Name: separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method
Uploaded: 2020-06-14T14:00:00
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Somos gratos pelas fontes de financiamento da Divisão de Biologia e johnson Cancer Research Center para prêmios BREVE e IRA, respectivamente para gv. Agradecemos também o prêmio de pós-doutorado K-INBRE à RV. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de bolsas P20 GM103418. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais ou dos Institutos Nacionais de Saúde. Agradecemos aos revisores anônimos por seus comentários úteis.

1. Configuração e pré-ressarificação da unidade IEF de fase líquida padrão
<ol><li>Monte os eletrodos IEF de fase líquida (botão vermelho-ânodo e botão cathode-preto) com suas respectivas membranas de troca de acordo com o manual de instruções (ver Tabela de Materiais). Equilibre as membranas de troca de ânion com 0,1 M NaOH e as membranas de troca de cáção com 0,1 M H3PO4 pelo menos por 16 h quando novas membranas são usadas.<ol>
<li>Armazene as membranas em ele...

<ol>
	<li>Jankowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedure+of+extraction,+purification+and+proteomic+analysis+of+nuclear+proteins+from+mouse+brain.">Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).</li><li>Pergande, M. R., Cologna, S. 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D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Monoclonal+Antibody+Charge+Variants+by+Free+Flow+Isoelectric+Focusing.">Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing.</a> Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).</li><li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+T-cell+antigen+identification+using+humanized+HLA-DR4+transgenic+mice.">Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice.</a> Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).</li><li>Riyong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+charge+antigens+of+Dirofilaria+immitis+adult+worm+for+IgG-ELISA+diagnosis+of+bancroftian+filariasis.">Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis.</a> Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).</li><li>Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+proteins+of+Candida+albicans:+preparation+of+extracts+and+improved+detection+of+proteins.">Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins.</a> Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).</li><li>Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+acids+inhibit+hyphal+growth+and+virulence+in+Candida+albicans.">Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans.</a> PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).</li><li>Bradford, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+ampholytes+used+for+isoelectric+focusing+may+interfere+with+bioactivity+based+purification+of+antimicrobial+peptides.">Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).</li><li>Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-Acid-Sequence+of+Sweet-Taste-Suppressing+Peptide+(Gurmarin)+from+the+Leaves+of+Gymnema-Sylvestre.">Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre.</a> Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).</li><li>Craik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry.+Seamless+proteins+tie+up+their+loose+ends.">Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends.</a> Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).</li><li>Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cyclotides:+A+unique+family+of+cyclic+and+knotted+proteins+that+defines+the+cyclic+cystine+knot+structural+motif.">Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif.</a> Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).</li><li>Stoecklin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+physiological+properties+of+gymnemic+acid,+the+antisaccharine+principle+of+the+leaves+of+Gymnema+sylvestre.">Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).</li><li>Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+elucidation+of+gymnemic+acids,+antisweet+principles+of+Gymnema+sylvestre.">Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre.</a> Chemical &amp; Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).</li><li>Veerapandian, R., Vediyappan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+Acids+Inhibit+Adhesive+Nanofibrillar+Mediated+Streptococcus+gordonii-Candida+albicans+Mono-Species+and+Dual-Species+Biofilms.">Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).</li><li>Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+cell+wall+proteins.">Candida albicans cell wall proteins.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).</li></ol>

Pequenas moléculas de fontes de produtos naturais (por exemplo, plantas) incluem metabólitos secundários complexos que são altamente diversos em estrutura química. Acredita-se que estejam envolvidos em mecanismos de defesa de plantas. Além disso, os polipeptídeos também estão presentes nos tecidos vegetais22. Essas pequenas moléculas de produtos naturais são fontes ricas de moléculas de teste para descoberta e desenvolvimento de drogas. No entanto, os métodos difíceis e tediosos nece...

A purificação de biomoléculas a partir de amostras biológicas complexas é um passo essencial e muitas vezes difícil em experimentos biológicos1. O foco isoelétrico (IEF) é adequado para a separação em alta resolução de biomoléculas complexas onde os amfolitos portadores viajam de acordo com sua carga e estabelecem o gradiente de pH em um campo elétrico3. O primeiro ampholyte de transportadora comercial para IEF foi desenvolvido por Olof Vesterberg em 1964 e patenteado4,5. Os amfolitos portadores são moléculas de ácido oligo-carboxílico alifático de comprimento e ramificação6. Posteriormente, Vesterberg e outros melhoraram os amóglifos portadores para seu uso expandido na separação de biomoléculas6,7.
Os métodos para separar as biomoléculas incluem eletroforese de gel de agarose e poliacrilamida, eletroforese de gel bidimensional (2-DE), foco isoelétrico, eletroforese capilar, isotacoforese e outras técnicas cromatográficas (por exemplo, TLC, FPLC, HPLC)2. O IEF de fase líquida realizado em um instrumento chamado "Rotofor" foi inventado por Milan Bier8. Ele foi pioneiro no conceito e design deste instrumento e contribuiu extensivamente para a teoria da migração eletroforética. Sua equipe também desenvolveu um modelo matemático de processo de separação eletroforética para simulações computacional9.
O aparelho IEF de fase líquida é uma célula cilíndrica rotativa horizontal, consistindo de um núcleo de nylon dividido em 20 compartimentos porosos e uma haste de cerâmica de resfriamento de água circulante. As câmaras porosas permitem que as moléculas migrem através da fase aquosa entre os eletrodos e permitem a coleta de amostras purificadas sob vácuo em frações. Este sistema de purificação pode fornecer até 1000 vezes a purificação de uma molécula específica em <4 horas. Uma característica valiosa deste instrumento é que ele pode ser aplicado como um primeiro passo para purificação a partir de uma mistura complexa ou como um passo final para alcançar a pureza10. Se a molécula de interesse é uma proteína, outra vantagem é que sua conformação nativa será mantida durante a separação.
O uso de IEF de fase líquida tem sido amplamente relatado para proteínas, enzimas e purificação de anticorpos6,10,11,12,13,14. Aqui descrevemos o uso dessa abordagem para separar e purificar pequenas moléculas e peptídeos da planta medicinal Gymnema sylvestre. Este protocolo ajudará os pesquisadores a concentrar e purificar pequenas moléculas ativas de um extrato vegetal para aplicações a jusante a baixo custo. Além disso, também demonstramos que o enriquecimento de proteínas de um complexo extrato de proteína do fungo Candida albicans 15 neste sistema baseado em IEF como segundo exemplo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisher scientfic</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207861-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 3/10 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 5/8 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact low temperature thermostat</td>
			<td>Lauda -Brinkmann</td>
			<td>RM 6T</td>
			<td>Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (3,500 MWCO)</td>
			<td>Spectrum Spectra/Por</td>
			<td>132112T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gymnema plant leaf extract powder (&#62;25% Gymnemic acids)</td>
			<td>Suan Farma, NJ USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Lab companion</td>
			<td>SI 300R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM 6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean electrophoresis</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S20</td>
			<td>Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotofor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2972</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>DH30255.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2960</td>
			<td>Scotch tape may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall legend micro 17 centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>75002432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP tissue culture plate -96 well flat bottom</td>
			<td>TPP</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method

Produtos naturais derivados de plantas e micróbios são uma rica fonte de moléculas bioativas. Antes de seu uso, as moléculas ativas de extratos complexos devem ser purificadas para aplicações a jusante. Existem vários métodos cromatográficos disponíveis para este fim, mas nem todos os laboratórios podem pagar métodos de alto desempenho e o isolamento de amostras biológicas complexas pode ser difícil. Aqui demonstramos que o foco isoelétrico de fase líquida (IEF) pode separar moléculas, incluindo pequenas moléculas e peptídeos de extratos de plantas complexas, com base em seus pontos isoelétricos (iI). Utilizamos o método para fracionamento e caracterização de amostras biológicas complexas. Como prova de conceito, fracionamos um extrato de planta gymnema sylvestre, isolando uma família de pequenas moléculas terpenoides de sapono e um peptídeo. Também demonstramos uma separação eficaz de proteína microbiana usando o fungo Candida albicans como um sistema modelo.

Separação e purificação de pequenas moléculas e peptídeos do extrato vegetal de Gymnema sylvestre Usando o método de IEF de fase líquida preparatória, fracionamos extratos de plantas medicinais e proteínas da superfície celular de um fungo patogênico humano, C. albicans. Um esquema desses protocolos de fracionamento é mostrado na Figura 1.
A partir de 20 frações de extrato g. sylvestre obtidos a partir ...

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Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method

O objetivo é fracionar e isolar pequenas moléculas bioativas, peptídeos de um complexo extrato vegetal e proteínas de micróbios patogênicos, empregando o método de focalização isoelétrica de fase líquida (IEF). Além disso, as moléculas separadas foram identificadas e sua bioatividade confirmada.

Separação de Pequenas Moléculas Bioativas, Peptídeos de Fontes Naturais e Proteínas de Micróbios pelo Método De Foco Isoelétrico Preparatório (IEF)

Natural products derived from plants and microbes are a rich source of bioactive molecules. Prior to their use, the active molecules from complex extracts ...

Nosso protocolo descreve as novas descobertas sobre a separação e purificação de moléculas ativas de um extrato vegetal. Os cientistas podem usar esses métodos para isolar pequenas moléculas e peptídeos de fontes de produtos naturais para usuários terapêuticos. Familiarize-se com os componentes do instrumento e seus métodos de montagem.É importante ter certeza de que a amostra a ser separada é preparada pelas diretrizes sugeridas. Este método envolve múltiplos processos de montagem do instrumento. E a demonstração visual ajudará os usuários a segui-los e aplicá-los com sucesso na pesquisa.Após a montagem da fase líquida, a unidade IEF, conforme descrito no manual de instruções, equilibra as membranas de troca de ânion com hidróxido de sódio molar 0,1 e as membranas de troca de cáção com ácido fosfórico molar 0,1. Alinhe as juntas de borracha para que os três grandes orifícios oblongos permaneçam desbloqueados pela borracha. Isso ajudará a trocar os íons entre o eletrodo e os compartimentos amostrais através da membrana durante a eletroforese.Monte a porção interna e externa do eletrodo alinhando os três orifícios oblongos nas juntas de troca de íons. Em seguida, encha os eletrodos com seus respectivos eletrólitos para evitar que suas membranas sequem. Em seguida, aperte o suporte do parafuso plástico para garantir um conjunto livre de vazamentos.Cubra as placas de coleta de amostras com fita de vedação. Em seguida, monte as partes da câmara de foco sobre o dedo de resfriamento cerâmico na seguinte sequência: eletrodo de ânodo, núcleo de membrana de nylon, câmara focal e eletrodo de cátodo. Usando uma seringa de 50 mililitros, encha a câmara de foco com água destilada pré-resfriada.Para uma célula IEF padrão, adicione 60 mililitros de água. Conecte a unidade IEF à água de resfriamento circulante a quatro graus Celsius. Opere a unidade a 15 watts e 3000 volts até que a tensão se estabilize, aproximadamente três a cinco minutos.Em seguida, desligue a fonte de energia. Usando o coletor de frações, remova a água da célula. Selar as placas de coleta com fita adesiva.Adicione 0,6 gramas de extrato vegetal gymnema sylvestre, a 60 mililitros de água destilada. Dissolva o extrato da planta misturando-se em um tubo de rolo por cinco minutos. Para remover as partículas insolúveis, centrifugar esta solução a 10.000 vezes G durante cinco minutos.Transfira o supernatante para um copo de vidro de 150 mililitros e adicione ampholyto para criar uma solução de 1% em volume, aproximadamente 0,6 mililitros. Usando uma seringa de 50 mililitros com uma agulha final de 1,5 polegadas de calibre 19, carregue esta solução na célula IEF através das placas de coleta de amostras. Em seguida, remova a célula do suporte e toque na câmara de eletrodos, para desalojar e remover quaisquer bolhas.Conecte a unidade à água de resfriamento. Com a fonte de alimentação para 15 Watts constantes começam o fracionamento. Execute a unidade IEF até que a tensão atinja um valor constante, aproximadamente três horas.Depois de pressionar a colheita no botão, alinhe os pinos coletores de fração com as placas de coleta. Empurre os pinos através da fita de vedação para começar a coletar as frações de gymnema sylvestre. Cresça uma única colônia de c.albicans e levedura pepitone dextrose caldo durante a noite a 30 graus Celsius com agitação.Transfira a cultura para um tubo de centrífuga e colete as células de levedura por centrifugação a 10.000 vezes G durante cinco minutos. Depois de remover o supernascimento, suspenda as células de levedura no buffer e gire a suspensão em um tubo de rolo por uma hora a cinco graus Celsius. Para remover as células de levedura, centrifugar a suspensão a 10.000 vezes G durante cinco minutos.Em seguida, filtrar o extrato de proteína através de um filtro de 0,45 micrômetros. Transfira o extrato de proteína para tubos de diálise e diálise contra água por 15 horas a quatro graus Celsius. Após estimar a concentração proteica, colete um volume de extrato de proteína contendo 500 miligramas de proteína total.Diluir os 500 miligramas de proteína em 60 mililitros de água contendo 1% de amfolito em volume. Usando uma seringa, carregue o extrato de proteína diluída na célula IEF e opere a unidade a uma constante de 15 Watts por quatro horas. Uma vez que este instrumento utiliza fornecimento elétrico de alta tensão, o usuário deve tomar todas as precauções para evitar qualquer contato direto com os eletrodos vivos.O coletor de frações contém 20 tubos plásticos, cada um 12 milímetros por 75 milímetros. E está ligado à bomba de vácuo. Prepare-se para coletar as frações pressionando a colheita no botão.Em seguida, alinhe os 20 pinos de coleta no coletor de frações com a placa de coleta de 20 para que a célula de foco lacrada. Empurre os pinos de coleta através da fita de vedação e, simultaneamente, ligue a bomba de vácuo. Cada tubo coletará uma fração de proteína de cerca de três mililitros.Depois de reduzir e ferver as frações proteicas, analise-as em um gel de página SDS de 12,5%. Manche o gel com corante Azul Coomassie e coloque-o em um roqueiro à temperatura ambiente. Depois de duas a três horas desendo o gel.Em seguida, grave a imagem em gel usando um imager de gel. Prepare uma suspensão celular de levedura diluindo uma cultura noturna de C.albicans a uma proporção de 1:1000 em meio de cultura celular RPMI suplementado com 50 milialares de glicose. Adicione 90 microliters da suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços.Em seguida, adicione 10 microliters de cada fração G.sylvestre para separar poços. Como controle negativo, adicione 10 microliters de água com 1% de amfolito em poços separados. Depois de incubar a placa de 96 poços a 37 graus Celsius durante 12 horas, observe a placa sob um microscópio.A falta de crescimento filamentoso indica a inibição da conversão de leveduras c.albicans para hifa. Vinte frações de extrato de G.sylvestre foram obtidas por IEF de fase líquida. Moléculas de cor escura, os ácidos gymnémicos, migraram para e foram enriquecidos no final do ânodo da unidade.Frações amarelas claras translúcidas foram observadas na extremidade do cátodo. As alíquotas de cada refração g.sylvestre foram reduzidas, fervidas e resolvidas pela página SDS. Uma mancha de Coomassie Blue mostrou uma banda de polipeptídeo diferente em cerca de cinco kilodaltons, enriquecido em frações 16 a 19.Os ácidos gymnémicos na fração um, e as frações seguintes não foram detectadas, pois não são proteináceos. No entanto, essas moléculas podem ser separadas por TLC e detectadas sob luz UV. A fração 10 não continha uma quantidade detectável dessas pequenas moléculas sugerindo que a maioria das pequenas moléculas orgânicas foram enriquecidas em frações de um a três.Todas as 20 frações de G.sylvestre foram avaliadas para inibição da conversão de leveduras para hipha e crescimento hifálfa em C.albicans. A maior inibição foi observada na fração um e pouca ou nenhuma inibição foi observada em frações 10 ou superiores. Proteínas de superfície celular de C.albicans foram fracionadas usando IEF de fase líquida.E as alíquotas de 18 frações foram analisadas pela página da SDS. Proteínas enriquecidas eram visíveis em várias frações. No início, pequenas moléculas não poderiam ser separadas pelo foco isoelétrico porque acredita-se que não sejam ambulatoriais.Nossos estudos mostram que eles são ambulatoriais, pelo menos semanalmente, e este método pode ser explorado ainda mais para outras pequenas moléculas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Method

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Separação de Single-stranded DNA, Double-stranded DNA e RNA de uma Comunidade Ambiental Viral Usando Cromatografia hidroxiapatita

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Imunologia e Infecção

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Uma Introdução à Vespas parasitas de<em&gt; Drosophila</em&gt; E Resposta Imune a antiparasitários

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Imagem quantitativa da linhagem específica Toll-like receptor-mediados sinalização em monócitos e células dendríticas a partir de pequenas amostras de sangue humano

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separação de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Fase Tardia eritrócitos infectados por meio magnético

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

A separação automática de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variably Colonizada por um patógeno bacteriano

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

As células T Capturar Bactérias por Transinfection das dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caracterização fenotípica dos macrófagos a partir de rim de rato por Citometria de Fluxo

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...