Name: separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method
Uploaded: 2020-06-14T14:00:00
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Siamo grati per le fonti di finanziamento della Divisionof Biology e Johnson Cancer Research Center per i premi BRIEF e IRA, rispettivamente a GV. Ringraziamo anche il premio post-dottorato K-INBRE al camper. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dall'Institutional Development Award (IDeA) dell'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Sanità con il numero di sovvenzione P20 GM103418. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali o degli Istituti Nazionali di Sanità. Ringraziamo i revisori anonimi per i loro commenti utili.

1. Configurazione e pre-esecuzione dell'unità IEF standard in fase liquida
<ol><li>Assemblare gli elettrodi IEF a fase liquida (pulsante anodo-rosso e pulsante catodo-nero) con le rispettive membrane di scambio secondo il manuale di istruzioni (vedere Tabella dei materiali). E' necessario scambiare le membrane di scambio dell'anione con 0,1 M NaOH e le membrane di scambio di 0,1 M H34 almeno per 16 h quando vengono utilizzate nuove membrane.<ol>
<li>Conservare le membrane negli e...

<ol>
	<li>Jankowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedure+of+extraction,+purification+and+proteomic+analysis+of+nuclear+proteins+from+mouse+brain.">Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).</li><li>Pergande, M. R., Cologna, S. 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D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Monoclonal+Antibody+Charge+Variants+by+Free+Flow+Isoelectric+Focusing.">Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing.</a> Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).</li><li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+T-cell+antigen+identification+using+humanized+HLA-DR4+transgenic+mice.">Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice.</a> Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).</li><li>Riyong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+charge+antigens+of+Dirofilaria+immitis+adult+worm+for+IgG-ELISA+diagnosis+of+bancroftian+filariasis.">Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis.</a> Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).</li><li>Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+proteins+of+Candida+albicans:+preparation+of+extracts+and+improved+detection+of+proteins.">Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins.</a> Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).</li><li>Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+acids+inhibit+hyphal+growth+and+virulence+in+Candida+albicans.">Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans.</a> PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).</li><li>Bradford, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+ampholytes+used+for+isoelectric+focusing+may+interfere+with+bioactivity+based+purification+of+antimicrobial+peptides.">Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).</li><li>Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-Acid-Sequence+of+Sweet-Taste-Suppressing+Peptide+(Gurmarin)+from+the+Leaves+of+Gymnema-Sylvestre.">Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre.</a> Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).</li><li>Craik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry.+Seamless+proteins+tie+up+their+loose+ends.">Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends.</a> Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).</li><li>Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cyclotides:+A+unique+family+of+cyclic+and+knotted+proteins+that+defines+the+cyclic+cystine+knot+structural+motif.">Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif.</a> Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).</li><li>Stoecklin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+physiological+properties+of+gymnemic+acid,+the+antisaccharine+principle+of+the+leaves+of+Gymnema+sylvestre.">Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).</li><li>Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+elucidation+of+gymnemic+acids,+antisweet+principles+of+Gymnema+sylvestre.">Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre.</a> Chemical &amp; Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).</li><li>Veerapandian, R., Vediyappan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+Acids+Inhibit+Adhesive+Nanofibrillar+Mediated+Streptococcus+gordonii-Candida+albicans+Mono-Species+and+Dual-Species+Biofilms.">Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).</li><li>Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+cell+wall+proteins.">Candida albicans cell wall proteins.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).</li></ol>

Le piccole molecole provenienti da fonti di prodotti naturali (ad esempio, piante) includono metaboliti secondari complessi che sono altamente diversificati nella struttura chimica. Si ritiene che siano coinvolti nei meccanismi di difesa delle piante. Inoltre, i polipeptidi sono presenti anche nei tessuti vegetali22. Questi piccoli molecole di prodotto naturale sono ricche fonti di molecole di prova per la scoperta e lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, i metodi difficili e noiosi necessari per il lo...

La purificazione delle biomolecole da complessi campioni biologici è un passo essenziale e spesso difficile negli esperimenti biologici1. La messa a fuoco isoelettrica (IEF) è adatta per la separazione ad alta risoluzione di biomolecole complesse in cui gli amplificatori portante viaggiano secondo la loro carica e stabiliscono il gradiente di pH in un campo elettrico3. Il primo amplificatore commerciale per IEF è stato sviluppato da Olof Vesterberg nel 1964 e brevettato4,5. Gli ampifiti portatrici sono molecole di acido oligo-amino-amino-carboxylicia alatoriche a varia lunghezza e ramificazione6. Successivamente, Vesterberg e altri migliorarono gli amplificatori del vettore per il loro uso espanso nel separare le biomolecole6,7.
I metodi per separare le biomolecole includono l'elettroforesi gel agarosa e poliacrilamina, l'elettroforesi gel bidimensionale (2-DE), la messa a fuoco isoelettrica, l'elettroforesi capillare, l'isotachophoresi e altre tecniche cromografiche (ad esempio, TLC, FPLC, HPLC)2. La IEF in fase liquida eseguita in uno strumento chiamato "Rotofor" è stata inventata da Milan Bier8. Fu pioniere nel concetto e nella progettazione di questo strumento e contribuì ampiamente alla teoria della migrazione elettroforetica. Il suo team ha anche sviluppato un modello matematico del processo di separazione elettroforetica per simulazioni al computer9.
L'apparato IEF a fase liquida è una cella cilindrica a rotazione orizzontale costituita da un nucleo di nylon diviso in 20 compartimenti porosi e un'asta di ceramica di raffreddamento ad acqua circolante. Le camere porose permettono alle molecole di migrare attraverso la fase acquosa tra gli elettrodi e permettono la raccolta di campioni purificati sotto vuoto in frazioni. Questo sistema di purificazione può fornire fino a 1000 volte la purificazione di una molecola specifica in <4 ore. Una caratteristica preziosa di questo strumento è che può essere applicato come primo passo per la purificazione da una miscela complessa o come passo finale per raggiungere la purezza10. Se la molecola di interesse è una proteina, un altro vantaggio è che la sua conformazione nativa sarà mantenuta durante la separazione.
L'uso di IEF a fase liquida è stato ampiamente segnalato per proteine, enzimi e purificazione degli anticorpi6,10,11,12,,13,14. Qui descriviamo l'uso di questo approccio per separare e purificare piccole molecole e peptidi dalla pianta medicinale Gymnema sylvestre. Questo protocollo aiuterà i ricercatori a concentrato e a purificare le piccole molecole attive da un estratto di pianta per applicazioni a valle a basso costo. Inoltre, dimostriamo anche che l'arricchimento delle proteine da un complesso estratto di proteine da Candida albicans fungo15 in questo sistema basato su IEF come secondo esempio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisher scientfic</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207861-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 3/10 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 5/8 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact low temperature thermostat</td>
			<td>Lauda -Brinkmann</td>
			<td>RM 6T</td>
			<td>Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (3,500 MWCO)</td>
			<td>Spectrum Spectra/Por</td>
			<td>132112T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gymnema plant leaf extract powder (&#62;25% Gymnemic acids)</td>
			<td>Suan Farma, NJ USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Lab companion</td>
			<td>SI 300R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM 6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean electrophoresis</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S20</td>
			<td>Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotofor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2972</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>DH30255.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2960</td>
			<td>Scotch tape may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall legend micro 17 centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>75002432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP tissue culture plate -96 well flat bottom</td>
			<td>TPP</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method

I prodotti naturali derivati da piante e microbi sono una ricca fonte di molecole bioattive. Prima del loro utilizzo, le molecole attive da estratti complessi devono essere purificate per applicazioni a valle. Ci sono vari metodi cromatografici disponibili per questo scopo, ma non tutti i laboratori possono permettersi metodi ad alte prestazioni e l'isolamento da campioni biologici complessi può essere difficile. Qui dimostriamo che la messa a fuoco isoelettrica in fase liquida preparata (IEF) può separare le molecole, tra cui piccole molecole e peptidi da complessi estratti vegetali, in base ai loro punti isoelettrici (pI). Abbiamo usato il metodo per la frazionamento e la caratterizzazione complesse dei campioni biologici. Come prova di concetto, abbiamo frazionato un estratto di pianta di Gymnema sylvestre, isolando una famiglia di salonina terpenoide piccole molecole e un peptide. Abbiamo anche dimostrato un'efficace separazione delle proteine microbiche usando il fungo Candida albicans come sistema modello.

Separazione e purificazione di piccole molecole e peptidi dall'estratto vegetale di Gymnema sylvestre Utilizzando il metodo iEF preparativo in fase liquida, abbiamo frazionato estratti vegetali medicinali e proteine della superficie cellulare da un fungo patogeno umano, C. albicans. Uno schema di questi protocolli di frazionamento è illustrato nella Figura 1.
Da 20 frazioni di G. sylvestre estratto ottenuto da Liquid...

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Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method

L'obiettivo è frazionare e isolare piccole molecole bioattive, peptidi da un complesso estratto vegetale e proteine da microbi patogeni utilizzando il metodo di messa a fuoco isoelettrica a fase liquida (IEF). Inoltre, sono state identificate le molecole separate e la loro bioattività è stata confermata.

Separazione delle piccole molecole bioattive, Peptidi da fonti naturali e proteine dai microbi di Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Metodo

Natural products derived from plants and microbes are a rich source of bioactive molecules. Prior to their use, the active molecules from complex extracts ...

Il nostro protocollo descrive le nuove scoperte sulla separazione e la purificazione delle molecole attive da un estratto vegetale. Gli scienziati possono utilizzare questi metodi per isolare piccole molecole e peptidi da fonti di prodotto naturali per gli utenti terapeutici. Familiarizzare con i componenti dello strumento e i loro metodi di assemblaggio.È importante essere sicuri che il campione da separare sia preparato dalle linee guida suggerite. Questo metodo coinvolge più processi di assemblaggio dello strumento. E la dimostrazione visiva aiuterà gli utenti a seguirli e applicarli con successo alla ricerca.Dopo aver assemblato la fase liquida, l'unità IEF come descritto nel manuale di istruzioni, equilibra le membrane di scambio ionico con idrossido di sodio molare 0,1 e le membrane di scambio cationico con acido fosforico molare 0,1. Allineare le guarnizioni in gomma in modo che i tre grandi fori oblunghi rimangano sbloccati dalla gomma. Ciò aiuterà a scambiare gli ioni tra l'elettrodo e i compartimenti campione attraverso la membrana durante l'elettroforesi.Assemblare la parte interna ed esterna dell'elettrodo allineando i tre fori oblunghi nelle guarnizioni di scambio ionico. Quindi riempire gli elettrodi con i rispettivi elettroliti per evitare che le loro membrane si asciughino. Quindi, stringere il supporto della vite di plastica per garantire un assemblaggio privo di perdite.Coprire le schede di raccolta dei campioni con nastro adesivo. Quindi assemblare le parti della camera di messa a fuoco sul dito di raffreddamento ceramico nella seguente sequenza: elettrodo anodico, nucleo a membrana in nylon, camera di messa a fuoco ed elettrodo catodico. Utilizzando una siringa da 50 millilitri, riempire la camera di messa a fuoco con acqua distillata pre-raffreddata.Per una cella IEF standard, aggiungere 60 millilitri di acqua. Collegare l'unità IEF all'acqua di raffreddamento circolante a quattro gradi Celsius. Azionare l'unità a 15 watt e 3000 volt fino a quando la tensione non si stabilizza, circa tre o cinque minuti.Quindi, spegnere la fonte di alimentazione. Utilizzando il raccoglitore di frazioni, rimuovere l'acqua dalla cella. Risigillare le schede di raccolta con nastro adesivo.Aggiungere 0,6 grammi di estratto vegetale gymnema silvestre, a 60 millilitri di acqua distillata. Sciogliere l'estratto vegetale mescolando in un tubo a rulli per cinque minuti. Per rimuovere le particelle insolubili, centrifugare questa soluzione a 10.000 volte G per cinque minuti.Trasferire il supernatante in un bicchiere da 150 millilitri e aggiungere l'ampolite per creare una soluzione dell'1% in volume, circa 0,6 millilitri. Utilizzando una siringa da 50 millilitri con un ago con estremità smussata calibro 19 da 1,5 pollici, caricare questa soluzione nella cella IEF attraverso le schede di raccolta dei campioni. Quindi rimuovere la cella dal supporto e toccare la camera dell'elettrodo, per rimuovere e rimuovere eventuali bolle.Collegare l'unità all'acqua di raffreddamento. Con l'alimentatore a costante 15 Watt iniziano il frazionamento. Eseguire l'unità IEF fino a quando la tensione raggiunge un valore costante, circa tre ore.Dopo aver premuto il pulsante di raccolta, allineare i perni del raccoglitore di frazioni con le schede di raccolta. Spingere i perni attraverso il nastro sigillante per iniziare a raccogliere le frazioni gymnema silvestre. Coltiva una singola colonia di C.albicans e brodo di pepitone di pepitone destrosio durante la notte a 30 gradi Celsius con tremori.Trasferire la coltura in un tubo di centrifuga e raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione a 10.000 volte G per cinque minuti. Dopo aver rimosso il supernatante, sospendere le cellule di lievito nel tampone e ruotare la sospensione in un tubo a rulli per un'ora a cinque gradi Celsius. Per rimuovere le cellule di lievito, centrifugare la sospensione a 10.000 volte G per cinque minuti.Quindi filtrare l'estratto proteico attraverso un filtro da 0,45 micrometri. Trasferire l'estratto proteico in tubi di dialisi e dializzare contro l'acqua per 15 ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver stimato la concentrazione proteica, raccogliere un volume di estratto proteico contenente 500 milligrammi di proteine totali.Diluire i 500 milligrammi di proteine in 60 millilitri di acqua contenenti l'1% di anholyte in volume. Utilizzando una siringa, caricare l'estratto proteico diluito nella cella IEF e azionare l'unità a una costante di 15 Watt per quattro ore. Poiché questo strumento utilizza un'alimentazione elettrica ad alta tensione, l'utente deve prendere tutte le precauzioni per evitare qualsiasi contatto diretto con gli elettrodi vivi.Il raccoglitore di frazioni contiene 20 tubi di plastica, ciascuno di 12 millimetri per 75 millimetri. Ed è collegato alla pompa per vuoto. Prepararsi a raccogliere le frazioni premendo la raccolta sul pulsante.Quindi allineare i 20 perni di raccolta sul raccoglitore di frazioni con la scheda di raccolta 20 in modo che la cella di messa a fuoco sigillata. Spingere i perni di raccolta attraverso il nastro di tenuta e allo stesso tempo accendere la pompa del vuoto. Ogni tubo raccoglierà una frazione proteica di circa tre millilitri.Dopo aver ridotto e bollito le frazioni proteiche, analizzarle su un gel di pagina SDS al 12,5%. Macchiare il gel con la tintura Coomassie Blue e posizionarlo su un rocker a temperatura ambiente. Dopo due o tre ore trattenere il gel.Quindi registrare l'immagine gel utilizzando un gel imager. Preparare una sospensione cellulare di lievito diluire una coltura notturna di C.albicans a un rapporto 1:1000 nel mezzo di coltura cellulare RPMI integrato con glucosio millimolare 50. Aggiungere 90 microlitri della sospensione cellulare ad ogni pozza di una piastra da 96 pozza.Quindi, aggiungere 10 microlitri di ogni frazione G.sylvestre a pozzi separati. Come controllo negativo, aggiungere 10 microlitri d'acqua con l'1% di ampholyte in pozzi separati. Dopo aver incubato la piastra del pozzo 96 a 37 gradi Celsius per 12 ore, osservare la piastra al microscopio.La mancanza di crescita filamentosa indica l'inibizione della conversione del lievito di C.albicans in ifa. Venti frazioni di estratto di G.sylvestre sono state ottenute mediante IEF di fase liquida. Le molecole di colore scuro, gli acidi gimnemici, migrarono e furono arricchite all'estremità anodo dell'unità.All'estremità del catodo sono state osservate frazioni giallo chiaro traslucide. Le aliquote di ogni rifrazione di G.sylvestre sono state ridotte, bollite e risolte dalla pagina SDS. Una macchia blu coomassie mostrò una diversa banda di polipeptidi a circa cinque kilodaltoni, arricchita in frazioni da 16 a 19.Gli acidi gimnemici nella prima frazione e le frazioni successivi non sono stati rilevati poiché non sono proteici. Tuttavia, queste molecole possono essere separate dal TLC e rilevate sotto la luce UV. La frazione 10 non conteneva una quantità rilevabile di queste piccole molecole suggerendo che la maggior parte delle piccole molecole organiche fossero arricchite in frazioni da una a tre.Tutte le 20 frazioni di G.sylvestre sono state testate per l'inibizione della conversione da lievito a ifa e la crescita ifale in C.albicans. La maggiore inibizione è stata osservata nella frazione uno e poco o nessun'inibizione è stata osservata nelle frazioni 10 e successive. Le proteine della superficie cellulare dei C.albicans sono state frazionate utilizzando la fase liquida IEF.E le aliquote da 18 frazioni sono state analizzate dalla pagina SDS. Le proteine arricchite erano visibili in diverse frazioni. L'inizio, piccole molecole non potevano essere separate da messa a fuoco isoelettrica perché si ritiene che non siano ambulatorie.I nostri studi dimostrano che sono ambulatoriale, almeno settimanalmente, e questo metodo può essere ulteriormente esplorato per altre piccole molecole.

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