Name: separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method
Uploaded: 2020-06-14T14:00:00
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Estamos agradecidos por las fuentes de financiamiento de la División de Biología y Johnson Cancer Research Center para los premios BRIEF y IRA, respectivamente a GV. También agradecemos el premio postdoctoral K-INBRE a RV. Este trabajo fue apoyado en parte por el Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención P20 GM103418. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales o de los Institutos Nacionales de Salud. Agradecemos a los revisores anónimos por sus comentarios útiles.

1. Configuración y prerugiendo de la unidad IEF de fase líquida estándar
<ol><li>Montar los electrodos IEF de fase líquida (botón de ánodo-rojo y botón catódo-negro) con sus respectivas membranas de intercambio de acuerdo con el manual de instrucciones (ver Tabla de materiales). Equilibrar las membranas de intercambio de aniones con 0,1 M NaOH y las membranas de intercambio catiónicos con 0,1 M H3PO4 al menos durante 16 h cuando se utilizan nuevas membranas.<ol>
<li>Conse...

<ol>
	<li>Jankowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedure+of+extraction,+purification+and+proteomic+analysis+of+nuclear+proteins+from+mouse+brain.">Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).</li><li>Pergande, M. R., Cologna, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+Point+Separations+of+Peptides+and+Proteins.">Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins.</a> Proteomes. 5 (1), (2017).</li><li>Stoyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IEF-based+multidimensional+applications+in+proteomics:+toward+higher+resolution.">IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution.</a> Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).</li><li>Vesterberg, O. A. 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D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Monoclonal+Antibody+Charge+Variants+by+Free+Flow+Isoelectric+Focusing.">Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing.</a> Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).</li><li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+T-cell+antigen+identification+using+humanized+HLA-DR4+transgenic+mice.">Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice.</a> Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).</li><li>Riyong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+charge+antigens+of+Dirofilaria+immitis+adult+worm+for+IgG-ELISA+diagnosis+of+bancroftian+filariasis.">Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis.</a> Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).</li><li>Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+proteins+of+Candida+albicans:+preparation+of+extracts+and+improved+detection+of+proteins.">Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins.</a> Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).</li><li>Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+acids+inhibit+hyphal+growth+and+virulence+in+Candida+albicans.">Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans.</a> PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+ampholytes+used+for+isoelectric+focusing+may+interfere+with+bioactivity+based+purification+of+antimicrobial+peptides.">Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).</li><li>Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-Acid-Sequence+of+Sweet-Taste-Suppressing+Peptide+(Gurmarin)+from+the+Leaves+of+Gymnema-Sylvestre.">Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre.</a> Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).</li><li>Craik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry.+Seamless+proteins+tie+up+their+loose+ends.">Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends.</a> Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).</li><li>Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cyclotides:+A+unique+family+of+cyclic+and+knotted+proteins+that+defines+the+cyclic+cystine+knot+structural+motif.">Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif.</a> Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).</li><li>Stoecklin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+physiological+properties+of+gymnemic+acid,+the+antisaccharine+principle+of+the+leaves+of+Gymnema+sylvestre.">Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).</li><li>Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+elucidation+of+gymnemic+acids,+antisweet+principles+of+Gymnema+sylvestre.">Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre.</a> Chemical &amp; Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).</li><li>Veerapandian, R., Vediyappan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+Acids+Inhibit+Adhesive+Nanofibrillar+Mediated+Streptococcus+gordonii-Candida+albicans+Mono-Species+and+Dual-Species+Biofilms.">Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).</li><li>Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+cell+wall+proteins.">Candida albicans cell wall proteins.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).</li></ol>

Las moléculas pequeñas de fuentes de productos naturales (por ejemplo, plantas) incluyen metabolitos secundarios complejos que son muy diversos en la estructura química. Se cree que están involucrados en los mecanismos de defensa de las plantas. Además, los polipéptidos también están presentes en los tejidos vegetales22. Estas moléculas pequeñas de producto natural son ricas fuentes de moléculas de prueba para el descubrimiento y desarrollo de fármacos. Sin embargo, los métodos difíc...

La purificación de biomoléculas a partir de muestras biológicas complejas es un paso esencial y a menudo difícil en los experimentos biológicos1. El enfoque isoeléctrico (IEF) es adecuado para la separación de alta resolución de biomoléculas complejas donde los anfieles portadores viajan de acuerdo con su carga y establecen el gradiente de pH en un campo eléctrico3. El primer ampholyte de soporte comercial para IEF fue desarrollado por Olof Vesterberg en 1964 y patentado4,5. Los anfólitos portadores son moléculas de ácido oligo-amino oligo-carboxílico alifático de longitud variable y ramificación6. Posteriormente, Vesterberg y otros mejoraron los anfilitos portadores para su uso ampliado en la separación de biomoléculas6,7.
Los métodos para separar las biomoléculas incluyen la electroforesis de gel de agarosa y policrilamida, la electroforesis de gel bidimensional (2-DE), el enfoque isoeléctrico, la electroforesis capilar, la isotachoforesis y otras técnicas cromatográficas (por ejemplo, TLC, FPLC, HPLC)2. IEF de fase líquida interpretado en un instrumento llamado "Rotofor" fue inventado por el Milan Bier8. Fue pionero en el concepto y diseño de este instrumento y contribuyó ampliamente a la teoría de la migración electroforética. Su equipo también desarrolló un modelo matemático de proceso de separación electroforética para simulaciones por ordenador9.
El aparato IEF de fase líquida es una célula cilíndrica giratoria horizontal que consiste en un núcleo de nylon dividido en 20 compartimentos porosos y una varilla de cerámica de enfriamiento de agua circulante. Las cámaras porosas permiten que las moléculas migren a través de la fase acuosa entre los electrodos y permiten la recolección de muestras purificadas al vacío en fracciones. Este sistema de purificación puede proporcionar hasta 1000 veces la purificación de una molécula específica en <4 horas. Una característica valiosa de este instrumento es que se puede aplicar como un primer paso para la purificación de una mezcla compleja o como paso final para lograr la pureza10. Si la molécula de interés es una proteína, otra ventaja es que su conformación nativa se mantendrá durante la separación.
El uso de IEF de fase líquida se ha notificado ampliamente para proteínas, enzimas y purificación de anticuerpos6,10,11,12,13,14. Aquí describimos el uso de este enfoque para separar y purificar pequeñas moléculas y péptidos de la planta medicinal Gymnema sylvestre. Este protocolo ayudará a los investigadores a concentrar y purificar moléculas pequeñas activas de un extracto de planta para aplicaciones posteriores a bajo costo. Además, también demostramos que el enriquecimiento de proteínas de un extracto de proteína complejo del hongo Candida albicans 15 en este sistema basado en IEF como segundo ejemplo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisher scientfic</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207861-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 3/10 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 5/8 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact low temperature thermostat</td>
			<td>Lauda -Brinkmann</td>
			<td>RM 6T</td>
			<td>Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (3,500 MWCO)</td>
			<td>Spectrum Spectra/Por</td>
			<td>132112T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gymnema plant leaf extract powder (&#62;25% Gymnemic acids)</td>
			<td>Suan Farma, NJ USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Lab companion</td>
			<td>SI 300R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM 6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean electrophoresis</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S20</td>
			<td>Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotofor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2972</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>DH30255.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2960</td>
			<td>Scotch tape may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall legend micro 17 centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>75002432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP tissue culture plate -96 well flat bottom</td>
			<td>TPP</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method

Los productos naturales derivados de plantas y microbios son una rica fuente de moléculas bioactivas. Antes de su uso, las moléculas activas de extractos complejos deben purificarse para aplicaciones posteriores. Hay varios métodos cromatográficos disponibles para este propósito, pero no todos los laboratorios pueden permitirse métodos de alto rendimiento y el aislamiento de muestras biológicas complejas puede ser difícil. Aquí demostramos que el enfoque isoeléctrico de fase líquida preparatoria (IEF) puede separar moléculas, incluyendo moléculas pequeñas y péptidos de extractos de plantas complejas, basados en sus puntos isoeléctricos (pI). Hemos utilizado el método para la fraccionamiento y caracterización de muestras biológicas complejas. Como prueba de concepto, fraccionamos un extracto de planta de Gymnema sylvestre, aislando una familia de saponina terpenoides pequeñas moléculas y un péptido. También demostramos una separación eficaz de las proteínas microbianas utilizando el hongo Candida albicans como sistema modelo.

Separación y purificación de moléculas pequeñas y péptidos del extracto de la planta Gymnema sylvestre Utilizando el método IEF de fase líquida preparatoria, fraccionamos extractos de plantas medicinales y proteínas de superficie celular de un hongo patógeno humano, C. albicans. Un esquema de estos protocolos de fraccionamiento se muestra en la Figura 1.
A partir de 20 fracciones de extracto de G. sylvestre obteni...

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Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method

El objetivo es fraccionar y aislar moléculas pequeñas bioactivas, péptidos de un extracto de planta complejo y proteínas de microbios patógenos mediante el empleo de un método de enfoque isoeléctrico de fase líquida (IEF). Además, se identificaron las moléculas separadas y se confirmó su bioactividad.

Separación de Moléculas Pequeñas Bioactivas, Péptidos de Fuentes Naturales y Proteínas de Microbios por Método de Enfoque Isoeléctrico Preparativo (IEF)

Natural products derived from plants and microbes are a rich source of bioactive molecules. Prior to their use, the active molecules from complex extracts ...

Nuestro protocolo describe los nuevos hallazgos sobre la separación y purificación de moléculas activas de un extracto de planta. Los científicos pueden utilizar estos métodos para aislar moléculas pequeñas y péptidos de fuentes de productos naturales para los usuarios terapéuticos. Familiarícese con los componentes del instrumento y sus métodos de montaje.Es importante estar seguro de que la muestra que se va a separar está preparada siguiendo las directrices sugeridas. Este método implica múltiples procesos de montaje del instrumento. Y la demostración visual ayudará a los usuarios a seguir y aplicarlos con éxito a la investigación.Después de ensamblar la fase líquida, la unidad IEF como se describe en el manual de instrucciones, equilibre las membranas de intercambio de aniones con hidróxido de sodio molar 0.1 y las membranas de intercambio catiónico con ácido fosfórico molar 0.1. Alinee las juntas de goma para que los tres agujeros oblongos grandes permanezcan desbloqueados por el caucho. Esto ayudará a intercambiar los iones entre el electrodo y los compartimentos de la muestra a través de la membrana durante la electroforesis.Montar la parte interior y externa del electrodo alineando los tres orificios oblongos en las juntas de intercambio iónico. A continuación, llene los electrodos con sus respectivos electrolitos para evitar que sus membranas se sequen. A continuación, apriete el soporte del tornillo de plástico para asegurar un montaje sin fugas.Cubra las placas de recogida de muestras con cinta adhesiva. A continuación, ensamble las partes de la cámara de enfoque sobre el dedo de enfriamiento de cerámica en la siguiente secuencia: electrodo de ánodo, núcleo de membrana de nylon, cámara de enfoque y electrodo de cátodo. Con una jeringa de 50 mililitros, llene la cámara de enfoque con agua destilada preenfriada.Para una celda IEF estándar, agregue 60 mililitros de agua. Conecte la unidad IEF al agua de refrigeración circulante a cuatro grados centígrados. Accione la unidad a 15 vatios y 3000 voltios hasta que la tensión se estabilice, aproximadamente de tres a cinco minutos.A continuación, apague la fuente de alimentación. Con el colector de fracción, retire el agua de la celda. Vuelva a sellar las placas de recogida con cinta adhesiva.Añadir 0,6 gramos de extracto de la planta de gimnasia, a 60 mililitros de agua destilada. Disuelva el extracto de la planta mezclando en un tubo de rodillo durante cinco minutos. Para eliminar las partículas insolubles, centrifuga esta solución a 10.000 veces G durante cinco minutos.Transfiera el sobrenadante a un vaso de vidrio de 150 mililitros y agregue el anzuelo para crear una solución del 1% por volumen, aproximadamente 0,6 mililitros. Con una jeringa de 50 mililitros con una aguja de extremo romo de calibre 1,5 pulgadas y 19, cargue esta solución en la célula IEF a través de las placas de recogida de muestras. A continuación, retire la célula del soporte y toque la cámara del electrodo, para desalojar y eliminar cualquier burbuja.Conecte la unidad al agua de refrigeración. Con la fuente de alimentación a 15 vatios constantes iniciar fraccionamiento. Ejecute la unidad IEF hasta que la tensión alcance un valor constante, aproximadamente tres horas.Después de pulsar el botón harvest on align the fraction collector pins with the collection boards. Empuje los pasadores a través de la cinta de sellado para comenzar a recoger las fracciones de andaluza Gymnema. Cultivar una sola colonia de C.albicans y caldo de dextrosa de mezptona de levadura durante la noche a 30 grados centígrados con temblores.Transfiera el cultivo a un tubo centrífugo y recoja las células de levadura por centrifugación a 10.000 veces G durante cinco minutos. Después de retirar el sobrenadante, suspenda las células de levadura en el tampón y gire la suspensión en un tubo de rodillos durante una hora a cinco grados centígrados. Para eliminar las células de levadura, centrifugar la suspensión a 10.000 veces G durante cinco minutos.A continuación, filtre el extracto de proteína a través de un filtro de 0,45 micrómetros. Transfiera el extracto de proteína a tubos de diálisis y dialízalo contra el agua durante 15 horas a cuatro grados centígrados. Después de estimar la concentración de proteínas, recoger un volumen de extracto de proteína que contiene 500 miligramos de proteína total.Diluir los 500 miligramos de proteína en 60 mililitros de agua que contiene 1%ampholyte por volumen. Con una jeringa, cargue el extracto de proteína diluida en la célula IEF y opere la unidad a una temperatura constante de 15 vatios durante cuatro horas. Dado que este instrumento utiliza alimentación eléctrica de alta tensión, el usuario debe tomar todas las precauciones para evitar cualquier contacto directo con los electrodos en vivo.El colector de fracción contiene 20 tubos de plástico, cada uno de 12 milímetros por 75 milímetros. Y está conectado a la bomba de vacío. Prepárese para recoger las fracciones pulsando el botón de cosecha.A continuación, alinee los 20 pines de colección en el colector de fracción con la placa de recolección 20 para que la celda de enfoque sellada. Empuje los pasadores de recogida a través de la cinta de sellado y encienda simultáneamente la bomba de vacío. Cada tubo recogerá una fracción proteica de unos tres mililitros.Después de reducir y hervir las fracciones proteicas, analízalas en un gel de página 12.5%SDS. Mancha el gel con tinte Coomassie Blue y colóquelo en un balancín a temperatura ambiente. Después de dos o tres horas, detenga el gel.A continuación, grabe la imagen de gel con un imager de gel. Preparar una suspensión de células de levadura diluyendo un cultivo nocturno de C.albicans en una proporción de 1:1000 en el medio de cultivo celular RPMI complementado con 50 glucosa milimolar. Agregue 90 microlitros de la suspensión celular a cada pozo de una placa de 96 pozos.A continuación, agregue 10 microlitros de cada fracción G.sylvestre para separar los pozos. Como control negativo, agregue 10 microlitros de agua con un 1% de ampolla en pozos separados. Después de incubar la placa de 96 pozos a 37 grados Celsius durante 12 horas, observe la placa bajo un microscopio.La falta de crecimiento filamentoso indica la inhibición de la conversión de C.albicans de levadura a hifa. Veinte fracciones de extracto de G.sylvestre se obtuvieron por fase líquida IEF. Las moléculas de color oscuro, los ácidos gimnómicos, migraron y se enriquecieron en el extremo del ánodo de la unidad.En el extremo del cátodo se observaron fracciones translúcidas de color amarillo claro. Las alícuotas de cada refracción G.sylvestre se redujeron, herviron y resolvieron por la página SDS. Una mancha Coomassie Blue mostraba una banda de polipéptidos diferente a unos cinco kilodaltons, enriquecida en fracciones de 16 a 19.Los ácidos gimnómicos en la fracción uno, y las siguientes fracciones no fueron detectados ya que no son proteicos. Sin embargo, estas moléculas pueden ser separadas por TLC y detectadas bajo la luz UV. La Fracción 10 no contenía una cantidad detectable de estas moléculas pequeñas, lo que sugiere que la mayoría de las moléculas pequeñas orgánicas se enriquecieron en las fracciones del uno al tres.Las 20 fracciones de G.sylvestre fueron ensayadas para la inhibición de la conversión de levadura a hifa y el crecimiento de hipófas en C.albicans. La mayor inhibición se observó en la fracción uno y se observó poca o ninguna inhibición en las fracciones 10 y superiores. Las proteínas de la superficie celular de C.albicans fueron fraccionadas usando fase líquida IEF.Y las alícuotas de 18 fracciones fueron analizadas por la página SDS. Las proteínas enriquecidas eran visibles en varias fracciones. El comienzo, moléculas pequeñas no podrían ser separados por enfoque isoeléctrico porque se cree que no son ambulatorias.Nuestros estudios muestran que son ambulatorios, al menos semanales, y este método se puede explorar más a fondo para otras moléculas pequeñas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Method

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

La separación de una sola hebra de ADN, el ADN de doble cadena y el ARN de una comunidad ambiental viral mediante cromatografía de hidroxiapatita

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Investigación

Inmunología e Infección

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Una introducción a las avispas parasitarias de<em&gt; Drosophila</em&gt; Y la respuesta inmune antiparasitario

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Imagen cuantitativa de linaje específico Toll-like receptor-mediada por la señalización en los monocitos y células dendríticas de pequeñas muestras de sangre humana

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separación de los<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-eritrocitos infectados por medios magnéticos

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

La separación automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variablemente colonizada por un patógeno bacteriano

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Células T Captura bacterias por transinfection de células dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caracterización fenotípica de los macrófagos a partir de riñón de rata por Citometría de Flujo

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...