Hjertesykdomforskning utføres ofte i små og pattedyr som gnagere. Imidlertid er fysiologien til det menneskelige hjerte betydelig forskjellig fra gnagerhjertet. Vår protokoll bruker kardiomyocytter differensiert fra menneskelige iPS-celler til modell iskemisk hjertesykdom og for å kvantifisere skaden og funksjonsnedsettelsen av iskemiske kardiomyocytter.
Denne protokollen kan gi en praktisk metode for personlig legemiddelscreening ved hjelp av iPS-celler avledet fra individuelle pasienter, riktig håndtering av iPS-cellene, for eksempel ved bruk av friskt medium, og endring av mediet sakte og punktlig er avgjørende for å sikre en vellykket differensiering til funksjonelle kardiomyocytter. Demonstrerte prosedyren med Yun Liu, Yin Liang og Mengxue Wang vil være Chen Wang, en ph.d.-student fra et laboratorium. For å indusere human indusert pluripotent stamcelledilatering i hjerteceller, må du først belegge brønnene til en 96 brønnkulturplate med 100 mikroliter på 1,675 mikrogram per milliliter laminin i PBS.
Etter en 30 minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius, se tre ganger 10 til fjerde stamceller i 200 mikroliter i IPS vedlikeholdsmedium supplert med 10 mikromolar Y27632 inn i hver brønn, og returnere platen til Cell Culture Inkubator. Etter 24 timer, erstatt super midler med 200 mikroliter av IPS vekst medium per brønn, og returnere platen til Cell Culture Inkubator for ytterligere to til tre dager. Når cellene når 70 til 80% samløpet.
Erstatt mediet i hver brønn med 200 mikroliter forhåndsoppvarmet differensieringsmedium A og returner platen til Cell Culture Incubator i ytterligere 48 timer. På slutten av inkubasjonen erstattet sakte supernatanten i hver brønn med 200 mikroliter forhåndsoppvarmet differensieringsmedium B og returnere platen til Cell Culture Incubator. Etter to dager, erstatt supernativa med 200 mikroliter pre oppvarmet kardiomyocytt vedlikeholdsmedium per brønn og returnerte platen til Cell Culture Incubator i opptil 30 dager.
For å vurdere kontraktiliteten til kardiomyocytter, installere partikkelbilde velocimetry bilde j plugin og bruke en fase kontrast mikroskop og gafler mål å ta opp videobilder av cellene på ca 20 bilder per sekund i ca 10 sekunder. Lagre deretter videofilen som analysert vår API og opprett en mappestruktur som angitt. For å analysere diskrete todimensjonale vektorfelt for mobilforskyvning, start VG og velg plugins, makroer og redigering for å åpne vektoranalyse.
ijm, og klikk deretter kjør analysen vil bli utført automatisk. For iskemisk behandling, erstatt supernatanten i hver brønn med 200 mikroliter dmem uten glukose og serum, og plasser deretter platen i et hypoksisk kammer og infuse nitrogengass i kammeret, og opprettholde den interne oksygenkonsentrasjonen på 2%og karbondioksidkonsentrasjonen på 5% i 24 timer. Vellykket differensierte celler, demonstrerer spontan sammentrekning som observert under mikroskopet med 50% av kulturbrønnene som vanligvis viser spontan sammentrekning på mindre enn 20 dager.
Hjertemarkørprotein kan også brukes til å bekrefte en vellykket differensiering Celler fra den iskemiske gruppen viser vanligvis en lavere levedyktighet i MTT-analyser, og en lavere kontraktilitet enn de fra den normoxiske kontrollgruppen. Forholdet mellom propidiumjodidpositive celler er også høyere i iskemisk gruppe, enn i kontrollgruppen, noe som indikerer en høyere forekomst av cellulær skade. Det er viktig at du nøyaktig finner regionene av interesse i fangstplaten for å tillate sammenligning av kontraktiliteten til kardiomyocytter.
Denne teknikken kan brukes til legemiddelscreening, ved hjelp av pasienter avledet iPS-celler. Det gir også en unik plattform for ytterligere å belyse mekanismene som ligger til grunn for iskemiske hjertesykdommer
