Name: separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method
Uploaded: 2020-06-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method at JoVE.com

Biz Biyoloji Bölümü ve Johnson Kanser Araştırma Merkezi BRIEF ve IRA ödülleri için, sırasıyla GV için finansman kaynakları için müteşekkiriz. Ayrıca RV için K-INBRE doktora sonrası ödül teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen P20 GM103418 hibe numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) tarafından desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nün veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Biz yararlı yorumlar için anonim yorumcular teşekkür ederiz.

1. Standart sıvı fazlı IEF ünitesinin kurulumu ve ön çalıştırımı
<ol><li>Sıvı fazlı IEF elektrotlarını (ano-kırmızı düğme ve katot-siyah düğme) kullanım kılavuzuna göre kendi değişim membranları ile birleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Yeni membranlar kullanıldığında anyon değişim membranlarını 0,1 M NaOH ve 0,1 M H3PO4 ile katyon değişim membranlarını en az 16 saat e-posta ile dengeleyin.<ol>
<li>Membranları elektrolitlerde (0,1 M NaOH ve...

<ol>
	<li>Jankowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedure+of+extraction,+purification+and+proteomic+analysis+of+nuclear+proteins+from+mouse+brain.">Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).</li><li>Pergande, M. R., Cologna, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+Point+Separations+of+Peptides+and+Proteins.">Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins.</a> Proteomes. 5 (1), (2017).</li><li>Stoyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IEF-based+multidimensional+applications+in+proteomics:+toward+higher+resolution.">IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution.</a> Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).</li><li>Vesterberg, O. A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method of Isoelectric Fractionation. , (1964).</li><li>Vesterberg, O., Svensson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+fractionation,+analysis,+and+characterization+of+ampholytes+in+natural+pH+gradients.+IV.+Further+studies+on+the+resolving+power+in+connection+with+separation+of+myoglobins.">Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins.</a> Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).</li><li>Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , 1 (1983).</li><li>Vesterberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Isoelectric+Fractionation+of+Carrier+Ampholytes.">Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes.</a> Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).</li><li>Bier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+isoelectric+focusing+and+isotachophoresis.">Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis.</a> Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).</li><li>Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis:+mathematical+modeling+and+computer+simulation.">Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation.</a> Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).</li><li>Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Rotofor+preparative+isoelectrofocusing+cell+in+protein+purification+procedure.">Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).</li><li>Wagner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+dipeptidyl+peptidase+IV+(DP+4)+isoforms+from+porcine+kidney+by+preparative+isoelectric+focusing+to+improve+crystallization.">Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization.</a> Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).</li><li>Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Monoclonal+Antibody+Charge+Variants+by+Free+Flow+Isoelectric+Focusing.">Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing.</a> Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).</li><li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+T-cell+antigen+identification+using+humanized+HLA-DR4+transgenic+mice.">Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice.</a> Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).</li><li>Riyong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+charge+antigens+of+Dirofilaria+immitis+adult+worm+for+IgG-ELISA+diagnosis+of+bancroftian+filariasis.">Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis.</a> Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).</li><li>Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+proteins+of+Candida+albicans:+preparation+of+extracts+and+improved+detection+of+proteins.">Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins.</a> Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).</li><li>Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+acids+inhibit+hyphal+growth+and+virulence+in+Candida+albicans.">Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans.</a> PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+ampholytes+used+for+isoelectric+focusing+may+interfere+with+bioactivity+based+purification+of+antimicrobial+peptides.">Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).</li><li>Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-Acid-Sequence+of+Sweet-Taste-Suppressing+Peptide+(Gurmarin)+from+the+Leaves+of+Gymnema-Sylvestre.">Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre.</a> Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).</li><li>Craik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry.+Seamless+proteins+tie+up+their+loose+ends.">Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends.</a> Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).</li><li>Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cyclotides:+A+unique+family+of+cyclic+and+knotted+proteins+that+defines+the+cyclic+cystine+knot+structural+motif.">Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif.</a> Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).</li><li>Stoecklin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+physiological+properties+of+gymnemic+acid,+the+antisaccharine+principle+of+the+leaves+of+Gymnema+sylvestre.">Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).</li><li>Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+elucidation+of+gymnemic+acids,+antisweet+principles+of+Gymnema+sylvestre.">Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre.</a> Chemical &amp; Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).</li><li>Veerapandian, R., Vediyappan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gymnemic+Acids+Inhibit+Adhesive+Nanofibrillar+Mediated+Streptococcus+gordonii-Candida+albicans+Mono-Species+and+Dual-Species+Biofilms.">Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).</li><li>Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+cell+wall+proteins.">Candida albicans cell wall proteins.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).</li></ol>

Doğal ürün kaynaklarından (örneğin, bitkiler) gelen küçük moleküller, kimyasal yapı olarak oldukça çeşitli karmaşık ikincil metabolitleri içerir. Onlar bitki savunma mekanizmaları dahil olduğuna inanılmaktadır. Buna ek olarak, polipeptidler de bitki dokularında mevcuttur22. Bu doğal ürün küçük moleküller ilaç keşif ve geliştirme için test moleküllerinin zengin kaynaklarıdır. Ancak, izolasyon ve arınma için gerekli zor ve sıkıcı yöntemler terapötik uygulam...

Biyomoleküllerin karmaşık biyolojik numunelerden arındırışı biyolojik deneylerde önemli ve çoğu zaman zor bir adımdır1. İzoelektrik odaklama (IEF), taşıyıcı amperatların yüklerine göre seyahat ettikleri ve bir elektrik alanında pH gradyanı nın oluşturuldukları karmaşık biyomoleküllerin yüksek çözünürlüklü ayrımı için uygundur3. IEF için ilk ticari taşıyıcı ampholyte Olof Vesterberg tarafından 1964 yılında geliştirilen ve patentli4,5. Taşıyıcı amperatlar alifatik oligo-amino oligo-karboksilik asit molekülleri değişen uzunluk ve dallanma6. Daha sonra, Vesterberg ve diğerleribiyomolekülleriayıran genişletilmiş kullanım için taşıyıcı ampholytes geliştirilmiş 6,7.
Biyomolekülleri ayırma yöntemleri arasında agarose ve poliakrilamid jel elektroforezi, iki boyutlu jel elektroforezi (2-DE), izoelektrik odaklama, kapiller elektroforez, izotachophorez ve diğer kromatografik teknikler (örn. TLC, FPLC, HPLC)2sayılabilir. "Rotofor" adı verilen bir enstrümanda gerçekleştirilen sıvı fazI IEF, Milan Bier8tarafından icat edilmiştir. Bu enstrümanın konseptine ve tasarımına öncülük etmiş ve elektroforetik göç teorisine büyük katkıda bulunmuştur. Ekibi ayrıca bilgisayar simülasyonları için elektroforetik ayırma sürecinin matematiksel bir model geliştirdi9.
Sıvı fazlı IEF aparatı, 20 gözenekli bölmeye bölünmüş bir naylon çekirdek ve sirkülasyon suyu soğutma seramik çubuktan oluşan yatay olarak dönen silindirik bir hücredir. Gözenekli bölmeler, moleküllerin elektrotlar arasındaki sulu fazdan geçmesine izin verir ve fraksiyonlarda vakum altında saflaştırılmış numunelerin toplanmasına izin verir. Bu arıtma sistemi,[lt;4 saat içinde belirli bir molekülün 1000 kata kadar saflaştırılmasını sağlayabilir. Bu aletin değerli bir özelliği, karmaşık bir karışımdan arınma için ilk adım olarak veya saflık10elde etmek için son bir adım olarak uygulanabilir olmasıdır. Eğer ilgi molekülü bir proteinise, bir diğer avantajı da ayrılma sırasında doğal konformasyonunun korunmasıdır.
Sıvı fazı IEF kullanımı proteinler, enzimler ve antikor saflaştırma6,10,11,,12,13,14için yaygın olarak bildirilmiştir. Burada tıbbi bitki Gymnema sylvestreküçük molekül ve peptidler ayıran ve arındırıcı için bu yaklaşımın kullanımını açıklar. Bu protokol, araştırmacıların düşük maliyetle aşağı akım uygulamaları için bir bitki özü aktif küçük molekülleri konsantre ve arındırmak yardımcı olacaktır. Buna ek olarak, bu IEF tabanlı sistemde Candida albicans mantar15 karmaşık bir protein ekstresinden proteinlerin zenginleştirme ikinci bir örnek olarak göstermektedir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisher scientfic</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207861-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 3/10 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Lyte 5/8 Ampholyte</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>163-1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact low temperature thermostat</td>
			<td>Lauda -Brinkmann</td>
			<td>RM 6T</td>
			<td>Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (3,500 MWCO)</td>
			<td>Spectrum Spectra/Por</td>
			<td>132112T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gymnema plant leaf extract powder (&#62;25% Gymnemic acids)</td>
			<td>Suan Farma, NJ USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Lab companion</td>
			<td>SI 300R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM 6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean electrophoresis</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S20</td>
			<td>Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotofor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2972</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>DH30255.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2960</td>
			<td>Scotch tape may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall legend micro 17 centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>75002432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP tissue culture plate -96 well flat bottom</td>
			<td>TPP</td>
			<td>TP92696</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of bioactive small molecules, peptides from natural sources and proteins from microbes by preparative isoelectric focusing (ief) method

Bitkilerden ve mikroplardan elde edilen doğal ürünler zengin bir biyoaktif molekül kaynağıdır. Kullanımlarından önce, karmaşık ekstrelerden aktif moleküller downstream uygulamaları için saflaştırılmalıdır. Bu amaç için çeşitli kromatografik yöntemler mevcuttur ancak tüm laboratuvarlar yüksek performanslı yöntemler göze alamaz ve karmaşık biyolojik örneklerden izolasyon zor olabilir. Burada, preparatif sıvı fazizoelektrik odaklamanın (IEF) molekülleri, küçük moleküller ve peptidler de dahil olmak üzere karmaşık bitki özlerinden, izoelektrik noktalarına (pI) göre ayırabildiğimizi gösteriyoruz. Bu yöntemi karmaşık biyolojik numune fraksiyonu ve karakterizasyonu için kullandık. Kavramın bir kanıtı olarak, biz bir Gymnema sylvestre bitki ekstresi fraksiyone, terpenoid saponin küçük moleküller ve bir peptit bir aile izole. Ayrıca candida albicans mantarını model sistem olarak kullanarak etkili mikrobiyal protein ayrıştırma larını gösterdik.

Gymnema sylvestre bitki ekstresinden küçük molekül ve peptidlerin ayrılması ve saflaştırılması Preparatif sıvı fazI IEF yöntemini kullanarak, tıbbi bitki özleri ve hücre yüzey proteinleri bir insan patojenik mantar, C. albicans. Bu kesirasyon protokollerinin şeması Şekil 1'degösterilmiştir.
Sıvı fazLı IEF'den elde edilen G. sylvestre ekstresinin 20 fraksiyonundan, koyu renkli moleküllerin (te...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method at JoVE.com

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing IEF Method

Amaç, sıvı fazlı izoelektrik odaklama (IEF) yöntemini çalıştırarak biyoaktif küçük molekülleri, kompleks bitki özünden peptitleri ve patojen mikroplardan proteinleri fraksiyonetmek ve izole etmektir. Ayrıca ayrılan moleküller tespit edildi ve biyoaktiviteleri doğrulandı.

Biyoaktif Küçük Moleküllerin, Peptidlerin Doğal Kaynaklardan ve Proteinlerden Preparatif İzoelektrik Odaklama (IEF) Yöntemi ile Mikroplardan Ayrılması

Natural products derived from plants and microbes are a rich source of bioactive molecules. Prior to their use, the active molecules from complex extracts ...

Protokolümüz, aktif moleküllerin bir bitki ekstresinden ayrılması ve saflaştırılması ile ilgili yeni bulguları açıklamaktadır. Bilim adamları terapötik kullanıcılar için doğal ürün kaynaklarından küçük moleküller ve peptidler izole etmek için bu yöntemleri kullanabilirsiniz. Alet bileşenlerive bunların montaj yöntemleri hakkında bilgi edinin.Ayrılacak numunenin önerilen yönergeler tarafından hazırlandığından emin olmak önemlidir. Bu yöntem, enstrümanın birden çok montaj işlemi içerir. Ve görsel gösteri kullanıcıların takip etmek ve başarıyla araştırma için bunları uygulamak için yardımcı olacaktır.Sıvı fazı biraraya getirdikten sonra, kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi IEF ünitesi, anyon değişim membranlarını 0,1 molar sodyum hidroksit ve katyon değişim membranlarını 0,1 molar fosforik asit ile dengeler. Kauçuk contaları üç büyük dikdörtgen deliğin kauçuk tarafından engellenmemiş olarak kalması için hizala. Bu elektroforez sırasında membran üzerinden elektrot ve örnek bölmeleri arasında iyonalışverişi yardımcı olacaktır.İyon değişimi contalarında üç dikdörtgen delik hizalayarak elektrotun iç ve dış kısmını birleştirin. Daha sonra membranlarının kurumasını önlemek için elektrotları kendi elektrolitleriyle doldurun. Daha sonra, sızdırmaz bir montaj sağlamak için plastik vida tutucusıkın.Numune toplama panolarını sızdırmazlık bandıyla kapatın. Daha sonra aşağıdaki sırayla seramik soğutma parmağı üzerinde odaklama odası parçaları monte: anot elektrot, naylon membran çekirdek, odaklama odası ve katot elektrot. 50 mililitrelik şırınga kullanarak, odaklama odasını önceden soğutulmuş distile suyla doldurun.Standart bir IEF hücresi için 60 mililitre su ekleyin. IEF ünitesini dört santigrat derecede sirkülasyon soğutma suyuna bağlayın. Voltaj dengelenir kadar 15 watt ve 3000 volt, yaklaşık 3-5 dakika birim çalıştırın.Sonra güç kaynağını kapatın. Kesir toplayıcısını kullanarak, hücreden suyu çıkarın. Toplama panolarını sızdırmazlık bandıyla yeniden mühürleyin.60 mililitre distile suya Gymnema sylvestre bitki ekstresi 0,6 gram ekleyin. Beş dakika boyunca bir rulo tüp içinde karıştırarak bitki ekstresi çözün. Çözünmez parçacıkları çıkarmak için, bu çözeltiyi 10.000 kez G'de beş dakika santrifüj edin.Supernatant'ı 150 mililitrelik cam kabına aktarın ve hacim olarak %1'lik bir çözüm oluşturmak için yaklaşık 0,6 mililitre lik bir çözelti ekleyin. 1,5 inç 19 gauge blunt uç iğnesi ile 50 mililitrelik şırınga kullanarak, bu çözümü örnek toplama panoları aracılığıyla IEF hücresine yükleyin. Sonra standdan hücre kaldırmak ve elektrot odası dokunun, yerinden ve herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için.Üniteyi soğutma suyuna bağlayın. Sabit güç kaynağı ile 15 Watt fraksiyonu başlar. IEF ünitesini gerilim yaklaşık üç saat olan sabit bir değere ulaşana kadar çalıştırın.Hasat düğmesine bastıktan sonra kesir toplayıcı pimlerini toplama panolarıile hizala. Gymnema sylvestre fraksiyonları toplamaya başlamak için sızdırmazlık bandı ile pimleri itin. C.albicans ve maya pepitone dekstroz suyu tek bir koloni gece boyunca 30 derece santigrat sallayarak büyümek.Kültürü bir santrifüj tüpüne aktarın ve maya hücrelerini santrifüj le 10,000 kez G'de beş dakika toplayın. Supernatant çıkardıktan sonra, tampon maya hücreleri askıya almak ve beş santigrat derece bir saat için bir silindir tüpü süspansiyon döndürmek. Maya hücrelerini çıkarmak için süspansiyonu 10,000 kez G'de beş dakika santrifüj edin.Daha sonra protein ekstresini 0,45 mikrometrelik bir filtreden süzün. Protein ekstresini diyaliz tüpüne aktarın ve 4 santigrat derecede 15 saat boyunca suya karşı diyalize alın. Protein konsantrasyonu tahmin ettikten sonra, toplam protein 500 miligram içeren protein ekstresi bir hacim toplamak.Hacmine göre% 1 amper içeren su 60 mililitre protein 500 miligram seyreltin. Bir şırınga kullanarak, seyreltilmiş protein ekstresini IEF hücresine yükleyin ve üniteyi sabit 15 Watt'ta dört saat çalıştırın. Bu cihaz yüksek voltajlı elektrik kaynağı kullandığından, kullanıcı canlı elektrotlarla doğrudan temastan kaçınmak için her türlü önlemi almalıdır.Fraksiyon toplayıcı, her biri 12 milimetreye 75 milimetre lik 20 plastik tüp içerir. Ve vakum pompasına bağlı. Düğmeye hasat basarak kesirleri toplamak için hazırlayın.Daha sonra kesir toplayıcısındaki 20 toplama iğnesini 20 toplama panosuyla hizalayın, böylece mühürlü odaklama hücresi. Toplama pimlerini sızdırmazlık bandına itin ve aynı anda vakum pompasını açın. Her tüp yaklaşık üç mililitre bir protein fraksiyonu toplayacak.Protein fraksiyonlarını azaltıp kaynattma sonra % 12.5 SDS sayfa jeli ile analiz edin. Coomassie Mavi boya ile jel leke ve oda sıcaklığında bir rocker üzerine yerleştirin. 2-3 saat sonra jelde lekeyi bozun.Sonra jel görüntüleyici kullanarak jel görüntü kaydedin. 50 milimolar glikoz ile desteklenen RPMI hücre kültürü orta 1:1000 oranında C.albicans bir gecede kültür seyrelterek bir maya hücre süspansiyon hazırlayın. 96 kuyu plakasının her kuyuya 90 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.Daha sonra, kuyuları ayırmak için her G.sylvestre fraksiyonundan 10 mikrolitre ekleyin. Negatif kontrol olarak, ayrı kuyulara %1 amper atmis 10 mikrolitre su ekleyin. 96 kuyu plakasını 12 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yattıktan sonra, plakayı mikroskop altında gözlemleyin.Filamentöz büyüme eksikliği C.albicans maya-hypha dönüşüm inhibisyonu gösterir. G.sylvestre ekstresinin yirmi fraksiyonu sıvı faz IEF ile elde edildi. Koyu renkli moleküller, jimnastik asitler, göç ve ünitenin anod ucunda zenginleştirilmiş.Katot ucunda yarı saydam açık sarı fraksiyonlar gözlendi. Her G.sylvestre kırılmasından elde edilen aliquotlar SDS sayfası ile azaltıldı, kaynatıldı ve çözüldü. Bir Coomassie Mavi leke kesirler 16 ile 19 arasında zenginleştirilmiş, yaklaşık beş kilodaltonfarklı bir polipeptid bandı gösterdi.Birinci kesirdeki Gymnemic asitler idiler ve sonraki birkaç fraksiyon proteinamı olmadığı için tespit edilmedi. Ancak, bu moleküller TLC ile ayrılabilir ve UV ışığı altında tespit edilebilir. Fraksiyon 10 bu küçük moleküllerin tespit edilebilir bir miktar organik küçük moleküllerin çoğu kesirler bir ile üç zenginleştirilmiş olduğunu düşündürmektedir içermekti.Tüm 20 G.sylvestre fraksiyonları maya-to-hypha dönüşüm ve C.albicans hyphal büyüme inhibisyonu için kabul edildi. En büyük inhibisyon 10 ve üzeri kesirlerde gözlendi ve çok az inhibitör gözlendi. C.albicans hücre yüzey proteinleri sıvı faz IEF kullanılarak fraksiyone edildi.Ve 18 kesirden aliquots SDS sayfası tarafından analiz edildi. Zenginleştirilmiş proteinler çeşitli kesirlerde görülebilir. Başlangıç, küçük moleküller non-ambulatuar olduğuna inanılıyor çünkü izoelektrik odaklama ile ayrılmış olamazdı.Çalışmalarımız en az haftada bir ambulatuar olduklarını ve bu yöntemin diğer küçük moleküller için daha fazla araştırılabildiği gösterilmiştir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Method

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Paraziter Eşek Arıları Bir Giriş<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve antiparaziter İmmün Yanıt

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Ayrılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emManyetik Yoluyla&gt; Geç Evre-enfekte Eritrositler

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Otomatik Ayırma<em&gt; C. elegans</em&gt; Değişken derecelerde Bakteriyel Patojen tarafından kolonileştirildiğini

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Akış Sitometrisi ile Sıçan Böbrek gelen Makrofagların Fenotipik Karakterizasyonu

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...