Name: separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method
Uploaded: 2020-06-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method at JoVE.com

Vi är tacksamma för finansieringskällorna från Avdelningen för biologi och Johnson Cancer Research Center för BRIEF och IRA utmärkelser, respektive till GV. Vi tackar också K-INBRE postdoc award till RV. Detta arbete stöddes delvis av Institutional Development Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under bidragsnummer P20 GM103418. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna hos National Institute of General Medical Sciences eller National Institutes of Health. Vi tackar anonyma granskare för deras hjälpsamma kommentarer.

1. Installation och förkörning av standard IEF-enhet i vätskefas
<ol><li>Montera IEF-elektroderna i vätskefasen (anodröd knapp och katodsvart knapp) med sina respektive utbytesmembran enligt bruksanvisningen (se Tabell över material). Jämvikta anjonbytarmembranen med 0,1 M NaOH och katjonbytesmembranen med 0,1 M H3PO4 minst 16 timmar när nya membran används.<ol>
<li>Förvara membranen i elektrolyter (0,1 M NaOH eller 0,1 M H3PO4) mellan körningarna ...

<ol>
	<li>Jankowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedure+of+extraction,+purification+and+proteomic+analysis+of+nuclear+proteins+from+mouse+brain.">Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).</li><li>Pergande, M. R., Cologna, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+Point+Separations+of+Peptides+and+Proteins.">Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins.</a> Proteomes. 5 (1), (2017).</li><li>Stoyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IEF-based+multidimensional+applications+in+proteomics:+toward+higher+resolution.">IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution.</a> Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).</li><li>Vesterberg, O. A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method of Isoelectric Fractionation. , (1964).</li><li>Vesterberg, O., Svensson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+fractionation,+analysis,+and+characterization+of+ampholytes+in+natural+pH+gradients.+IV.+Further+studies+on+the+resolving+power+in+connection+with+separation+of+myoglobins.">Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins.</a> Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).</li><li>Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , 1 (1983).</li><li>Vesterberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Isoelectric+Fractionation+of+Carrier+Ampholytes.">Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes.</a> Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).</li><li>Bier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+isoelectric+focusing+and+isotachophoresis.">Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis.</a> Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).</li><li>Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis:+mathematical+modeling+and+computer+simulation.">Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation.</a> Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).</li><li>Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Rotofor+preparative+isoelectrofocusing+cell+in+protein+purification+procedure.">Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).</li><li>Wagner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+dipeptidyl+peptidase+IV+(DP+4)+isoforms+from+porcine+kidney+by+preparative+isoelectric+focusing+to+improve+crystallization.">Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization.</a> Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).</li><li>Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Monoclonal+Antibody+Charge+Variants+by+Free+Flow+Isoelectric+Focusing.">Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing.</a> Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).</li><li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+T-cell+antigen+identification+using+humanized+HLA-DR4+transgenic+mice.">Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice.</a> Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).</li><li>Riyong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+charge+antigens+of+Dirofilaria+immitis+adult+worm+for+IgG-ELISA+diagnosis+of+bancroftian+filariasis.">Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis.</a> Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).</li><li>Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+proteins+of+Candida+albicans:+preparation+of+extracts+and+improved+detection+of+proteins.">Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins.</a> Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).</li><li>Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+acids+inhibit+hyphal+growth+and+virulence+in+Candida+albicans.">Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans.</a> PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+ampholytes+used+for+isoelectric+focusing+may+interfere+with+bioactivity+based+purification+of+antimicrobial+peptides.">Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).</li><li>Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-Acid-Sequence+of+Sweet-Taste-Suppressing+Peptide+(Gurmarin)+from+the+Leaves+of+Gymnema-Sylvestre.">Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre.</a> Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).</li><li>Craik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry.+Seamless+proteins+tie+up+their+loose+ends.">Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends.</a> Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).</li><li>Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cyclotides:+A+unique+family+of+cyclic+and+knotted+proteins+that+defines+the+cyclic+cystine+knot+structural+motif.">Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif.</a> Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).</li><li>Stoecklin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+physiological+properties+of+gymnemic+acid,+the+antisaccharine+principle+of+the+leaves+of+Gymnema+sylvestre.">Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).</li><li>Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+elucidation+of+gymnemic+acids,+antisweet+principles+of+Gymnema+sylvestre.">Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre.</a> Chemical &amp; Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).</li><li>Veerapandian, R., Vediyappan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+Acids+Inhibit+Adhesive+Nanofibrillar+Mediated+Streptococcus+gordonii-Candida+albicans+Mono-Species+and+Dual-Species+Biofilms.">Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).</li><li>Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+cell+wall+proteins.">Candida albicans cell wall proteins.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).</li></ol>

Små molekyler från naturliga produktkällor (t.ex. växter) inkluderar komplexa sekundära metaboliter som är mycket olika i kemisk struktur. De tros vara inblandade i växtförsvarsmekanismer. Dessutom finns polypeptider också iväxtvävnader 22. Dessa naturliga produkt små molekyler är rika källor till testmolekyler för läkemedelsupptäckt och utveckling. De svåra och tråkiga metoder som krävs för deras isolering och rening begränsar dock deras användning för terapeutiska tilläm...

Rening av biomolekyler från komplexa biologiska prover är ett viktigt och ofta svårt steg i biologiska experiment1. Isoelektrisk fokusering (IEF) är väl lämpad för högupplöst separation av komplexa biomolekyler där bäraramkulterna färdas enligt deras laddning och upprättar pH-lutningen i ett elektriskt fält3. Den första kommersiella transportören ampholyte för IEF utvecklades av Olof Vesterberg 1964 och patenterade4,5. Bärarens ampholyter är alifatiska oligo-amino oligo-karboxylsyra molekyler av varierande längd och förgrening6. Därefter förbättrade Vesterberg m.fl.6,7
Metoder för att separera biomolekyler inkluderar agaros och polyakrylamid gel elektrofores, tvådimensionell gel elektrofores (2-DE), isoelektrisk fokusering, kapillär elektrofores, isotachophoresis och andra kromatografiska tekniker (t.ex., TLC, FPLC, HPLC)2. IEF i flytande fas som utfördes i ett instrument som kallas "Rotofor" uppfanns av Milan Bier8. Han banade väg för konceptet och designen av detta instrument och bidrog i stor utsträckning till teorin om elektroforesisk migration. Hans team utvecklade också en matematisk modell av elektroforesisk separationsprocess för datorsimuleringar9.
IEF-apparaten i flytande fas är en horisontellt roterande cylindrisk cell bestående av en nylonkärna uppdelad i 20 porösa fack och en cirkulerande vattenkylning keramisk stång. De porösa kamrarna gör det möjligt för molekyler att migrera genom vattenfasen mellan elektroderna och tillåta insamling av renade prover under vakuum i fraktioner. Detta reningssystem kan ge upp till 1000-faldig rening av en specifik molekyl i <4 timmar. Ett värdefullt inslag i detta instrument är att det kan tillämpas som ett första steg för rening från en komplex blandning eller som ett sista steg för att uppnå renhet10. Om molekylen av intresse är ett protein, en annan fördel är att dess inhemska konformation kommer att upprätthållas under separationen.
Användningen av vätskefas IEF har rapporterats i stor utsträckning för proteiner, enzymer och antikroppsrening6,,10,,11,12,13,14. Här beskriver vi användningen av detta tillvägagångssätt för att separera och rena små molekyler och peptider från medicinalväxten Gymnema sylvestre. Detta protokoll kommer att hjälpa forskare att koncentrera och rena aktiva små molekyler från ett växtextrakt för nedströms applikationer till låg kostnad. Dessutom visar vi också att anrikning av proteiner från ett komplext proteinextrakt från Candida albicans svamp15 i detta IEF-baserade system som ett andra exempel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisher scientfic</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207861-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 3/10 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 5/8 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact low temperature thermostat</td>
			<td>Lauda -Brinkmann</td>
			<td>RM 6T</td>
			<td>Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (3,500 MWCO)</td>
			<td>Spectrum Spectra/Por</td>
			<td>132112T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gymnema plant leaf extract powder (&#62;25% Gymnemic acids)</td>
			<td>Suan Farma, NJ USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Lab companion</td>
			<td>SI 300R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM 6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean electrophoresis</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S20</td>
			<td>Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotofor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2972</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>DH30255.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2960</td>
			<td>Scotch tape may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall legend micro 17 centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>75002432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP tissue culture plate -96 well flat bottom</td>
			<td>TPP</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method

Naturliga produkter som härrör från växter och mikrober är en rik källa till bioaktiva molekyler. Före användningen måste de aktiva molekylerna från komplexa extrakt renas för nedströmsapplikationer. Det finns olika kromatografiska metoder tillgängliga för detta ändamål men inte alla laboratorier har råd med högpresterande metoder och isolering från komplexa biologiska prover kan vara svårt. Här visar vi att preparativ vätskefas isoelektrisk fokusering (IEF) kan separera molekyler, inklusive små molekyler och peptider från komplexa växtextrakt, baserat på deras isoelektriska punkter (pI). Vi har använt metoden för komplexa biologiska provfraktionering och karakterisering. Som ett proof of concept, fraktionerade vi en Gymnema sylvestre växtextrakt, isolera en familj av terpenoid saponin små molekyler och en peptid. Vi visade också effektiv mikrobiell proteinseparation med Candida albicans svamp som modellsystem.

Separation och rening av små molekyler och peptider från Gymnema sylvestre växtextrakt Med hjälp av den förberedande vätskefasen IEF-metoden fraktionerade vi medicinska växtextrakt och cellytproteiner från en human patogen svamp, C. albicans. Ett schema för dessa fraktioneringsprotokoll visas i figur 1.
Från 20 fraktioner av G. sylvestre extrakt som erhållits från flytande fas IEF, de mörkfärgade molekyl...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method at JoVE.com

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method

Målet är att fraktionera och isolera bioaktiva små molekyler, peptider från ett komplext växtextrakt och proteiner från patogena mikrober genom att använda ief-metoden (liquid-phase isoelectric focusing). Vidare identifierades de separerade molekylerna och deras bioaktivitet bekräftades.

Separation av bioaktiva små molekyler, peptider från naturliga källor och proteiner från mikrober med Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Metod

Natural products derived from plants and microbes are a rich source of bioactive molecules. Prior to their use, the active molecules from complex extracts ...

Vårt protokoll beskriver de nya rönen om separation och rening av aktiva molekyler från ett växtextrakt. Forskare kan använda dessa metoder för att isolera små molekyler och peptider från naturliga produktkällor för terapeutiska användare. Bekanta dig med instrumentkomponenterna och deras monteringsmetoder.Det är viktigt att vara säker, att provet som skall separeras utarbetas av de föreslagna riktlinjerna. Denna metod innebär flera monteringsprocesser av instrumentet. Och den visuella demonstrationen kommer att hjälpa användarna att följa och framgångsrikt tillämpa dem på forskningen.Efter montering av vätskefasen, IEF-enhet enligt beskrivningen i instruktionsboken, jämviktsvinorna för anjonutbyte med 0,1 molar natriumhydroxid och katjonbytarmembranen med 0,1 molar fosforsyra. Rikta in gummipackningarna så att de tre stora avlånga hålen förblir oblockerade av gummit. Detta kommer att bidra till att utbyta jonerna mellan elektroden och provfacken via membranet under elektrofores.Montera ihop elektrodens inre och yttre del genom att rikta in de tre avlånga hålen i jonbytarpackningarna. Fyll sedan elektroderna med sina respektive elektrolyter för att förhindra att deras membran torkar ut. Därefter drar du åt plastskruvhållaren för att säkerställa en läckagefri montering.Täck över provuppsamlingstavlorna med tätningstejp. Nästa montera delar av fokuseringskammaren över keramiska kylfingret i följande sekvens:anodelektrod, nylon membrankärna, fokuseringskammare och katodelektrod. Med hjälp av en 50 milliliter spruta fyller du fokuseringskammaren med färdigkylt destillerat vatten.För en vanlig IEF-cell, tillsätt 60 milliliter vatten. Anslut IEF-enheten till cirkulerande kylvatten vid fyra grader Celsius. Manövrera enheten på 15 watt och 3000 volt tills spänningen stabiliseras, cirka tre till fem minuter.Stäng sedan av strömkällan. Använd fraktionsuppsamlaren, ta bort vattnet från cellen. Åter försegla uppsamlingsbrädorna med tätningstejp.Tillsätt 0,6 gram Gymnema sylvestre växtextrakt, till 60 milliliter av destillerat vatten. Lös upp växtextraktet genom att blanda i ett rullrör i fem minuter. För att avlägsna de olösliga partiklarna, centrifug denna lösning vid 10, 000 gånger G i fem minuter.Överför supernatanten till en glasbägare på 150 milliliter och tillsätt ampholyt för att skapa en volymlösning på 1 %, cirka 0,6 milliliter. Med hjälp av en 50 milliliter spruta med en 1,5 tums 19 gauge trubbig ändnål, ladda denna lösning i IEF cellen genom prov uppsamling styrelser. Ta sedan bort cellen från stativet och knacka på elektrodkammaren, för att rubba och ta bort eventuella bubblor.Anslut enheten till kylvattnet. Med strömförsörjningen till konstant 15 Watts börja fraktionering. Kör IEF-enheten tills spänningen når ett konstant värde, cirka tre timmar.Efter att ha tryckt på skörden på knappen anpassa fraktionen samlarstift med uppsamlingstavlorna. Tryck stiften genom tätningstejpen för att börja samla in Gymnema sylvestre fraktioner. Odla en enda koloni av C.albicans och jäst pepitone dextrose buljong över natten vid 30 grader Celsius med skakningar.Överför kulturen till ett centrifugrör och samla jästcellerna genom centrifugering vid 10, 000 gånger G i fem minuter. Efter att du tagit bort supernatanten, suspender jästcellerna i buffert och rotera suspensionen i ett rullrör i en timme vid fem grader Celsius. För att avlägsna jästcellerna, centrifug suspensionen vid 10, 000 gånger G i fem minuter.Filtrera sedan proteinextraktet genom ett 0,45 mikrometerfilter. Överför proteinextraktet till dialysrör och dialys mot vatten i 15 timmar vid fyra grader Celsius. Efter att ha skattat proteinkoncentrationen, samla en volym proteinextrakt som innehåller 500 milligram totalt protein.Späd 500 milligram protein i 60 milliliter vatten som innehåller 1%ampholyte volymprocent. Med hjälp av en spruta, ladda det utspädda proteinextraktet i IEF-cellen och manövrera enheten med konstant 15 Watt i fyra timmar. Eftersom detta instrument använder högspänningselektrisk matning måste användaren vidta alla försiktighetsåtgärder för att undvika all direkt kontakt med de levande elektroderna.Fraktionsuppsamlaren innehåller 20 plaströr, vardera 12 millimeter med 75 millimeter. Och den är ansluten till vakuumpumpen. Förbered att samla in fraktionerna genom att trycka på skörden på knappen.Sedan anpassa 20 samling stift på fraktionen samlare med 20 samlingstavlan så den förseglade fokuseringscell. Tryck in uppsamlingsstiften genom tätningstejpen och slå samtidigt på vakuumpumpen. Varje rör kommer att samla en proteinfraktion på cirka tre milliliter.Efter att minska och koka proteinfraktionerna, analysera dem på en 12,5%SDS sida gel. Fläck gelen med Coomassie Blue färgämne och placera den på en vipp i rumstemperatur. Efter två till tre timmar destain gelen.Spela sedan in gelbilden med hjälp av en gelbildare. Förbered en jästcell suspension genom att späda en övernattning kultur av C.albicans på en 1:1000 förhållandet i RPMI cell kultur medium kompletteras med 50 millimol glukos. Tillsätt 90 mikroliter av cellupphängningen till varje brunn av en 96 brunnsplatta.Därefter lägger du till 10 mikroliter av varje G.sylvestre-fraktion för att separera brunnar. Som en negativ kontroll, tillsätt 10 mikroliter vatten med 1%ampholyte i separata brunnar. Efter inkubering av 96 brunnsplattan vid 37 grader Celsius i 12 timmar, observera plattan under ett mikroskop.Bristen på fintrådig tillväxt indikerar hämning av C.albicans jäst-till-hypha konvertering. Tjugo fraktioner av G.sylvestre extrakt erhölls genom flytande fas IEF. Mörka färgade molekyler, de gymnemic syrorna, migrerade till och berikades vid anod slutet av enheten.Genomskinliga ljusgula fraktioner observerades vid katodänden. Aliquots från varje G.sylvestre refraktion reducerades, kokades och lösas av SDS sida. En Coomassie Blue fläck visade en annan polypeptid band på cirka fem kilodalton, berikad i fraktioner 16 till 19.Den Gymnemic syror i fraktion ett, och de närmaste fraktionerna upptäcktes inte eftersom de inte är proteinhaltiga. Dessa molekyler kan dock separeras av TLC och detekteras under UV-ljus. Fraktion 10 innehöll inte en detekterbar mängd av dessa små molekyler tyder på att de flesta av de organiska små molekylerna berikades i fraktioner ett till tre.Alla 20 G.sylvestre fraktioner var assayed för hämning av jäst-till-hypha konvertering och hyphal tillväxt i C.albicans. Den största hämningen observerades i fraktion ett och liten till ingen hämning observerades i fraktioner 10 och uppåt. Cell ytan proteiner från C.albicans var fraktionerad med hjälp av flytande fas IEF.Och alikvoter från 18 fraktioner analyserades av SDS sida. Berikade proteiner var synliga i flera fraktioner. Starten, små molekyler kunde inte separeras av isoelektrisk fokusering eftersom de tros vara icke-ambulatorisk.Våra studier visar att de är ambulatoriska, åtminstone varje vecka, och denna metod kan utforskas ytterligare för andra små molekyler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Method

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Separation av enda DNA, dubbel-strängat DNA och RNA ur miljösynpunkt Viral gemenskapen med hjälp av hydroxyapatit Kromatografi

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

En introduktion till parasitsteklar av<em&gt; Drosophila</em&gt; Och Antiparasite immunsvar

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Kvantitativ avbildning av Lineage-specifika Toll-like receptor-medierad signalering i monocyter och dendritiska celler från små Prover av blod

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Sent skede-infekterade erytrocyter genom magnetiska organ

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automatiserad Separation av<em&gt; C. elegans</em&gt; Steglös koloniseras av en bakteriell patogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T-celler Fånga Bakterier från Transinfection från dendritiska celler

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimerad metod för att isolera och utöka Invariant Natural Killer T-celler från musmjälte

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolering av infiltrerande leukocyter från mus Skin Använda Enzymatisk Digest och Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Inrättandet av en hög kapacitet Setup för screening av små molekyler som modulerar c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk karakterisering av makrofager från råttnjure med flödescytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...