Name: model of ischemic heart disease and video-based comparison of cardiomyocyte contraction using hipsc-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2020-05-05T15:00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af JSPS KAKENHI, Fonden til Fremme af Fælles International Forskning (Fremme af Fælles International Forskning), 17KK0168. Forfatterne taknemmeligt anerkende Central Research Laboratory, Okayama University Medical School for bistand fra FACS.

1. hiPSC vedligeholdelseskultur
<ol><li>Coat en seks-godt kultur plade med laminin(Tabel af Materialer).<ol>
<li>Laminin fortyndes til 0,5 μg/ml i fosfatbufferet saltvand (PBS).</li>
		<li>Tilsæt fortyndet laminin til en seks-brønd plade ved et volumen på 2,0 ml / brønd.</li>
		<li>Pladen inkuberes ved 37 °C i 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fjern laminin-løsningen fra brøndene.</li>
	<li>Seed hiPSCs i 2 ml iPSC vedligeholdelse medium (Tabel over materialer) på de belagte brønde ved en massevis af 3 × 104 celler / godt uden at tørre overfladen.</li>
	<li>Subkultur hiPSCs.<ol>
<li>Forbered 0,5× celle dissociation enzymer (Tabel over materialer) løsning.<ol>
<li>10 μL 0,5 M ethylenediamintetraacetisk (EDTA) og 10 ml PBS blandes for at lave 0,5 mM EDTA/PBS.</li>
			<li>10 ml 1× celleafslysningsenzymer fortyndes til 0,5× ved at tilsætte 10 ml 0,5 mM EDTA/PBS.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aspirate den brugte medium fra brøndene.</li>
		<li>Tilsæt 2 ml PBS/brønd for at vaske cellerne, og kassér derefter PBS.</li>
		<li>Der tilsættes 800 μL af 0,5×celleslyderne, og cellerne inkuberes i 7 min. ved 37 °C i en befugtet inkubator, der indeholder 5 % CO2. BEMÆRK: 0,05% trypsin-EDTA kan bruges til at adskille celler.</li>
		<li>Fjern forsigtigt 0,5×-opløsningsenzymopløsningsopløsningen.</li>
		<li>Cellerne vaskes med 2 ml PBS, og kassér derefter PBS. BEMÆRK: Vær forsigtig, fordi cellerne let løsnes efter tilføjelse af celle dissociationsenzymeropløsning.</li>
		<li>Der tilsættes 1 ml iPS-vedligeholdelsesmedium (materialetabel), der indeholder 10 μM Y-27632. BEMÆRK: Tilføjelse af Y-27632 øger overlevelsesraten for hiPSCs.</li>
		<li>Fordrive celler ved hjælp af en celle skraber, og indsamle dem i en 15 ml centrifuge rør.</li>
		<li>Tæl antallet af celler. Celleretætheden justeres til 1,5 × 104 celler/ml ved at tilsætte iPS-vedligeholdelsesmediet indeholdende 10 μM Y-27632. BEMÆRK: Brug ikke centrifugering for at forhindre celleskader.</li>
		<li>Frø 2 ml celleblanding på den lamininbelagte seks-brønds plade (endelig tæthed: 3 × 104 celler/brønd).</li>
		<li>Cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet inkubator, der indeholder 5 % CO2.</li>
		<li>Udskift kulturmediet med iPS-vedligeholdelsesmediet uden Y-27632 på dag 1, 4, 5 og 6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Subkultur cellerne på dag 7. BEMÆRK: Subkultur cellerne om dag 7 for at hæmme tilfældig differentiering af hiPSCs.</li>
</ol>2. Induktion af hjertedifferentiering af hiPSCs
<ol><li>Coat en 96-godt kultur plade med laminin(Tabel af materialer).<ol>
<li>Laminin fortyndes til 1,675 μg/ml med PBS.</li>
		<li>Tilsæt den fortyndede lamininopløsning til en 96-brøndplade ved et volumen på 0,1 ml/brønd.</li>
		<li>Pladen inkuberes ved 37 °C i 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seed hiPSCs på en 96-brønd plade ved en tæthed på 3 × 104 celler / godt.</li>
	<li>Varmninger ved 37 °C i en befugtet inkubator indeholdende 5 % CO2.<ol>
<li>En dag senere erstattes mediet med 200 μL/brønd iPS vækstmedium (Materialetabel).</li>
		<li>Skift mediet hver dag i yderligere 2-3 dage, indtil cellerne når op på 70-80 % sammenløb.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anvend differentieringsmedier.<ol>
<li>Aspirere det brugte medium og erstatte det langsomt med 200 μL / godt af præ-opvarmet differentiering medium A (Tabel over Materialer).</li>
		<li>Pladen sættes ved 37 °C i en befugtet inkubator, der indeholder 5 % CO2.</li>
		<li>Efter 48 timer aspirere mediet og udskiftes det langsomt med 200 μL/brønd af forvarperede differentieringsmedium B (Materialetabel).</li>
		<li>Pladen sættes ved 37 °C i en befugtet inkubator, der indeholder 5 % CO2. BEMÆRK: Det er yderst vigtigt, at differentieringsmedierne holdes friske. De vil gradvist miste deres differentiering effekt, typisk inden for to uger. Om nødvendigt aliquot frisk medium og opbevares ved −20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Påfør kardiomyocyt vedligeholdelse medium.<ol>
<li>Efter 48 timer aspirere mediet og udskiftes det langsomt med 200 μL/brønd af forvarmt kardiomyocytvedligeholdelsesmedium (Materialetabel).</li>
		<li>Pladen sættes ved 37 °C i en befugtet inkubator, der indeholder 5 % CO2.</li>
		<li>Udskift kardiomyocytdifferentieringsmediet hver anden dag op til dag 30. BEMÆRK: Det er vigtigt, at varigheden af anvendelsen af differentieringsmediet A og B indstilles præcist til 48 timer for at sikre den præcise ekspressionssekvens af gener, der kræves til differentiering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Eksponering for iskæmi
<ol><li>Fratage kultur medium af næringsstoffer og ilt.<ol>
<li>Forbered Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) uden glukose og serum.</li>
		<li>Aspirat kultur medium fra brøndene i 96-brønd plade, der indeholder hiPS-CMs.</li>
		<li>Tilsæt det næringsfattige medium til brøndene med et volumen på 200 μL/brønd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anbring kulturpladen i en hypoxisk inkubator (Materialetabel).</li>
	<li>Tilskil nitrogengas, og opretholde den interne iltkoncentration på 2% og CO2 koncentration på 5% for 24 timer.</li>
	<li>Gå videre til ønskede analyser: f.eks.</li>
</ol>4. Vurdering af cellulær levedygtighed ved hjælp af MTT-analyse
<ol><li>Brug MTT-analysesættet (Materialefortegnelsen) til kvantitativt at vurdere cellernes levedygtighed. BEMÆRK: Udsættelse for 1 mM hydrogenperoxid i DMEM i 1 time kan bruges til at beskadige celler (positiv kontrol). Eksponering for 0 mM hydrogenperoxid i DMEM kan anvendes til den negative kontrol.<ol>
<li>Der tilsættes 10 μL MTT-reagens til cellerne ved hjælp af en gentaget pipettor.</li>
		<li>Bland forsigtigt i et minut på en orbital shaker.</li>
		<li>Cellerne inkuberes i 3-4 timer ved 372 °C i en 5% CO 2-inkubator. Efter inkubationen vil formazan produceret i cellerne fremstå som mørke krystaller i bunden af brøndene.</li>
		<li>Efter fjernelse af supernatanten opløses de uopløselige formazankrystaller i 100 μL dimethylsulfoxidopløsning (DMSO). Denne opløsning vil opløse formazan krystaller, der producerer en lilla opløsning. FORSIGTIG: DMSO kan irritere øjne, åndedrætsorganerne og huden. Bær egnede handsker og øjen-/ansigtsbeskyttelse.</li>
		<li>Hver prøves absorbans måles med en mikropladelæser ved en bølgelængde på 570 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Vurdering af iPS-CM'ers kontraktilitet
<ol><li>Hvis ikke installeret, få Partikel Billede Velocimetry ImageJ plugin11 på https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv og installere.</li>
	<li>Ved hjælp af en fase kontrast mikroskop, optage videobilleder af hiPS-CMs ved hjælp af 4× objektive linse på ~ 20 billeder i sekundet for ~ 10 s, og gem som "analyze.avi". For en sammenligning af kontraktilitet mellem før og efter iskæmi, bekræfte, at placeringen af interesse registreres. BEMÆRK: Et mikroskop med en automatiseret fase er nyttigt at målrette placeringen af interesse. Filmfilen skal være i .avi-format til senere analyse. Hvis ikke, skal du konvertere filmen til .avi.</li>
	<li>Opret mappestruktur som angivet i figur 1. Et eksempel på "joblist.txt" er angivet i en supplerende fil.</li>
	<li>Analysér diskrete todimensionale vektorfelter med celleforskydning.<ol>
<li>Start Fiji (ImageJ) software12, gå til Plugins > Makroer > Rediger og åbn "vector_analysis.ijm" (Supplerende Coding File).</li>
		<li>Klik på Kør. Analysen udføres automatisk. BEMÆRK: Forskydningsvektorer D(x,y) beregnes for hver 16 × 16 pixel mellem referencerammen (den første ramme) og alle efterfølgende rammer (ramme 1 vs. 2, 1 vs. 3, 1 vs. 4 osv.). Resultatet beregnes for hver ramme og gemmes som "vec_x.txt" (x er et rammenummer). En vektor med maksimal forskydning, M(x, y), defineres for hvert (x, y) par på følgende måde: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61104/61104equ01.jpg"> hvor k repræsenterer det rammenummer, som | Dk (x,y)| = maks. D2 (x,y)|, | D3 (x,y)|, ..., | Dn (x,y)|] og n betegner den sidste ramme. Resultatet gemmes som "Max_vector.txt". | M(x, y)| repræsenterer den maksimale forskydning forårsaget af kardiomyocytsammentrækning ved analysepunktet (x, y). Kontraktilitetsværdi C i vilkårlige enheder beregnes på følgende måde: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61104/61104equ02.jpg"> Denne værdi gemmes i kolonne 7, række 1 i "Max_vector.txt". C repræsenterer summen af forskydning for alle (x, y). Jo større del, hvor forskydningen på grund af myokardiesammentrækning er stor, jo større er værdien af C. Vektorfeltet med maksimal forskydning, M(x, y), overlejres med fasekontrastbillede af den første ramme ("Phase_contrast.png") og gemmes som "Overlaid.png". Da omfanget af forskydningsvektoren beregnes ud fra videoens første billede, er det at foretrække, at hiPS-CMs hviler diastolisk periode for det første billede.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Vurdering af cellulære skader ved hjælp af flowcytometri
<ol><li>En 1 mg/ml opløsning af propidium iodid fortyndes til 1:1.000 i PBS.</li>
	<li>Pletten de fritliggende celler med propidium iodid.<ol>
<li>Inspirer mediet og læg det i et passende centrifugerør.</li>
		<li>Centrifuge røret ved 1.000 × g i 5 min, og forsigtigt fjerne supernatant for ikke at miste sedimenterede celler.</li>
		<li>Cellerne inkuberes med den fortyndede propidiumdodidopløsning ved stuetemperatur i 15 minutter i mørke.</li>
		<li>Centrifuge røret ved 1.000 × g i 5 min, og forsigtigt fjerne supernatant for ikke at miste sedimenterede celler.</li>
		<li>Rekonstituere cellerne i ~ 1 ml PBS. BEMÆRK: Det er vigtigt at indsamle fritliggende flydende celler fra mediet for præcist at kvantificere celleskader.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pletten vedhæftede celler med propidium iodid.<ol>
<li>Påsatte celler vaskes to gange med PBS forsigtigt, og kassér derefter PBS.</li>
		<li>Inkuber cellerne med den fortyndede propidiumidodidopløsning i 15 minutter i mørke.</li>
		<li>Aspirere propidiumidodidopløsningen.</li>
		<li>Fjern cellerne ved hjælp af 0,25% trypsin. Flyt celleopløsningen ind i et centrifugerør.</li>
		<li>Centrifuge røret ved 1.000 × g i 5 min, og forsigtigt fjerne supernatant for ikke at miste sedimenterede celler.</li>
		<li>Rekonstituere cellerne i ~ 1 ml PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bland de flydende og tilknyttede celler til fluorescensaktiv cellesortering (FACS) analyse.</li>
	<li>Celleopløsningen overføres gennem et 30 μm filter. BEMÆRK: Det er meget vigtigt at overføre cellerne til et filter for en nøjagtig FACS-måling.</li>
	<li>Analysér prøverne ved hjælp af et FACS-system.</li>
</ol>7. Immunstaining
<ol><li>Ret celleeksempelt.<ol>
<li>Aspirere kulturmediet.</li>
		<li>Tilsæt 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min ved stuetemperatur.</li>
		<li>Cellerne vaskes tre gange med PBS. BEMÆRK: Frisk paraformaldehydopløsning anbefales til optimal fiksering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilize cellerne med 0,2% Triton X-100 i 15 min, derefter kassere reagenset.</li>
	<li>Tilføj 3% kvæg serum albumin at blokere cellerne i 30 min.</li>
	<li>Påfør primært antistof.<ol>
<li>Kassér bovin serumalbuminopløsningen fra dyrktalpladen.</li>
		<li>Inkuber cellerne med primære antistoffer natten over ved 4 °C.</li>
		<li>Fjern antistofopløsningen.</li>
		<li>Cellerne vaskes tre gange med PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Påfør sekundært antistof.<ol>
<li>Kassér PBS-opløsningen fra kulturpladen.</li>
		<li>Inkuber cellerne med sekundære antistoffer i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. BEMÆRK: Primær anti-hjerte troponin T (TNNT2) mus monoklonale antistof anvendes ved en fortynding på 1:750 i 3% BSA. Alexa Fluor 488-konjugerede sekundære ged anti-mus antistof er fortyndet til 1:1,000 i 3% BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yderligere farvning af kernen og actin fibre.<ol>
<li>Fjern antistofopløsningen.</li>
		<li>Cellerne intekubes i kernefarvningsreage (Materialetabel) og actinfaren reagens (Materialetabel) i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. BEMÆRK: 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) eller Hoechst 33342 kan anvendes til nuklear farvning.</li>
		<li>Cellerne vaskes tre gange med PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optag fluorescensbilleder ved hjælp af et fluorescensmikroskop.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Naghavi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Burden+of+Disease+Self-Harm,+C.+Global,+regional,+and+national+burden+of+suicide+mortality+1990+to+2016:+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">Global Burden of Disease Self-Harm, C. Global, regional, and national burden of suicide mortality 1990 to 2016: systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> BMJ. 364, 94 (2019).</li><li>Nowbar, A. N., Gitto, M., Howard, J. P., Francis, D. P., Al-Lamee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+From+Ischemic+Heart+Disease.">Mortality From Ischemic Heart Disease.</a> Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (6), 005375 (2019).</li><li>Oh, J. G., Ishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Models+of+Cardiovascular+Diseases:+Overview.">Experimental Models of Cardiovascular Diseases: Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 3-14 (2018).</li><li>Brodehl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem-Cell-Derived+Cardiomyocytes+as+Models+for+Genetic+Cardiomyopathies.">Human Induced Pluripotent Stem-Cell-Derived Cardiomyocytes as Models for Genetic Cardiomyopathies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), (2019).</li><li>Garbern, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mTOR+Signaling+Enhances+Maturation+of+Cardiomyocytes+Derived+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+via+p53-Induced+Quiescence.">Inhibition of mTOR Signaling Enhances Maturation of Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells via p53-Induced Quiescence.</a> Circulation. , (2019).</li><li>Horikoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+Acid-Treated+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Human+Cardiomyocytes+Exhibit+Adult+Cardiomyocyte-Like+Energy+Metabolism+Phenotypes.">Fatty Acid-Treated Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Cardiomyocytes Exhibit Adult Cardiomyocyte-Like Energy Metabolism Phenotypes.</a> Cells. 8 (9), (2019).</li><li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Maturation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+by+Inhibition+of+HIF1alpha+and+LDHA.">Metabolic Maturation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes by Inhibition of HIF1alpha and LDHA.</a> Circulation Research. 123 (9), 1066-1079 (2018).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+carbon+sources+affect+structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Distinct carbon sources affect structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8590 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li><li>Tamargo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mice+as+a+model+for+studying+cardiac+arrhythmias.">Genetically engineered mice as a model for studying cardiac arrhythmias.</a> Frontiers in Bioscience. 12, 22-38 (2007).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Wei, H., Wang, C., Guo, R., Takahashi, K., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+model+of+ischemic+heart+disease+using+cardiomyocytes+differentiated+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Development of a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 520 (3), 600-605 (2019).</li><li>Ghaedi, M., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cells+(iPSC)+Generation,+Culture,+and+Differentiation+to+Lung+Progenitor+Cells.">Human Pluripotent Stem Cells (iPSC) Generation, Culture, and Differentiation to Lung Progenitor Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 55-92 (2019).</li><li>Hou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retaining+mTeSR1+Medium+during+Hepatic+Differentiation+Facilitates+Hepatocyte-Like+Cell+Survival+by+Decreasing+Apoptosis.">Retaining mTeSR1 Medium during Hepatic Differentiation Facilitates Hepatocyte-Like Cell Survival by Decreasing Apoptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (4), 1533-1543 (2018).</li><li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+iPS+cells+into+ameloblast-like+cells+in+cultures+using+medium+conditioned+by+epithelial+cell+rests+of+Malassez+and+gelatin-coated+dishes.">Differentiation of mouse iPS cells into ameloblast-like cells in cultures using medium conditioned by epithelial cell rests of Malassez and gelatin-coated dishes.</a> Medical Molecular Morphology. 48 (3), 138-145 (2015).</li><li>Guzzo, R. M., Drissi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Chondrocytes.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1340, 79-95 (2015).</li><li>Haraguchi, Y., Matsuura, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+suspension+culture+system+of+human+iPS+cells+maintaining+their+pluripotency+for+cardiac+cell+sheet+engineering.">Simple suspension culture system of human iPS cells maintaining their pluripotency for cardiac cell sheet engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (12), 1363-1375 (2015).</li><li>Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Ischemia-Reperfusion+Injury.">In vitro Models of Ischemia-Reperfusion Injury.</a> Regenerative Engineering and Translational Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).</li><li>Strijdom, H., Genade, S., Lochner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+Oxide+synthase+(NOS)+does+not+contribute+to+simulated+ischaemic+preconditioning+in+an+isolated+rat+cardiomyocyte+model.">Nitric Oxide synthase (NOS) does not contribute to simulated ischaemic preconditioning in an isolated rat cardiomyocyte model.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 18 (2), 99-112 (2004).</li><li>Cavalheiro, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+cardioprotective+effect+of+the+4-anilinoquinazoline+derivative+PD153035:+involvement+of+mitochondrial+K(ATP)+channel+activation.">Potent cardioprotective effect of the 4-anilinoquinazoline derivative PD153035: involvement of mitochondrial K(ATP) channel activation.</a> PLoS One. 5 (5), 10666 (2010).</li><li>Toepfer, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SarcTrack.">SarcTrack.</a> Circulation Research. 124 (8), 1172-1183 (2019).</li><li>Smith, A. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoMEA:+A+Tool+for+High-Throughput,+Electrophysiological+Phenotyping+of+Patterned+Excitable+Cells.">NanoMEA: A Tool for High-Throughput, Electrophysiological Phenotyping of Patterned Excitable Cells.</a> Nano Letters. , (2019).</li><li>Smith, A. S., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+and+tissue+engineering+strategies+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening.</a> Biotechnology Advances. 35 (1), 77-94 (2017).</li><li>Sitkovsky, M., Lukashev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+immune+cells+by+local-tissue+oxygen+tension:+HIF1+alpha+and+adenosine+receptors.">Regulation of immune cells by local-tissue oxygen tension: HIF1 alpha and adenosine receptors.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (9), 712-721 (2005).</li><li>McDougal, A. D., Dewey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+oxygen+requirements+in+ischemic+cardiomyocytes.">Modeling oxygen requirements in ischemic cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11760-11776 (2017).</li><li>Rounds, S. A., Wilde, F. D., Ritz, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+A6.+Section+6.2.">Chapter A6. Section 6.2.</a> Dissolved oxygen. Report No. 09-A6.2. , (2006).</li><li>Al-Ani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygenation+in+cell+culture:+Critical+parameters+for+reproducibility+are+routinely+not+reported.">Oxygenation in cell culture: Critical parameters for reproducibility are routinely not reported.</a> PLoS One. 13 (10), 0204269 (2018).</li><li>Cadet, J. S., Kamp, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Recipe+for+T-Tubules+in+Human+iPS+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">A Recipe for T-Tubules in Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 121 (12), 1294-1295 (2017).</li><li>Halloin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+WNT+Control+Enables+Advanced+hPSC+Cardiac+Processing+and+Prognostic+Surface+Marker+Identification+in+Chemically+Defined+Suspension+Culture.">Continuous WNT Control Enables Advanced hPSC Cardiac Processing and Prognostic Surface Marker Identification in Chemically Defined Suspension Culture.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 366-379 (2019).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Forskere bruger ofte laboratoriemodeller for små dyr til at udføre IHD-eksperimenter. Her udviklede vi en cellekulturmodel af menneskelig IHD til at udføre sådanne eksperimenter.
Det største problem en bruger af denne protokol kan stå over for, er lav sats af differentierede kardiomyocytter. Der bør tages flere skridt med stor omhu for at forbedre hastigheden af vellykket differentiering: (a) være skånsom, når de afmonteres, fordi cellerne let løsnes efter tilsætning af celleresociationsenzymer reagens, b) tilføjelse af Y-27632 øger overlevelsesraten for iPS-celler ved afledning, og (c) timingen af mediumændringer i begyndelsen af differentiering bør være præcis 48 h fra hinanden for at sikre kontrolleret udtryk for involverede gener i differentiering.
Med hensyn til de ekstracellulære matrixproteiner, der anvendes til belægning af overfladen af kulturpladen, kan andre materialer end laminin, som vi brugte i denne protokol, anvendes. For eksempel, Matrigel14,15, og gelatine16,17 bruges til feeder-fri vedligeholdelse kultur hiPSCs. Ifølge Haraguchi et al., hiPSCs seedet på Matrigel blev med succes differentieret i hjertecelleark18.
Der er en række tidligere undersøgelser vedrørende kulturmodeller for sygdomsmodeller ved hjælp af kardiomyocytter afledt af hiPSCs. Med hensyn til modellering af iskæmi-reperfusion skade, manipulationer af det cellulære miljø, såsom hyperkaliæmi, acidose, og laktat akkumulering, er blevet indført19. Andre metoder omfatter celle pelletering for at hindre iltdiffusion20 og metabolisk hæmning ved hjælp afcyanid 21. I den nuværende protokol, celle skade blev opnået ved relativt enkel metode, nemlig 24 h afsavn af ilt og næringsstoffer. Man bør dog være opmærksom på at overveje nøjagtige patofysiologiske processer af den iskæmiske hjertesygdom, da der faktisk er forskelle mellem sygdommen in vivo og sygdomsmodellen i den nuværende protokol, såsom tilstedeværelsen eller fraværet af tredimensionelle cellulære miljø og blod.
Med hensyn til det teknologiske aspekt af evalueringen af cardiomyocyte funktion, Toepfer et al. rapporterede en MatLab-baseret algoritme til at bestemme sarcomere sammentrækning og afslapning i hiPS-CMs22. Smith et al. rapporterede en avanceret metode til høj-throughput elektrofysiologisk analyse af excitable celler stammer fra hiPS-CMs, ved hjælp af sofistikerede nanotopografisk mønstrede multielektrode arrays23,24. Fordelen ved vores protokol er, at det kun kræver konventionel software og forbrugsstoffer, såsom imageJ software og 96-brønd plader.
Med hensyn til iltniveauet i hjertet, ilttrykket i vener, der når hjertet menes at være 40 mmHg25. Ifølge McDougal et al., den ekstracellulære ilttryk under hypoxi skønnes at være <12.8 mmHg26. Ved anvendelse af metoden til runder et al.27beregnes ilttrykket i dyrkningsmediet (saltholdighed: 35‰) under hypoxisk tilstand (2% ilt) ved 37 °C behandlet med den aktuelle protokol til 14,9 mmHg, hvilket er højere end ovenstående skøn. Interessant, Al-Ani et al. rapporterede, at der er en gradient af ilttryk i kulturmediet, og ilttrykket påvirkes af celletype, såning tæthed, og medium volumen28. Typisk iltkoncentrationen i bunden af den kulturplade, hvor cellerne bor, er den laveste. Derfor vil effekten af dybde i kulturmediet yderligere reducere det effektive ilttryk nær hiPS-CMs. For at fremkalde tilstrækkelig skade på hiPS-CMs ved hjælp af hypoxisk tilstand skal der lægges særlig vægt på dybden af medium og cellernes massetæthed.
Vores hiPS-CM model, som er meget tæt på de fysiologiske forhold af menneskelige hjerte myocytter, med fordel efterligner menneskelige IHD. Dyremodelbaserede tilgange omfatter etiske, tekniske og akademiske spørgsmål. Især in vivo modeller kræver en avanceret teknik af mikrokirurgi for at opnå reproducerbare data: f.eks okklusion af den forreste faldende gren af venstre koronararterie hos gnavere3. Den hiPS-CM model, der er beskrevet heri overvinder disse kritiske barrierer og giver en nyttig, relevant og repeterbar platform for hjerte-kar-sygdom.
Der skal dog bemærkes visse begrænsninger. En indlysende forskel mellem iPS-induceret kardiomyocytter og normale kardiomyocytter er fraværet af T-tubuli29,og vi omfattede ikke humoral faktorer såsom vævsskader induceret af leukocytter og aktivering af et komplementsystem i vores undersøgelse. Desuden bør antallet af differentierede kardiomyocytter i denne model (20,7 ± 9,6 %, supplerende figur 3)forbedres. Den nylige publikation af Halloin et al. beskriver en skalerbar, kemisk defineret metode til at fremkalde hiPS-CM renhed på > 95% af kemiske WNT pathway modulatorer uden krav om nogen udvælgelse afmarkører 30. Ikke desto mindre er vores model for humant IHD relativt enkelt og klinisk anvendeligt (f.eks. lægemiddelscreening ved hjælp af patientbaserede iPS-celler). Vores model er også en unik platform til yderligere at belyse mekanismer, der ligger til grund for IHD'er.

Iskæmisk hjertesygdom (IHD) er anerkendt verden over som den hyppigste dødsårsag, og det blev anslået til at være ansvarlig for mere end ni millioner dødsfald i 20161. Forekomsten af hjerte-kar-sygdomme fortsætter med at stige, og globaliseringen synes at have bidraget til forekomsten af hjertesygdomme risikofaktorer i udviklingslandene. Derfor bliver undersøgelsen af IHD mere og mere presserende2.
Eksperimentelle modeller af hjerte-kar-sygdom er afgørende for at studere mekanismerne i sygdom, nøjagtigheden af diagnosen, og udvikling af nye behandlingsformer. Flere forsøgsmodeller er blevet foreslået af mange laboratorier. Det er yderst vigtigt at vælge en model med betydelige fordele; gennemførlighed, repeterbarhed og lighed med sygdomme hos mennesker er nøglefaktorer i udvælgelsen af modeller for hjerte-kar-sygdomme3. Humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) med specifikke kardiomyopati-associerede mutationer er et lovende alternativ til dyremodeller4. Selv om mange strategier er blevet beskrevet for at fremkalde kardiomyocyttervedhjælp af iPSCs5,6,,7,8,9, her giver vi en enkel metode til at producere en IHD-model ved hjælp af cardiomyocytes differentieret fra hiPSCs, hvor møjsommelig udvælgelse af cardiomyocyte ved hjælp af markører ikke anvendes. I denne metode udvælges kardiomyocytter funktionelt ved at analysere spontan sammentrækning.
Induktion af kardiomyocytter ved hjælp af hiPSCs undgår dyr ofre og teknisk vanskelig kirurgi. Etablering af dyremodeller af IHD kræver udfordrende kirurgiske teknikker10. Perfekt simulere de forskellige patofysiologiske aspekter af menneskelige hjertesygdomme såsom puls og handling potentialer fra fysiologi af gnavere er næsten umuligt. Kombineret med moral og etik ved at bruge dyremodeller er det bydende nødvendigt at udvikle andre nye forsøgsmodeller end dyremodeller. Kardiomyocytter differentieret fra menneskelige iPS-celler bedre efterligne den fysiologiske tilstand af det menneskelige hjerte. I denne protokol opretter vi en model af IHD ved hjælp af kardiomyocytter, der er afledt af hiPS-celler (hiPS-CMs). I vores model, afsavn af ilt og glukose fører til et fald i kontraktile kraft og levedygtighed hiPS-CMs. Vores metode giver en ny tilgang til model IHD og demonstrerer en ny platform for studiet af denne sygdom.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>R37112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cardiac troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>MA5-12960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2921201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation enzymes (TrypLE Select)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2921201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2921201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria III system</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescenct microscope</td>
			<td>KEYENCE, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A28175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPS cells</td>
			<td>RIKEN, Tsukuba, Japan</td>
			<td>201B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxic incubator</td>
			<td>SANYO, Osaka, Japan</td>
			<td>MCO-175M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC growth medium (Essential 8 Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A1517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC maintenance medium (StemFit AK02N)</td>
			<td>Ajinomoto, Tokyo, Japan</td>
			<td>RCAK02N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (iMatrix-511)</td>
			<td>Nippi, Tokyo, Japan</td>
			<td>iMatrix-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit)</td>
			<td>Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA</td>
			<td>10009365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>R37606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque, Kyoto, Japan</td>
			<td>35501-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

model of ischemic heart disease and video-based comparison of cardiomyocyte contraction using hipsc-derived cardiomyocytes

Iskæmisk hjertesygdom er en væsentlig dødsårsag på verdensplan. Det har derfor været genstand for en enorm mængde forskning, ofte med små dyremodeller som gnavere. Men fysiologien i det menneskelige hjerte adskiller sig væsentligt fra gnaverhjertets, hvilket understreger behovet for klinisk relevante modeller til undersøgelse af hjertesygdomme. Her præsenterer vi en protokol til model iskæmisk hjertesygdom ved hjælp af kardiomyocytter differentieret fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPS-CMs) og til at kvantificere skader og funktionelle svækkelse af de iskæmiske kardiomyocytter. Eksponering for 2% ilt uden glukose og serum øger procentdelen af tilskadekomne celler, hvilket indikeres ved farvning af kernen med propidium iodid, og nedsætter cellulære levedygtighed. Disse betingelser mindsker også kontraktiliteten af hiPS-CMs som bekræftet ved forskydningsvektorfeltanalyse af mikroskopiske videobilleder. Denne protokol kan desuden give en bekvem metode til personlig lægemiddelscreening ved at lette brugen af hiPS-celler fra individuelle patienter. Derfor kan denne model af iskæmisk hjertesygdom, baseret på iPS-CMs af menneskelig oprindelse, give en nyttig platform for lægemiddelscreening og yderligere forskning i iskæmisk hjertesygdom.

Vellykket differentierede celler viser spontan sammentrækning under mikroskopet (Video 1). Typisk viser 50 % af brøndene spontan sammentrækning i <20 dage (supplerende figur 1). Hjertemarkørprotein (f.eks. cTnT) kan bruges til at bekræfte vellykket differentiering (Figur 2).
Typisk viser celler fra den iskæmiske gruppe lavere levedygtighed i MTT-analyser (figur 3A) og kontraktilitet (figur 3E,F, supplerende figur 2) end dem fra normoxisk kontrolgruppe. Forholdet mellem propidiumidid-positive celler er også højere i den iskæmiske gruppe end i kontrolgruppen (Figur 3B-D), hvilket indikerer højere celleskader.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61104/61104fig01.jpg"> Figur 1: Mappestruktur til forskydningsvektoranalyse ved hjælp af imageJ. "joblist.txt" beskriver stien til filmfiler hver linje. Hvis der er tre filer at analysere, vil der være tre mapper (movie1, movie2 og movie3), hvor "analyze.avi" (filmen af interesse) bør placeres. Når analysen er udført af "vector_analysis.ijm" kode, filer vil blive genereret (angivet med blåt) i hver film mappe. Oplysninger, der er gemt i hver fil, forklares i detaljer i hovedteksten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61104/61104fig02.jpg"> Figur 2: Repræsentativt billede af kartionsmarkørens farvning. Ekspression af hjertemarkørproteinet cardiac troponin T (cTnT). Blå: 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), rød: actin, grøn: cTnT. Indsat: striated udtryk for cTnT, som svarer til sarcomere struktur. Skalabar, 50 μm. Dette tal er blevet ændret fra Wei et al.13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61104/61104fig03.jpg"> Figur 3: Repræsentative billeder af cellulær levedygtighed analyse, vurdering af cellulære skader, og kontraktilitet. (A) Sammenligning af cellulær levedygtighed (MTT-analyse). Højere absorbans indikerer højere levedygtighed. n = 5 for hver betingelse. (B, C og D) Flow cytometri analyse af propidium iodid (PI)-farvede celler. Iskæmiske celler udviser en reduceret fremadgående scatter intensitet og øget PI fluorescens, sammenlignet med kontrol. (D) Procentdel af PI-farvede celler i flowcytometrianalysen. n = 3 for hver betingelse. (E) Analyse af iPS-CMs kontraktilitet ved hjælp af ImageJ software. De røde og blå vektorer angiver henholdsvis de største og mindste sammentrækninger. Skalabar, 100 μm. F) Kvantitativ analyse af iPS-CM-kontraktsledigheden ved hjælp af kode. n = 3 for kontrol og n = 8 for iskæmisk tilstand. Fejllinjer repræsenterer standardfejl i middelværdien. Til den statistiske analyse blev der udført en ikke-udført tosidet students t-test. *: p < 0,05, **: p < 0,01. : p < 0,0001. Dette tal er citeret fra Wei et al.13<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Video 1: Differentierede celler viser spontan sammentrækning under mikroskopet. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104_before.wmv" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
Supplerende figur 1: Kaplan-Meier-analyse af procentdelen af prøver uden spontan sammentrækning. 50% af iPS-CM prøver viste sammentrækning på dag 20. På dag 30 viste 64,4% af prøverne sammentrækning. n = 83. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104supfig01.jpg" target="_blank">Klik her for at downloade dette tal.</a>
Supplerende figur 2: Vurdering af hjertekontraktilitet. Skaleret kontraktilitet opnået ved at dividere kontraktilitet C med antallet af analysepunkter (x, y) blev plottet til kontrol og iskæmisk grupper før og efter eksponeringen for 24 h hypoxi. n = 3 for kontrol og n = 8 for iskæmisk tilstand. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104supfig02.jpg" target="_blank">Klik her for at downloade dette tal.</a>
Supplerende figur 3: Vurdering af indholdet af kardiomyocytter. Immunstaining af hjertemarkørprotein på en 96 brøndplade. Grøn: cTnT, Blå: DAPI. Satsen for de differentierede celler blev beregnet til at være 20,7 ± 9,6% ved at dividere arealet af cTnT-bejdsede region med det område i DAPI-bejdsede region. Skalalinje = 1 mm. n = 4 for kontroltilstand. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104supfig03.jpg" target="_blank">Klik her for at downloade dette tal.</a>
supplerende kodningsfil. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/Supplementary_Coding_File.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Vi præsenterer en model af iskæmisk hjertesygdom ved hjælp af kardiomyocytter stammer fra humane inducerede pluripotente stamceller, sammen med en metode til kvantitativ vurdering af vævsskader forårsaget af iskæmi. Denne model kan give en nyttig platform for narkotika screening og yderligere forskning i iskæmisk hjertesygdom.

Model af iskæmisk hjertesygdom og video-baseret sammenligning af Cardiomyocyte sammentrækning ved hjælp af hiPSC-afledte kardiomyocytter

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Forskning i hjertesygdomme udføres ofte i små og pattedyr som gnavere. Men fysiologien i det menneskelige hjerte adskiller sig væsentligt fra gnaverhjertets. Vores protokol bruger kardiomyocytter differentieret fra menneskelige iPS-celler til model iskæmisk hjertesygdom og til at kvantificere skader og funktionelle svækkelse af iskæmisk kardiomyocytter.Denne protokol kan være en praktisk metode til personlig lægemiddelscreening ved hjælp af iPS-celler, der stammer fra individuelle patienter, passende håndtering af iPS-cellerne, såsom ved hjælp af frisk medium, og ændring af mediet langsomt og punktligt er afgørende for at sikre en vellykket differentiering i funktionelle kardiomyocytter. Demonstration af proceduren med Yun Liu, Yin Liang og Mengxue Wang vil blive Chen Wang, en ph.d.-studerende fra et laboratorium. For at fremkalde human induceret pluripotent stamcelledifferentiering i hjerteceller, første pels brøndene af en 96 godt kultur plade med 100 mikroliter på 1.675 mikrogram per milliliter laminin i PBS.Efter en 30 minutters inkubation ved 37 grader Celsius, se tre gange 10 til den fjerde stamceller i 200 mikroliter af IPS vedligeholdelse medium suppleret med 10 mikromolar Y27632 i hver brønd, og returnere pladen til Cell Culture Inkubator. Efter 24 timer skal supermidlet udskiftes med 200 mikroliter af IPS-vækstmedium pr. brønd, og pladen returneres til Cell Culture Incubator i yderligere to til tre dage. Når cellerne når 70 til 80%sammenløbet.Udskift mediet i hver brønd med 200 mikroliter af forvarperede differentieringsmedium A, og vend pladen tilbage til cellekulturskuvøsen i yderligere 48 timer. I slutningen af inkubationen langsomt erstattet supernatant i hver brønd med 200 mikroliter af prævarmisk differentiering medium B og returnere pladen til Cell Culture Inkubator. Efter to dage skal supernatanterne udskiftes med 200 mikroliter af forvarmt kardiomyocytvedligeholdelsesmedium pr. brønd og returneres pladen til Cell Culture Incubator i op til 30 dage.For at vurdere kardiomyocytternes kontraktilitet skal du installere partikelbilledet velocimetry billede j plugin og bruge et fasekontrastmikroskop og gaflermålet til at optage videobilleder af cellerne med ca. 20 billeder pr. sekund i ca. 10 sekunder. Gem derefter videofilen som analyseret vores API og opret en mappestruktur som angivet. Hvis du vil analysere separate todimensionale vektorfelter for celleforskydning, skal du starte VG og vælge plugins, makroer og redigere for at åbne vektoranalyse.ijm, og klik derefter på kør, udføres analysen automatisk. Til iskæmisk behandling skal supernatanten udskiftes i hver brønd med 200 mikroliter dmem uden glukose og serum, og derefter placeres pladen i et hypoxisk kammer, hvortil den indgyder nitrogengas i kammeret, hvilket fastholder den interne iltkoncentration på 2 % og kuldioxidkoncentrationen på 5 % i 24 timer. Vellykket differentierede celler, viser spontan sammentrækning som observeret under mikroskopet med 50% af kulturbængterne typisk udviser spontan sammentrækning på mindre end 20 dage.Cardiac markør protein kan også bruges til at bekræfte en vellykket differentiering Celler fra iskæmisk gruppe typisk udviser en lavere levedygtighed i MTT assays, og en lavere kontraktilitet end dem fra normoxiske kontrolgruppe. Forholdet mellem propidium iodid positive celler er også højere i den iskæmiske gruppe, end i kontrolgruppen, hvilket indikerer en højere forekomst af cellulære skader. Det er vigtigt, at du præcist lokalisere regioner af interesse i fange plade til at tillade sammenligning af kontraktilitet af kardiomyocytter.Denne teknik kan bruges til lægemiddelscreening, ved hjælp af patient afledte iPS-celler. Det giver også en unik platform for yderligere belysning af de mekanismer, der ligger til grund for iskæmiske hjertesygdomme

Research

JoVE Journal

Medicine

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Vurdering af hjertefunktion og Myocardial morfologi Brug Small Animal Look-skab Inversion Recovery (SALLI) MRI i rotter

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Implantation of Total Artificial Heart in Congenital Heart Disease

Implantation af alt kunstige hjerte i medfødt hjertesygdom

In patients with end-stage heart failure (HF), a total artificial heart (TAH) may be implanted as a bridge to cardiac transplant. However, in congenital ...

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

En guide til generering og brug hiPSC Afledte NPC&#39;ere for Studiet af neurologiske sygdomme

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Demonstration of the Rat Ischemic Skin Wound Model

Demonstration af Rat iskæmisk hudsår Model

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Isolering af atrieflimren Cardiomyocytes fra en rotte Model af metabolisk syndrom-relaterede hjertesvigt med bevarede uddrivningsfraktion

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet måling af musen mesenterica arterie ved hjælp af Wire blodkar

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Implantation af hiPSC-afledte hjertemuskulaturen programrettelser efter Myokardie skade i et marsvin Model

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Generation af ventrikulær-lignende HiPSC-afledte Kardiomyocytter og høj kvalitet celle præparater til calcium håndtering karakterisering

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Elektromekanisk vurdering af optogenetisk moduleret kardiomyocyt aktivitet

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...