Forskning i hjertesygdomme udføres ofte i små og pattedyr som gnavere. Men fysiologien i det menneskelige hjerte adskiller sig væsentligt fra gnaverhjertets. Vores protokol bruger kardiomyocytter differentieret fra menneskelige iPS-celler til model iskæmisk hjertesygdom og til at kvantificere skader og funktionelle svækkelse af iskæmisk kardiomyocytter.
Denne protokol kan være en praktisk metode til personlig lægemiddelscreening ved hjælp af iPS-celler, der stammer fra individuelle patienter, passende håndtering af iPS-cellerne, såsom ved hjælp af frisk medium, og ændring af mediet langsomt og punktligt er afgørende for at sikre en vellykket differentiering i funktionelle kardiomyocytter. Demonstration af proceduren med Yun Liu, Yin Liang og Mengxue Wang vil blive Chen Wang, en ph.d.-studerende fra et laboratorium. For at fremkalde human induceret pluripotent stamcelledifferentiering i hjerteceller, første pels brøndene af en 96 godt kultur plade med 100 mikroliter på 1.675 mikrogram per milliliter laminin i PBS.
Efter en 30 minutters inkubation ved 37 grader Celsius, se tre gange 10 til den fjerde stamceller i 200 mikroliter af IPS vedligeholdelse medium suppleret med 10 mikromolar Y27632 i hver brønd, og returnere pladen til Cell Culture Inkubator. Efter 24 timer skal supermidlet udskiftes med 200 mikroliter af IPS-vækstmedium pr. brønd, og pladen returneres til Cell Culture Incubator i yderligere to til tre dage. Når cellerne når 70 til 80%sammenløbet.
Udskift mediet i hver brønd med 200 mikroliter af forvarperede differentieringsmedium A, og vend pladen tilbage til cellekulturskuvøsen i yderligere 48 timer. I slutningen af inkubationen langsomt erstattet supernatant i hver brønd med 200 mikroliter af prævarmisk differentiering medium B og returnere pladen til Cell Culture Inkubator. Efter to dage skal supernatanterne udskiftes med 200 mikroliter af forvarmt kardiomyocytvedligeholdelsesmedium pr. brønd og returneres pladen til Cell Culture Incubator i op til 30 dage.
For at vurdere kardiomyocytternes kontraktilitet skal du installere partikelbilledet velocimetry billede j plugin og bruge et fasekontrastmikroskop og gaflermålet til at optage videobilleder af cellerne med ca. 20 billeder pr. sekund i ca. 10 sekunder. Gem derefter videofilen som analyseret vores API og opret en mappestruktur som angivet. Hvis du vil analysere separate todimensionale vektorfelter for celleforskydning, skal du starte VG og vælge plugins, makroer og redigere for at åbne vektoranalyse.
ijm, og klik derefter på kør, udføres analysen automatisk. Til iskæmisk behandling skal supernatanten udskiftes i hver brønd med 200 mikroliter dmem uden glukose og serum, og derefter placeres pladen i et hypoxisk kammer, hvortil den indgyder nitrogengas i kammeret, hvilket fastholder den interne iltkoncentration på 2 % og kuldioxidkoncentrationen på 5 % i 24 timer. Vellykket differentierede celler, viser spontan sammentrækning som observeret under mikroskopet med 50% af kulturbængterne typisk udviser spontan sammentrækning på mindre end 20 dage.
Cardiac markør protein kan også bruges til at bekræfte en vellykket differentiering Celler fra iskæmisk gruppe typisk udviser en lavere levedygtighed i MTT assays, og en lavere kontraktilitet end dem fra normoxiske kontrolgruppe. Forholdet mellem propidium iodid positive celler er også højere i den iskæmiske gruppe, end i kontrolgruppen, hvilket indikerer en højere forekomst af cellulære skader. Det er vigtigt, at du præcist lokalisere regioner af interesse i fange plade til at tillade sammenligning af kontraktilitet af kardiomyocytter.
Denne teknik kan bruges til lægemiddelscreening, ved hjælp af patient afledte iPS-celler. Det giver også en unik platform for yderligere belysning af de mekanismer, der ligger til grund for iskæmiske hjertesygdomme
