हृदय रोग अनुसंधान अक्सर छोटे और स्तनधारियों जैसे कृंतक में किया जाता है। हालांकि, मानव हृदय का शरीर विज्ञान कृंतक हृदय से काफी अलग है। हमारा प्रोटोकॉल मानव आईपीएस कोशिकाओं से मॉडल इस्कीमिक हृदय रोग के लिए विभेदित कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करता है और इस्केमिक कार्डियोमायोसाइट्स के नुकसान और कार्यात्मक हानि की मात्रा निर्धारित करने के लिए।
यह प्रोटोकॉल व्यक्तिगत रोगियों से प्राप्त आईपीएस कोशिकाओं का उपयोग करके व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान कर सकता है, आईपीएस कोशिकाओं की उचित हैंडलिंग, जैसे ताजा माध्यम का उपयोग करना, और कार्यात्मक कार्डियोमायोसाइट्स में एक सफल भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे और विराम पर होना माध्यम को बदलना महत्वपूर्ण है। यूं लियू, यिन लियांग और Mengxue वांग के साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन चेन वांग, एक प्रयोगशाला से पीएचडी के छात्र होंगे । हृदय कोशिकाओं में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल भेदभाव प्रेरित करने के लिए, पहले कोट एक ९६ अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के कुओं के साथ १.६७५ माइक्रोग्राम के १०० माइक्रोलीटर के साथ PBS में लेमिनिन के मिलीलीटर प्रति ।
३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन 30 मिनट के बाद, आईपीएस रखरखाव माध्यम के २०० माइक्रोलीटर में चौथे स्टेम सेल के लिए तीन बार 10 प्रत्येक अच्छी तरह से 10 micromolar Y27632 के साथ पूरक देखें, और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर को थाली वापस । 24 घंटे के बाद, सुपर साधनों को आईपीएस विकास माध्यम के 200 माइक्रोलीटर के साथ बदलें, और प्लेट को दो से तीन दिनों के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें। जब कोशिकाएं 70 से 80% तक पहुंच जाती हैं।
प्रत्येक कुएं में मध्यम को पूर्व गरम विभेदन माध्यम ए के 200 माइक्रोलीटर के साथ बदलें और प्लेट को एक और 48 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें। इनक्यूबेशन के अंत में धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं में सुपरनेट की जगह पूर्व गरम विभेदन मध्यम बी के 200 माइक्रोलीटर के साथ और सेल कल्चर इनक्यूबेटर को प्लेट वापस करें। दो दिनों के बाद, सुपरनेटेंट को प्रति अच्छी तरह से पूर्व गर्म कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम के 200 माइक्रोलीटर के साथ बदलें और प्लेट को 30 दिनों तक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में लौटा दिया।
कार्डियोमायोसाइट्स की संकुचनता का आकलन करने के लिए, कण छवि वेलोसिमेट्री इमेज जे प्लगइन स्थापित करें और लगभग 10 सेकंड के लिए लगभग 20 फ्रेम प्रति सेकंड पर कोशिकाओं की वीडियो छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप और कांटे उद्देश्य का उपयोग करें। फिर हमारे एपीआई का विश्लेषण करते हुए वीडियो फ़ाइल को सहेजें और संकेत के अनुसार एक फ़ोल्डर संरचना बनाएं। सेलुलर विस्थापन के दो आयामी वेक्टर क्षेत्रों का विश्लेषण करने के लिए, वीजी लॉन्च करें और वेक्टर विश्लेषण खोलने के लिए प्लगइन्स, मैक्रो और एडिट का चयन करें।
ijm, तो क्लिक करें चलाने के विश्लेषण स्वचालित रूप से किया जाएगा। इस्कीमिक उपचार के लिए, ग्लूकोज और सीरम के बिना डीएमईएम के 200 माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक कुएं में सुपरनिटेंट को बदलें, फिर प्लेट को हाइपोक्सिक चैंबर में रखें, फिर कक्ष में नाइट्रोजन गैस का संचार करें, आंतरिक ऑक्सीजन एकाग्रता को 2% पर बनाए रखें और कार्बन डाइऑक्साइड एकाग्रता 24 घंटे के लिए 5% पर। सफलतापूर्वक विभेदित कोशिकाओं, सहज संकुचन को दर्शाता है जैसा कि माइक्रोस्कोप के नीचे 50% संस्कृति कुओं के साथ मनाया जाता है, आमतौर पर 20 दिनों से भी कम समय में सहज संकुचन का प्रदर्शन होता है।
कार्डियक मार्कर प्रोटीन का उपयोग इस्कीमिक समूह से एक सफल विभेदन कोशिकाओं की पुष्टि करने के लिए भी किया जा सकता है, आमतौर पर एमटीटी परख में कम व्यवहार्यता प्रदर्शित करता है, और नॉर्मॉक्सिक नियंत्रण समूह की तुलना में कम संकुचन। नियंत्रण समूह की तुलना में इस्कीमिक समूह में प्रोपिडियम आयोडाइड पॉजिटिव कोशिकाओं का अनुपात भी अधिक है, जो सेलुलर क्षति की अधिक घटना का संकेत है। यह महत्वपूर्ण है कि आप सही कब्जा प्लेट में ब्याज के क्षेत्रों का पता लगाने के लिए कार्डियोमायोसाइट्स की संकुचन की तुलना की अनुमति है ।
इस तकनीक का उपयोग रोगी व्युत्पन्न आईपीएस कोशिकाओं का उपयोग करते हुए दवा स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है। यह इस्कीमिक हृदय रोगों में अंतर्निहित तंत्र को और स्पष्ट करने के लिए एक अनूठा मंच भी प्रदान करता है
