليب عالية الأداء والعزلة عن العينات البيولوجية المعقدة يمكن أن يكون من الصعب. هنا نثبت أن التركيز الايزويتريك للمرحلة السائلة (IEF) يمكن أن يفصل الجزيئات، بما في ذلك الجزيئات الصغيرة والببتيدات من مستخلصات نباتية معقدة، بناء على نقاطها الأيزوفلوريتية (pI). وقد استخدمنا هذه الطريقة في تجزئة العينات البيولوجية المعقدة وتوصيفها. كدليل على المفهوم، ونحن مجزأة استخراج مصنع Sylvestre Gymnema، وعزل عائلة من الجزيئات الصغيرة السابونين تيربينويد والببتيد. كما أظهرنا فصل البروتين الميكروبي الفعال باستخدام فطر المبيضات ألبيكان كنظام نموذجي.

فصل وتنقية الجزيئات الصغيرة والببتيدات من استخراج مصنع سيمانيما باستخدام طريقة IEF المرحلة السائلة المحض، نحن كسور مستخلصات النباتات الطبية والبروتينات سطح الخلايا من الفطريات المسببة للأمراض البشرية، C. albicans. يتم عرض مخطط من بروتوكولات الكسر هذه في الشكل ...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method at JoVE.com

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method

والهدف هو تجزئة وعزل الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا، والببتيدات من مستخلصات نباتية معقدة، والبروتينات من الميكروبات المسببة للأمراض عن طريق استخدام طريقة التركيز الأيزوفلوري (IEF) على مراحل السائل. وعلاوة على ذلك، تم تحديد الجزيئات المنفصلة وأكد نشاطها الحيوي.

فصل الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجياً، الببتيدات من المصادر الطبيعية والبروتينات من الميكروبات بواسطة طريقة التركيز الأيزوئي الإعدادي (IEF)

Natural products derived from plants and microbes are a rich source of bioactive molecules. Prior to their use, the active molecules from complex extracts ...

يصف بروتوكولنا النتائج الجديدة حول فصل وتنقية الجزيئات النشطة من مستخلص نباتي. يمكن للعلماء استخدام هذه الطرق لعزل الجزيئات الصغيرة والببتيدات من مصادر المنتجات الطبيعية للمستخدمين العلاجيين. تعرف على مكونات الجهاز وطرق تجميعها.ومن المهم التأكد من أن العينة التي سيتم فصلها يتم إعدادها من خلال المبادئ التوجيهية المقترحة. يتضمن هذا الأسلوب عمليات تجميع متعددة من الصك. وسوف تساعد العرض التوضيحي المرئي المستخدمين على متابعة وتطبيقها بنجاح على البحث.بعد تجميع المرحلة السائلة، وحدة IEF كما هو موضح في دليل التعليمات، توازن أغشية تبادل أنيون مع 0.1 هيدروكسيد الصوديوم الضرس وأغشية تبادل الأحماض مع 0.1 حمض الفوسفوريك المولر. محاذاة حشيات المطاط بحيث تظل الثقوب الثلاثة مستطيلة كبيرة غير مفككة بالمطاط. وهذا سيساعد على تبادل الأيونات بين القطب وحجرات العينة عبر الغشاء أثناء الكهرباء.تجميع الجزء الداخلي والخارجي من القطب الكهربائي عن طريق محاذاة الثقوب مستطيلة الثلاثة في الحشيات تبادل أيون. ثم تعبئة الأقطاب الكهربائية مع الشوارد الخاصة بهم لمنع الأغشية الخاصة بهم من الجفاف. المقبل، وتشديد حامل المسمار البلاستيك لضمان التجمع خالية من تسرب.تغطية لوحات مجموعة العينة مع شريط الختم. المقبل تجميع أجزاء من غرفة التركيز على إصبع التبريد السيراميك في التسلسل التالي: قطب الأنود، النايلون غشاء الأساسية، غرفة التركيز وكاثود القطب. باستخدام حقنة 50 ملليلتر، املأ غرفة التركيز بالماء المقطر المُبرّر قبل التبريد.بالنسبة لخلية IEF القياسية، أضف 60 ملليلتر من الماء. قم بتوصيل وحدة IEF بماء التبريد في أربع درجات مئوية. تشغيل وحدة في 15 واط و 3000 فولت حتى يستقر الجهد، ما يقرب من ثلاث إلى خمس دقائق.ثم، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة. باستخدام جامع الكسور، وإزالة الماء من الخلية. إعادة ختم لوحات التجميع مع ختم الشريط.إضافة 0.6 غرام من استخراج مصنع Sylvestre Gymnema، إلى 60 ملليلتر من الماء المقطر. حل استخراج النبات عن طريق خلط في أنبوب الأسطوانة لمدة خمس دقائق. لإزالة الجسيمات غير القابلة للذوبان، الطرد المركزي هذا الحل في 10،000 مرة G لمدة خمس دقائق.نقل supernatant إلى كوب زجاجي 150 ملليلتر وإضافة أمفوليت لإنشاء حل 1٪من حيث الحجم، ما يقرب من 0.6 ملليلتر. باستخدام حقنة 50 ملليلتر مع 1.5 بوصة 19 قياس إبرة نهاية حادة، تحميل هذا الحل في خلية IEF من خلال لوحات جمع عينة. ثم قم بإزالة الخلية من الحامل واضغط على غرفة القطب الكهربائي ، لطرد وإزالة أي فقاعات.قم بتوصيل الوحدة بماء التبريد. مع امدادات الطاقة إلى ثابت 15 واط تبدأ تجزئة. تشغيل وحدة IEF حتى يصل الجهد إلى قيمة ثابتة، ما يقرب من ثلاث ساعات.بعد الضغط على الحصاد على زر محاذاة دبابيس جامع الكسر مع لوحات جمع. دفع دبابيس من خلال الشريط ختم لبدء جمع كسور Sylvestre Gymnema. تنمو مستعمرة واحدة من C.albicans والخميرة بيبيتون مرق dextrose بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع اهتزاز.نقل الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي وجمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي في 10، 000 مرات G لمدة خمس دقائق. بعد إزالة supernatant، تعليق خلايا الخميرة في المخزن المؤقت وتدوير التعليق في أنبوب الأسطوانة لمدة ساعة واحدة في خمس درجات مئوية. لإزالة خلايا الخميرة، الطرد المركزي تعليق في 10، 000 مرات G لمدة خمس دقائق.ثم تصفية استخراج البروتين من خلال مرشح ميكرومتر 0.45. نقل استخراج البروتين إلى أنابيب غسيل الكلى وsingyze ضد الماء لمدة 15 ساعة في أربع درجات مئوية. بعد تقدير تركيز البروتين، جمع كمية من مستخلص البروتين تحتوي على 500 ملليغرام من البروتين الكلي.تخفيف 500 ملليغرام من البروتين في 60 ملليلتر من الماء التي تحتوي على 1٪ أمبيروليت من حيث الحجم. باستخدام حقنة، قم بتحميل مستخلص البروتين المخفف في خلية IEF وتشغيل الوحدة بسرعة ثابتة تبلغ 15 واط لمدة أربع ساعات. منذ هذا الصك يستخدم امدادات الكهرباء عالية الجهد، يجب على المستخدم اتخاذ جميع الاحتياطات لتجنب أي اتصال مباشر مع الأقطاب الحية.يحتوي جامع الكسر على 20 أنبوبًا بلاستيكيًا، كل منها 12 ملليمترًا في 75 ملليمترًا. وهو متصل بمضخة الفراغ الاستعداد لجمع الكسور عن طريق الضغط على زر الحصاد.ثم محاذاة دبابيس جمع 20 على جامع الكسور مع لوحة جمع 20 حتى مختومة خلية التركيز. دفع دبابيس جمع من خلال الشريط الختم وفي وقت واحد تشغيل مضخة فراغ. كل أنبوب سوف جمع جزء من البروتين حوالي ثلاثة ملليلتر.بعد تقليل وغلي كسور البروتين، وتحليلها على 12.5٪ هلام SDS الصفحة. وصمة عار هلام مع صبغة الأزرق Coomassie ووضعها على الروك في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات destain هلام.ثم قم بتسجيل صورة الجل باستخدام صورة هلام. إعداد تعليق خلية الخميرة عن طريق تخفيف ثقافة بين عشية وضحاها من C.albicans في نسبة 1:1000 في ثقافة الخلايا في RPMI المتوسطة تكملها مع الجلوكوز 50 ملليمتر. إضافة 90 ميكروليتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من 96 لوحة جيدا.بعد ذلك، أضف 10 ميكرولترات من كل كسر G.sylvestre لفصل الآبار. كتحكم سلبي، إضافة 10 ميكرولترات من الماء مع 1٪ أمبيروليت في آبار منفصلة. بعد احتضان لوحة 96 بئر في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة، ومراقبة لوحة تحت المجهر.عدم وجود نمو خيوط يشير إلى تثبيط C.albicans الخميرة إلى hypha التحويل. تم الحصول على 20 جزء من استخراج G.sylvestre بواسطة المرحلة السائلة IEF. جزيئات داكنة اللون، والأحماض الرياضية، هاجرت إلى وإثراء في نهاية أنود من الوحدة.لوحظت الكسور الصفراء الشفافة في نهاية الكاثود. تم تخفيض Aliquots من كل انكسار G.sylvestre ، والمغلي وحلها من قبل صفحة SDS. وأظهرت بقعة Coomassie الأزرق عصابة مختلفة من البوليبتيد في حوالي خمسة كيلودالتون، المخصب في الكسور 16 من خلال 19.الأحماض Gymnemic في جزء واحد، والكسور القليلة القادمة لم يتم الكشف عنها لأنها ليست بروتينية. ومع ذلك، يمكن فصل هذه الجزيئات بواسطة TLC والكشف عنها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. لم يحتوي الكسر 10 على كمية يمكن اكتشافها من هذه الجزيئات الصغيرة مما يشير إلى أن معظم الجزيئات الصغيرة العضوية تم إثراؤها في كسور من واحد إلى ثلاثة.تم فحص جميع كسور G.sylvestre 20 لتثبيط تحويل الخميرة إلى الواصلة والنمو الواصل في C.albicans. ولوحظ أكبر تثبيط في الكسر الأول ولوحظ وجود تثبيط ضئيل أو غير مثبّت في الكسور 10 وما فوق. تم تجزئة بروتينات سطح الخلايا من C.albicans باستخدام المرحلة السائلة IEF.و(aliquots) من 18 كسراً تم تحليلها بواسطة صفحة SDS كانت البروتينات المخصبة مرئية في عدة أجزاء. البداية، لا يمكن فصل جزيئات صغيرة من قبل تركيز isoelectric لأنه يعتقد أنها غير المتنقلة.تظهر دراساتنا أنها مُمَرَة، على الأقل أسبوعية، ويمكن استكشاف هذه الطريقة بشكل أكبر للجزيئات الصغيرة الأخرى.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Method

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

فصل واحدة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، والحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ، والحمض النووي الريبي من جالية الفيروسية البيئة باستخدام الكروماتوغرافيا هيدروكسيباتيت

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

مقدمة لالدبابير الطفيلية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; والاستجابة المناعية Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

الكمية التصوير من النسب المحددة اشارة مستقبلات بوساطة الرقم تشبه في وحيدات والخلايا الجذعية من عينات صغيرة من دم الإنسان

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

فصل<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; في وقت متأخر مرحلة المصابين تبدي الكريات الحمر بوسائل المغناطيسي

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

الفصل الآلي لل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; المستعمرة بنسب مختلفة من قبل الممرض الجرثومي

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

والطريقة الأمثل لعزل وتوسيع قسما ثابتا الطبيعية الخلايا التائية القاتلة من الماوس الطحال

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

التوصيف المظهري لالضامة من الكلى الجرذ بواسطة التدفق الخلوي

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...