Name: separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method
Uploaded: 2020-06-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method at JoVE.com

אנו אסירי תודה על מקורות המימון של החטיבה לביולוגיה ומרכז ג'ונסון לחקר הסרטן עבור פרסים קצרים והרה, בהתאמה GV. אנו מודים גם לפרס הפוסט-דוקטורט של K-INBRE לקרוואן. עבודה זו נתמכת בחלקו של פרס הפיתוח המוסדי (הרעיון) מן המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר P20 GM103418. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית או המוסדות הלאומיים לבריאות. אנו מודים לסוקרים האנונימיים על הערותיהם השימושיות.

1. התקנה והקמה מראש של היחידה הסטנדרטית של התוכנית הראשונה.
<ol><li>הכנס את ה-gmp בשלב הנוזלי (כפתור הכפתור האדום וכפתור שחור-קתודה) עם ממברנות החליפין המתאימים שלהם לפי הוראות ההדרכה (ראה טבלת חומרים). באמצעות שימוש בממברנות ממברנות עם 0.1 M NaOH ו ממברנות הקטיון עם 0.1 M H3פו4 לפח?...

<ol>
	<li>Jankowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedure+of+extraction,+purification+and+proteomic+analysis+of+nuclear+proteins+from+mouse+brain.">Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).</li><li>Pergande, M. R., Cologna, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+Point+Separations+of+Peptides+and+Proteins.">Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins.</a> Proteomes. 5 (1), (2017).</li><li>Stoyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IEF-based+multidimensional+applications+in+proteomics:+toward+higher+resolution.">IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution.</a> Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).</li><li>Vesterberg, O. A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method of Isoelectric Fractionation. , (1964).</li><li>Vesterberg, O., Svensson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+fractionation,+analysis,+and+characterization+of+ampholytes+in+natural+pH+gradients.+IV.+Further+studies+on+the+resolving+power+in+connection+with+separation+of+myoglobins.">Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins.</a> Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).</li><li>Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , 1 (1983).</li><li>Vesterberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Isoelectric+Fractionation+of+Carrier+Ampholytes.">Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes.</a> Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).</li><li>Bier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+isoelectric+focusing+and+isotachophoresis.">Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis.</a> Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).</li><li>Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis:+mathematical+modeling+and+computer+simulation.">Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation.</a> Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).</li><li>Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Rotofor+preparative+isoelectrofocusing+cell+in+protein+purification+procedure.">Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).</li><li>Wagner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+dipeptidyl+peptidase+IV+(DP+4)+isoforms+from+porcine+kidney+by+preparative+isoelectric+focusing+to+improve+crystallization.">Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization.</a> Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).</li><li>Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Monoclonal+Antibody+Charge+Variants+by+Free+Flow+Isoelectric+Focusing.">Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing.</a> Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).</li><li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+T-cell+antigen+identification+using+humanized+HLA-DR4+transgenic+mice.">Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice.</a> Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).</li><li>Riyong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+charge+antigens+of+Dirofilaria+immitis+adult+worm+for+IgG-ELISA+diagnosis+of+bancroftian+filariasis.">Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis.</a> Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).</li><li>Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+proteins+of+Candida+albicans:+preparation+of+extracts+and+improved+detection+of+proteins.">Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins.</a> Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).</li><li>Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+acids+inhibit+hyphal+growth+and+virulence+in+Candida+albicans.">Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans.</a> PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+ampholytes+used+for+isoelectric+focusing+may+interfere+with+bioactivity+based+purification+of+antimicrobial+peptides.">Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).</li><li>Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-Acid-Sequence+of+Sweet-Taste-Suppressing+Peptide+(Gurmarin)+from+the+Leaves+of+Gymnema-Sylvestre.">Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre.</a> Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).</li><li>Craik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry.+Seamless+proteins+tie+up+their+loose+ends.">Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends.</a> Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).</li><li>Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cyclotides:+A+unique+family+of+cyclic+and+knotted+proteins+that+defines+the+cyclic+cystine+knot+structural+motif.">Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif.</a> Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).</li><li>Stoecklin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+physiological+properties+of+gymnemic+acid,+the+antisaccharine+principle+of+the+leaves+of+Gymnema+sylvestre.">Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).</li><li>Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+elucidation+of+gymnemic+acids,+antisweet+principles+of+Gymnema+sylvestre.">Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre.</a> Chemical &amp; Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).</li><li>Veerapandian, R., Vediyappan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+Acids+Inhibit+Adhesive+Nanofibrillar+Mediated+Streptococcus+gordonii-Candida+albicans+Mono-Species+and+Dual-Species+Biofilms.">Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).</li><li>Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+cell+wall+proteins.">Candida albicans cell wall proteins.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).</li></ol>

מולקולות קטנות ממקורות המוצר הטבעי (למשל, צמחים) כוללים מטבוליטים מורכבים מאוד מגוונים מאוד במבנה כימי. הם מאמינים כי הם מעורבים במנגנוני ההגנה של הצמח. בנוסף, פוליפפטידים נמצאים גם ברקמות הצמח22. המוצר הטבעי הזה מולקולות קטנות הם מקורות עשירים של מולקולות בדיקה לגילוי סמים ופ...

טיהור הbiomolecules מדגימות ביולוגיות מורכבות הוא צעד חיוני וקשה לעתים קרובות בניסויים ביולוגיים1. איזואלקטריים התמקדות (הארה ב) הוא מתאים הפרדה ברזולוציה גבוהה של biomolecules מורכבים שבו המוביל ampholytes לנסוע לפי הטעינה שלהם ולהקים את הדרגתי pH בשדה חשמלי3. המוביל המסחרי הראשון של חברת הקולנוע הארצי פותח על ידי אושל וסטברג בשנת 1964 וכפטנט4,5. אמולוציטים המוביל הם אליפטיות oligo-אמינו oligo-carboxylic חומצה מולקולות באורך משתנה ומסעף6. לאחר מכן, בוסטברג ואחרים שיפרו את המוביל אמולוציטים לשימוש המורחב שלהם בהפרדת biomolecules6,7.
שיטות להפרדת הbiomolecules כוללות אגקם ו פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה, אלקטרופורזה דו מימדית ג'ל (2-DE), איזואלקטריים התמקדות, אלקטרופורזה קפילר, isotaקוזוהורזיס וטכניקות כרומטוגרפיים אחרים (למשל, ועוד, FPLC, כרומטוגרפיה)2. במהלך האירוע הומצא הארגון הבינלאומי של מילאנו ביר8בכלי שנקרא "Rotofor". הוא ייסד את הקונספט והעיצוב של המכשיר הזה ותרם רבות לתיאוריית ההגירה האלקטרופיניטית. הצוות שלו פיתח גם מודל מתמטי של תהליך הפרדה אלקטרופלסטי לסימולציות מחשב9.
המנגנון הנוזלי הינו מנגנון מסתובב אופקית המורכב מליבת ניילון מחולק ל -20 תאים נקבובי ומים מחזורי קירור המים מוט קרמיקה. התאים הנקבובי מאפשרים למולקולות להגר דרך השלב המים בין האלקטרודות וההיתר לאיסוף דגימות מטוהרים תחת ואקום בשברים. מערכת טיהור זו יכולה לספק עד 1000 לטיהור מתקפל של מולקולה מסוימת ב-< 4 שעות. תכונה רבת ערך של מכשיר זה היא שניתן להחילם כצעד ראשון לטיהור מתערובת מורכבת או כצעד אחרון להשגת הטוהר10. אם מולקולת העניין היא חלבון, יתרון נוסף הוא שהמערך הטבעי שלו יישמר במהלך ההפרדה.
השימוש בשלב הנוזלי הינו דיווח נרחב עבור חלבונים, אנזימים וטיהור נוגדנים6,10,11,12,13,14. כאן נתאר את השימוש בגישה זו להפרדת וטיהור מולקולות קטנות ופפטידים מצמח המרפא ג'ימנמה. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים להתרכז ולטהר מולקולות קטנות פעילות מתוך תמצית צמחים עבור יישומים במטה בעלות נמוכה. בנוסף, אנו גם להדגים כי העשרה של חלבונים מתמצית חלבון מורכב מפטרייה אלביקנס פטריה15 במערכת זו מבוססת-החוץ כדוגמה השנייה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisher scientfic</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207861-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 3/10 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 5/8 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact low temperature thermostat</td>
			<td>Lauda -Brinkmann</td>
			<td>RM 6T</td>
			<td>Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (3,500 MWCO)</td>
			<td>Spectrum Spectra/Por</td>
			<td>132112T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gymnema plant leaf extract powder (&#62;25% Gymnemic acids)</td>
			<td>Suan Farma, NJ USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Lab companion</td>
			<td>SI 300R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM 6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean electrophoresis</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S20</td>
			<td>Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotofor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2972</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>DH30255.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2960</td>
			<td>Scotch tape may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall legend micro 17 centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>75002432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP tissue culture plate -96 well flat bottom</td>
			<td>TPP</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method

מוצרים טבעיים הנגזרים מצמחים ומחיידקים הם מקור עשיר של מולקולות אקטיביים. לפני השימוש שלהם, המולקולות הפעילים מתמציות מורכבות חייבים להיות מטוהרים עבור יישומים במורד הזרם. יש שיטות כרומטוגרפיות שונות זמין למטרה זו עדיין לא כל המעבדות יכול להרשות לעצמם שיטות ביצועים גבוהים בידוד מדגימות ביולוגיות מורכבות יכול להיות קשה. כאן אנו מדגימים כי הסדר שלב נוזלי איזואלקטרי התמקדות (הפנים) יכול להפריד מולקולות, כולל מולקולות קטנות פפטידים מפני תמציות צמחים מורכבים, מבוסס על נקודות איזואלקטריים שלהם (pI). השתמשנו בשיטה לקבלת משבר ואפיון ביולוגיים מורכבים. כהוכחה של המושג, אנחנו מצאנו את הצמח מתחת לתמצית צמחים בבידוד, בידוד משפחה של טרפנאיד סאפונין מולקולות קטנות פפטיד. כמו כן הדגמנו הפרדת חלבון מחיידקים יעילים באמצעות פטרייה אלביקנס פטריה כמערכת מודל.

הפרדה וטיהור של מולקולות קטנות פפטידים מ ג'ימנמה הצמח תמצית באמצעות השיטה הביתטיבית לטיפול בשיטת האנטי-וולטאי, היינו משלבים תמציות של צמחי מרפא וחלבונים מפני השטח מפטרייה בתוך הגוף האנושי, C. אלביקנס. תרשים שרטוט של פרוטוקולי שבירה אלה מוצג באיור 1.
<p ...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method at JoVE.com

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method

המטרה היא לאנגיופלסטיקה ולבודד אקטיביים מולקולות קטנות, פפטידים מתוך תמצית צמח מורכב, חלבונים של חיידקים פתוגניים על ידי שימוש בשיטת מיקוד בשלב נוזלי (הארה ב) שיטה. יתרה מזאת, המולקולות המופרדות זוהו ופעילותם הביוביולוגית אושרה.

הפרדת מולקולות ביו-אקטיביות קטנות, פפטידים ממקורות טבעיים וחלבונים מחיידקים על ידי שיטת התמקדות איזואלקטריים

Natural products derived from plants and microbes are a rich source of bioactive molecules. Prior to their use, the active molecules from complex extracts ...

הפרוטוקול שלנו מתאר את הממצאים החדשים על ההפרדה והטיהור של מולקולות פעילות מתמצית צמחים. מדענים יכולים להשתמש בשיטות אלה כדי לבודד מולקולות קטנות ופפטידים ממקורות מוצר טבעיים עבור משתמשים טיפוליים. היכרות עם רכיבי המכשיר ושיטות ההרכבה שלהם.חשוב להיות בטוח, כי המדגם להיות מופרד מוכן על ידי ההנחיות המוצעות. שיטה זו כוללת תהליכי הרכבה מרובים של המכשיר. וההדגמה החזותית תסייע למשתמשים לעקוב אחריהם ולהחיל אותם בהצלחה על המחקר.לאחר הרכבת השלב הנוזלי, יחידת IEF כמתואר במדריך ההוראות, לצייד את קרום חילופי אניון עם 0.1 נתרן הידרוקסיד טוחן ואת קרום חילופי הקטיון עם 0.1 חומצה זרחנית טוחנת. יישר את אטמים גומי כך שלושת החורים מלבני גדול להישאר נעול על ידי הגומי. זה יעזור להחליף את היונים בין האלקטרודה לתאי הדגימה דרך הממברנה במהלך אלקטרופורזה.להרכיב את החלק הפנימי החיצוני של האלקטרודה על ידי יישור שלושת החורים מלבני אטמים חילופי יון. ואז למלא את האלקטרודות עם האלקטרוליטים שלהם בהתאמה כדי למנוע את הממברנות שלהם להתייבש. לאחר מכן, הדקו את מחזיק בורג הפלסטיק כדי להבטיח הרכבה נטולת דליפה.כסו את לוחות איסוף הדגימה בקלטת איטום. לאחר מכן להרכיב את החלקים של תא ההתמקדות מעל אצבע קירור קרמיקה ברצף הבא: אלקטרודה אנודה, ליבת קרום ניילון, תא התמקדות ואלקטרודה קתודה. בעזרת מזרק 50 מיליליטר, מלאו את תא ההתמקדות במים מזוקקים מקורר מראש.לתא IEF סטנדרטי, יש להוסיף 60 מיליליטר מים. חבר את יחידת ה- IEF למחזור מי קירור בארבע מעלות צלזיוס. הפעילו את היחידה ב-15 וואט ו-3000 וולט עד שהמתח יתייצב, כשלוש עד חמש דקות.לאחר מכן, כבה את מקור החשמל. באמצעות אספן השבר, להסיר את המים מהתא. לאטום מחדש את לוחות האיסוף עם סרט איטום.הוסף 0.6 גרם של תמצית צמח ג'ימא סילבסטרה, ל 60 מיליליטר של מים מזוקקים. ממיסים את תמצית הצמח על ידי ערבוב בצינור רולר במשך חמש דקות. כדי להסיר את החלקיקים המסיסים, צנטריפוגה פתרון זה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות.מעבירים את העל-טבעי ל-150 מיליליטר זכוכית ומוסיפים אמפיוליט ליצירת פתרון של 1% לפי נפח, כ-0.6 מיליליטר. באמצעות מזרק 50 מיליליטר עם 1.5 אינץ ' 19 מד מחט קצה קהה, לטעון פתרון זה לתוך תא IEF דרך לוחות איסוף מדגם. לאחר מכן הסר את התא מהדוכן והקש על תא האלקטרודה, כדי לסלק ולהסיר בועות.חבר את היחידה למים המתקררים. עם אספקת החשמל קבוע 15 וואט להתחיל שבר. הפעל את יחידת IEF עד שהמתח יגיע לערך קבוע, כשלוש שעות.לאחר לחיצה על הקציר על כפתור ליישר את סיכות אספן שבר עם לוחות האיסוף. לדחוף את הסיכות דרך סרט האיטום כדי להתחיל לאסוף את שברי ג'ימא סילבסטרה. לגדל מושבה אחת של C.albicans ושמרים פפיטון דקסטרוז מרק לילה ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד.מעבירים את התרבות לצינור צנטריפוגה ולאסוף את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר הסרת supernatant, להשעות את תאי השמרים במאגר ולסובב את ההשעיה בצינור רולר במשך שעה אחת בחמש מעלות צלזיוס. כדי להסיר את תאי השמרים, צנטריפוגה ההשעיה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות.לאחר מכן סנן את תמצית החלבון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.45. מעבירים את תמצית החלבון לצנרת דיאליזה ומדיאליזה נגד מים למשך 15 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הערכת ריכוז החלבון, לאסוף נפח של תמצית חלבון המכיל 500 מיליגרם של חלבון הכולל.מדללים את 500 מיליגרם החלבון ב-60 מיליליטר מים המכילים 1%ampholyte לפי נפח. באמצעות מזרק, לטעון את תמצית החלבון מדולל לתוך תא IEF ולהפעיל את היחידה קבוע 15 וואט במשך ארבע שעות. מכיוון שמכשיר זה משתמש באספקה חשמלית במתח גבוה, על המשתמש לנקוט בכל אמצעי הזהירות כדי להימנע ממגע ישיר עם האלקטרודות החיות.אספן השבר מכיל 20 צינורות פלסטיק, כל אחד 12 מילימטרים על ידי 75 מילימטרים. והוא מחובר למשאבת הוואקום. היכונו לאסוף את השברים על ידי לחיצה על הקציר על כפתור.לאחר מכן ליישר את 20 סיכות אוסף על אספן שבר עם לוח אוסף 20 כך תא מיקוד אטום. לדחוף את סיכות האיסוף דרך סרט האיטום ובו זמנית להפעיל את משאבת ואקום. כל צינור יאסוף שבר חלבון של כשלושה מיליליטר.לאחר צמצום והרתיחה של שברי החלבון, נתח אותם על ג'ל דף SDS 12.5%. מכתימים את הג'ל בצבע כחול קומאסי וממקמים אותו על נדנדה בטמפרטורת החדר. לאחר שעתיים עד שלוש שעות יש לבטל את הג'ל.לאחר מכן הקליטו את תמונת הג'ל בעזרת תמונה של ג'ל. הכן השעיה של תאי שמרים על ידי דילול תרבות לילה של C.albicans ביחס של 1:1000 בתרבות התאים של RPMI בינוני בתוספת 50 מילימולר גלוקוז. הוסף 90 microliters של ההשעיה התא לכל באר של צלחת 96 היטב.לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של כל שבר G.sylvestre להפריד בארות. כבקרה שלילית, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מים עם 1%ampholyte לתוך בארות נפרדות. לאחר הדגירה של צלחת 96 באר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות, לצפות בצלחת תחת מיקרוסקופ.חוסר צמיחה filamentous מציין את העיכוב של C.albicans שמרים להיפ המרה. עשרים שברים של תמצית G.sylvestre הושגו על ידי IEF שלב נוזלי. מולקולות בצבע כהה, החומצות הג'ימנסמיות, היגרו והועשרו בקצה האנודה של היחידה.שברים צהובים בהירים שקופים נצפו בקצה הקתודה. אליקוטים מכל שבירת G.sylvestre הופחתו, מבושלים ונפתרו על ידי דף SDS. כתם כחול קומאסי הראה רצועת פוליפפטיד שונה בערך חמישה קילודלטון, מועשר בשברים 16 עד 19.החומצות הגימנסיות בשבריר 1, והשברים הבאים לא זוהו מכיוון שהם אינם חלבונים. עם זאת, מולקולות אלה ניתן להפריד על ידי TLC ו שזוהה תחת אור UV. שבר 10 לא הכיל כמות ניכרת של מולקולות קטנות אלה המצביעות על כך שרוב המולקולות הקטנות האורגניות הועשרו בשברים 1 עד 3.כל 20 שברי G.sylvestre הועידו על עיכוב של המרת שמרים ליפ וצמיחה מקף ב C.albicans. העיכוב הגדול ביותר נצפתה בשבריר אחד ומעט עד ללא עיכוב נצפתה בשברים 10 ומעלה. חלבונים משטח התא מ C.albicans היו מופרדים באמצעות שלב נוזלי IEF.ואליקוטים מ-18 שברים נותחו על ידי דף SDS. חלבונים מועשרים נראו בכמה שברים. ההתחלה, מולקולות קטנות לא ניתן היה להפריד על ידי התמקדות isoelectric כי הם האמינו להיות לא אמבולטורי.המחקרים שלנו מראים שהם אמבולטוריים, לפחות שבועיים, ושיטת זו ניתן לחקור עוד יותר עבור מולקולות קטנות אחרות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Method

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

ההפרדה של ה-DNA חד גדילי, פעמיים תקועים DNA ו-RNA מהקהילה ויראלי הסביבה באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

מבוא של צרעות טפיליות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ואת התגובה החיסונית Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

הדמיה כמותי של שושלת ספציפית חיוג כמו קולטן בתיווך איתות מונוציטים ותאים דנדריטים של דגימות קטנות של דם אנושי

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

הפרדה<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; שלב מאוחר נגועים באמצעי מגנטי

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...