Name: separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method
Uploaded: 2020-06-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method at JoVE.com

Vi er taknemmelige for de finansieringskilder fra Afdelingen for Biologi og Johnson Cancer Research Center for BRIEF og IRA awards, henholdsvis til GV. Vi takker også K-INBRE postdoc-prisen til RV. Dette arbejde blev delvist støttet af Institutional Development Award (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences ved National Institutes of Health under tilskudsnummer P20 GM103418. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of General Medical Sciences eller National Institutes of Health. Vi takker de anonyme korrekturlæsere for deres nyttige kommentarer.

1. Opsætning og forudafkørsel af standard ief-enhed for flydende fase
<ol><li>Samling af væskefase-IEF-elektroderne (anoderød knap og katodesort knap) med deres respektive udvekslingsmembraner i henhold til brugsanvisningen (se Tabel over Materialer). Anionbyttermembranerne ekvilibrer med 0,1 M NaOH og kationbyttermembranerne med 0,1 M H3PO4 i mindst 16 timer, når der anvendes nye membraner.<ol>
<li>Membranerne opbevares i elektrolytter (0,1 M NaOH eller 0,1 M H3PO...

<ol>
	<li>Jankowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedure+of+extraction,+purification+and+proteomic+analysis+of+nuclear+proteins+from+mouse+brain.">Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).</li><li>Pergande, M. R., Cologna, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+Point+Separations+of+Peptides+and+Proteins.">Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins.</a> Proteomes. 5 (1), (2017).</li><li>Stoyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IEF-based+multidimensional+applications+in+proteomics:+toward+higher+resolution.">IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution.</a> Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).</li><li>Vesterberg, O. A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method of Isoelectric Fractionation. , (1964).</li><li>Vesterberg, O., Svensson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+fractionation,+analysis,+and+characterization+of+ampholytes+in+natural+pH+gradients.+IV.+Further+studies+on+the+resolving+power+in+connection+with+separation+of+myoglobins.">Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins.</a> Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).</li><li>Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , 1 (1983).</li><li>Vesterberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Isoelectric+Fractionation+of+Carrier+Ampholytes.">Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes.</a> Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).</li><li>Bier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+isoelectric+focusing+and+isotachophoresis.">Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis.</a> Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).</li><li>Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis:+mathematical+modeling+and+computer+simulation.">Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation.</a> Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).</li><li>Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Rotofor+preparative+isoelectrofocusing+cell+in+protein+purification+procedure.">Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).</li><li>Wagner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+dipeptidyl+peptidase+IV+(DP+4)+isoforms+from+porcine+kidney+by+preparative+isoelectric+focusing+to+improve+crystallization.">Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization.</a> Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).</li><li>Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Monoclonal+Antibody+Charge+Variants+by+Free+Flow+Isoelectric+Focusing.">Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing.</a> Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).</li><li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+T-cell+antigen+identification+using+humanized+HLA-DR4+transgenic+mice.">Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice.</a> Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).</li><li>Riyong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+charge+antigens+of+Dirofilaria+immitis+adult+worm+for+IgG-ELISA+diagnosis+of+bancroftian+filariasis.">Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis.</a> Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).</li><li>Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+proteins+of+Candida+albicans:+preparation+of+extracts+and+improved+detection+of+proteins.">Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins.</a> Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).</li><li>Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+acids+inhibit+hyphal+growth+and+virulence+in+Candida+albicans.">Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans.</a> PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+ampholytes+used+for+isoelectric+focusing+may+interfere+with+bioactivity+based+purification+of+antimicrobial+peptides.">Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).</li><li>Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-Acid-Sequence+of+Sweet-Taste-Suppressing+Peptide+(Gurmarin)+from+the+Leaves+of+Gymnema-Sylvestre.">Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre.</a> Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).</li><li>Craik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry.+Seamless+proteins+tie+up+their+loose+ends.">Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends.</a> Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).</li><li>Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cyclotides:+A+unique+family+of+cyclic+and+knotted+proteins+that+defines+the+cyclic+cystine+knot+structural+motif.">Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif.</a> Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).</li><li>Stoecklin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+physiological+properties+of+gymnemic+acid,+the+antisaccharine+principle+of+the+leaves+of+Gymnema+sylvestre.">Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).</li><li>Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+elucidation+of+gymnemic+acids,+antisweet+principles+of+Gymnema+sylvestre.">Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre.</a> Chemical &amp; Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).</li><li>Veerapandian, R., Vediyappan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+Acids+Inhibit+Adhesive+Nanofibrillar+Mediated+Streptococcus+gordonii-Candida+albicans+Mono-Species+and+Dual-Species+Biofilms.">Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).</li><li>Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+cell+wall+proteins.">Candida albicans cell wall proteins.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).</li></ol>

Små molekyler fra naturlige produktkilder (f.eks. planter) omfatter komplekse sekundære metabolitter, der er meget forskellige i kemisk struktur. De menes at være involveret i anlægget forsvarsmekanismer. Desuden er polypeptider også til stede i plantevæv22. Disse naturlige produkt små molekyler er rige kilder til test molekyler til opdagelse og udvikling af lægemidler. Men de vanskelige og kedelige metoder, der kræves for deres isolation og rensning begrænse deres anvendelse til terapeu...

Rensning af biomolekyler fra komplekse biologiske prøver er et væsentligt og ofte vanskeligt skridt i biologiske forsøg1. Isoelektrisk fokusering (IEF) er velegnet til høj opløsning adskillelse af komplekse biomolekyler, hvor bæreampholytter rejser i henhold til deres ladning og etablere pH gradient i et elektrisk felt3. Den første kommercielle bærende ampholyte til IEF blev udviklet af Olof Vesterberg i 1964 og patenteret4,5. Carrier ampholytes er alifatiske oligo-amino oligo-carboxylic syre molekyler af varierende længde og forgrening6. Efterfølgende forbedrede Vesterberg og andre bæreampholytterne til deres udvidede anvendelse ved adskillelse af biomolekyler6,7.
Metoder til at adskille biomolekyler omfatter agarose og polyacrylamide gel elektroforese, to-dimensionel gel elektroforese (2-DE), isoelektrisk fokusering, kapillær elektroforese, isotachophoresis og andre kromatografiske teknikker (f.eks TLC, FPLC, HPLC)2. Flydende fase IEF udført i et instrument kaldet en "Rotofor" blev opfundet af Milan Bier8. Han var pioner inden for konceptet og designet af dette instrument og bidrog i udstrakt grad til teorien om elektroforetisk migration. Hans team også udviklet en matematisk model af elektroforetisk adskillelse proces forcomputersimuleringer 9.
IEF-apparatet i væskefasen er en vandret roterende cylindrisk celle bestående af en nylonkerne opdelt i 20 porøse rum og en cirkulerende keramisk jernstang. De porøse kamre gør det muligt for molekyler at migrere gennem den vandige fase mellem elektroderne og tillade indsamling af rensede prøver under vakuum i fraktioner. Dette rensningssystem kan give op til 1000-fold rensning af et bestemt molekyle i <4 timer. Et værdifuldt træk ved dette instrument er, at det kan anvendes som et første skridt til rensning fra en kompleks blanding eller som et sidste skridt for at opnå renhed10. Hvis molekylet af interesse er et protein, en anden fordel er, at dens oprindelige kropsbygning vil blive opretholdt under adskillelsen.
Brugen af væskefase-IEF er blevet rapporteret bredt for proteiner , enzymer og antistofrensning6,10,11,12,13,14. Her beskriver vi brugen af denne fremgangsmåde til adskillelse og rensning af små molekyler og peptider fra den medicinske plante Gymnema sylvestre. Denne protokol vil hjælpe forskere koncentrere og rense aktive små molekyler fra en plante ekstrakt til downstream applikationer til lave omkostninger. Derudover viser vi også, at berigelse af proteiner fra et komplekst proteinekstrakt fra Candida albicans-svampe 15 i dette IEF-baserede system som et andet eksempel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisher scientfic</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207861-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 3/10 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 5/8 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact low temperature thermostat</td>
			<td>Lauda -Brinkmann</td>
			<td>RM 6T</td>
			<td>Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (3,500 MWCO)</td>
			<td>Spectrum Spectra/Por</td>
			<td>132112T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gymnema plant leaf extract powder (&#62;25% Gymnemic acids)</td>
			<td>Suan Farma, NJ USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Lab companion</td>
			<td>SI 300R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM 6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean electrophoresis</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S20</td>
			<td>Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotofor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2972</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>DH30255.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2960</td>
			<td>Scotch tape may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall legend micro 17 centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>75002432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP tissue culture plate -96 well flat bottom</td>
			<td>TPP</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method

Naturlige produkter fremstillet af planter og mikrober er en rig kilde til bioaktive molekyler. Før de anvendes, skal de aktive molekyler fra komplekse ekstrakter renses til downstream applikationer. Der er forskellige kromatografiske metoder til rådighed til dette formål, men ikke alle laboratorier har råd til højtydende metoder og isolation fra komplekse biologiske prøver kan være svært. Her viser vi, at prærativ isoelektrisk fokusering i væskefase (IEF) kan adskille molekyler, herunder små molekyler og peptider fra komplekse planteekstrakter, baseret på deres isoelektriske punkter (pI). Vi har brugt metoden til kompleks biologisk prøvefraktionering og karakterisering. Som et proof of concept, vi fraktioneret en Gymnema sylvestre planteekstrakt, isolere en familie af terpenoid saponin små molekyler og et peptid. Vi har også vist effektiv mikrobiel proteinadskillelse ved hjælp af Candida albicans-svampen som modelsystem.

Separation og rensning af små molekyler og peptider fra Gymnema sylvestre planteekstrakt Ved hjælp af den præformative væskefase IEF-metode fraktionerede vi lægemiddelplanteekstrakter og celleoverfladeproteiner fra en human patogen svamp, C. albicans. Der vises en skematisk af disse fraktioneringsprotokoller i figur 1.
Fra 20 fraktioner af G. sylvestre ekstrakt fremstillet af flydende fase IEF, de mørke-farvede ...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method at JoVE.com

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method

Målet er at fraktionere og isolere bioaktive små molekyler, peptider fra et komplekst planteekstrakt og proteiner fra patogene mikrober ved at anvende isoelektrisk væskefasemålingsmetode (IEF). Endvidere blev de adskilte molekyler identificeret og deres bioaktivitet bekræftet.

Adskillelse af bioaktive små molekyler, peptider fra naturlige kilder og proteiner fra mikrober ved præparativ isoelektrisk fokusering (IEF) metode

Natural products derived from plants and microbes are a rich source of bioactive molecules. Prior to their use, the active molecules from complex extracts ...

Vores protokol beskriver de nye resultater om adskillelse og rensning af aktive molekyler fra et planteekstrakt. Forskere kan bruge disse metoder til at isolere små molekyler og peptider fra naturlige produktkilder for terapeutiske brugere. Gør dig bekendt med instrumentkomponenterne og deres monteringsmetoder.Det er vigtigt at være sikker på, at den prøve, der skal adskilles, er udarbejdet af de foreslåede retningslinjer. Denne metode omfatter flere samlingsprocesser i instrumentet. Og den visuelle demonstration vil hjælpe brugerne til at følge og med succes anvende dem til forskning.Efter montering af væskefasen, IEF-enheden som beskrevet i brugsanvisningen, skal anionbyttermembranerne bringes i overensstemmelse med 0,1 molarnatriumhydroxid og kationbyttermembranerne med 0,1 molarphosphorricsyre. Juster gummipakningerne, så de tre store aflange huller forbliver ublokerede af gummiet. Dette vil hjælpe med at udveksle ioner mellem elektroden og prøverummene via membranen under elektroforese.Monter den indre og ydre del af elektroden ved at justere de tre aflange huller i ionbytningspakningerne. Fyld derefter elektroderne med deres respektive elektrolytter for at forhindre deres membraner i at tørre ud. Stram derefter plastskrueholderen for at sikre en lækagefri montering.Dæk prøveopsamlingstavlerne med tætningstape. Derefter samles de dele af fokuskammeret over den keramiske kølefinger i følgende sekvens:anodelektrode, nylonmembrankerne, fokuskammer og katodeelektrode. Ved hjælp af en 50 milliliter sprøjte, fylde fokuskammeret med forkølet destilleret vand.For en standard IEF-celle tilsættes 60 milliliter vand. Tilslut IEF-enheden til cirkulerende kølevand ved fire grader Celsius. Betjen enheden ved 15 watt og 3000 volt, indtil spændingen stabiliseres, cirka tre til fem minutter.Sluk derefter for strømkilden. Brug brøkopsamleren til at fjerne vandet fra cellen. Forsegle indsamlingstavlerne med tætningstape igen.Tilsæt 0,6 gram Gymnema sylvestre planteekstrakt, til 60 milliliter destilleret vand. Plantekstraktet opløses ved at blande i et rullerør i fem minutter. For at fjerne de uopløselige partikler centrifugeres denne opløsning ved 10.000 gange G i fem minutter.Overfør supernatanten til et 150 milliliter glasbæger og tilsæt ampholyt for at skabe en 1%-opløsning i volumen, ca. 0,6 milliliter. Ved hjælp af en 50 milliliter sprøjte med en 1,5 tommer 19 gauge stump ende nål, indlæse denne løsning i IEF-cellen gennem prøven indsamling bestyrelser. Fjern derefter cellen fra stativet og tryk på elektrodekammeret for at løsne og fjerne eventuelle bobler.Tilslut enheden til kølevandet. Med strømforsyningen til konstant 15 Watt begynde fraktionering. Kør IEF-enheden, indtil spændingen når en konstant værdi, ca. tre timer.Efter at have trykket på høsten på knappen justere fraktionsamler stifter med indsamling bestyrelser. Skub benene gennem forseglingsbåndet for at begynde at indsamle Gymnema sylvestre fraktioner. Vokse en enkelt koloni af C.albicans og gær pepitone dextrose bouillon natten over ved 30 grader Celsius med rysten.Overfør kulturen til et centrifugerør, og gærcellerne opsamls ved centrifugering ved 10.000 gange G i fem minutter. Efter fjernelse af supernatanten, suspendere gærceller i buffer og rotere suspensionen i et rullerør i en time ved fem grader Celsius. For at fjerne gærceller, centrifuge suspensionen på 10, 000 gange G i fem minutter.Filtrer derefter proteinekstraktet gennem et 0,45 mikrometerfilter. Overfør proteinekstraktet til dialyserør og dialyze mod vand i 15 timer ved fire grader Celsius. Efter at have vurderet proteinkoncentrationen indsamles et volumen af proteinekstrakt, der indeholder 500 milligram totalprotein.Fortyndes de 500 milligram protein i 60 milliliter vand, der indeholder 1%ampholyte i volumen. Ved hjælp af en sprøjte skal det fortyndede proteinekstrakt indlæses i IEF-cellen, og enheden betjenes konstant 15 watt i fire timer. Da dette instrument bruger højspændingsforsyning, skal brugeren tage alle forholdsregler for at undgå direkte kontakt med de levende elektroder.Fraktionsamleren indeholder 20 plastrør, hver 12 millimeter med 75 millimeter. Og den er forbundet til vakuumpumpen. Forbered dig på at indsamle brøker ved at trykke på høsten på knappen.Juster derefter de 20 samlingsstifter på brøkopsamleren med 20 opsamlingsbrættet, så den forseglede fokuscelle. Skub samlingsstifterne gennem tætningsbåndet, og tænd samtidig for vakuumpumpen. Hvert rør vil indsamle et protein fraktion af omkring tre milliliter.Efter at reducere og koge proteinfraktionerne, analysere dem på en 12,5% SDS side gel. Plet gelen med Coomassie Blue farvestof og læg den på en rocker ved stuetemperatur. Efter to til tre timer destain gelen.Derefter optage gel billedet ved hjælp af en gel imager. Forbered en gær celle suspension ved at fortynde en overnight kultur af C.albicans på en 1:1000 forholdet i RPMI cellekultur medium suppleret med 50 millimolar glukose. Tilføj 90 mikroliter af celle suspensionen til hver brønd af en 96 brønd plade.Dernæst tilsættes 10 mikroliter af hver G.sylvestre fraktion for at adskille brønde. Som en negativ kontrol, tilsæt 10 mikroliter vand med 1%ampholyte i separate brønde. Efter inkubering af 96 brøndpladen ved 37 grader Celsius i 12 timer, observere pladen under et mikroskop.Manglen på filamentous vækst indikerer hæmning af C.albicans gær-til-hypha konvertering. 20 fraktioner af G.sylvestre-ekstraktet blev fremstillet ved flydende fase IEF. Mørke farvede molekyler, gymnemiske syrer, migreret til og blev beriget i anode ende af enheden.Gennemskinnelige lysegule fraktioner blev observeret i katodeen. Aliquots fra hver G.sylvestre brydning blev reduceret, kogt og løst ved SDS side. En Coomassie Blue plet viste et andet polypeptidbånd på omkring fem kilodaltons, beriget med fraktioner 16 til 19.Gymnemic syrer i fraktion et, og de næste par fraktioner blev ikke opdaget, da de ikke er proteinholdige. Men, disse molekyler kan adskilles af TLC og detekteres under UV-lys. Fraktion 10 indeholdt ikke en påviselig mængde af disse små molekyler, hvilket tyder på, at de fleste af de organiske små molekyler blev beriget i fraktioner en til tre.Alle 20 G.sylvestre fraktioner blev analyseret for hæmning af gær-til-hypha konvertering og hyphal vækst i C.albicans. Den største hæmning blev observeret i fraktion 1, og der blev observeret lidt til ingen hæmning i fraktioner 10 og derover. Celleoverfladeproteiner fra C.albicans blev fraktioneret ved hjælp af flydende fase IEF.Og aliquots fra 18 fraktioner blev analyseret af SDS side. Berigede proteiner var synlige i flere fraktioner. Starten, små molekyler kunne ikke adskilles af isoelektrisk fokusering, fordi de menes at være ikke-ambulant.Vores undersøgelser viser, at de er ambulant, mindst en gang om ugen, og denne metode kan udforskes yderligere for andre små molekyler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Method

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Kvantitativ afbildning af Lineage-specifikke Toll-lignende receptor-medieret signalering i monocytter og dendritiske celler fra små prøver af humant blod

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automatiseret Adskillelse af<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel koloniseret af et bakterielt patogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T-celler Capture bakterier ved Transinfection fra dendritiske celler

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimeret fremgangsmåde til isolering og udvidelse Invariant Natural Killer T-celler fra musemilt

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolering af leukocytter fra musehud anvendelse af enzymatiske Digest og Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering af en High-throughput Opsætning til screening små molekyler, der modulerer c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fænotypisk karakterisering af makrofager fra rottenyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...