Name: model of ischemic heart disease and video-based comparison of cardiomyocyte contraction using hipsc-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2020-05-05T15:00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo JSPS KAKENHI, Fundo para a Promoção da Pesquisa Internacional Conjunta (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Os autores agradecem o Laboratório Central de Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de Okayama pela assistência da FACS.

1. cultura de manutenção hiPSC
<ol><li>Cubra uma placa de cultura de seis poços com laminina(Tabela de Materiais).<ol>
<li>Diluir laminina para 0,5 μg/mL em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS).</li>
		<li>Adicione laminina diluída a uma placa de seis poços a um volume de 2,0 mL/bem.</li>
		<li>Incubar a placa a 37 °C por 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova a solução de laminina dos poços.</li>
	<li>HiPSCs de sementes em 2 mL de meio de manutenção iPSC (Tabela de Materiais) sobre os poços revestidos a uma densidade de 3 × 104 células/poço sem secar a superfície.</li>
	<li>Subcultura os hiPSCs.<ol>
<li>Prepare 0,5× enzimas de dissociaçãocelular (Tabela de Materiais).<ol>
<li>Misture 10 μL de 0,5 M EDTA/PBS ( EDTA) e 10 mL de PBS para fazer 0,5 mM EDTA/PBS.</li>
			<li>Diluir 10 mL de enzimas de dissociação celular de 1× a 0,5× adicionando 10 mL de 0,5 mM EDTA/PBS.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aspire o meio gasto dos poços.</li>
		<li>Adicione 2 mL/poço de PBS para lavar as células e, em seguida, descarte o PBS.</li>
		<li>Adicione 800 μL das enzimas de dissociação celular de 0,5× e incuba as células por 7 min a 37 °C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2. NOTA: 0,05% trypsin-EDTA pode ser usado para dissociar células.</li>
		<li>Remova suavemente a solução de enzimas de dissociação de células de 0,5×.</li>
		<li>Lave as células com PBS de 2 mL e descarte o PBS. NOTA: Seja gentil porque as células se desprendem facilmente após a adição de enzimas de dissociação celular.</li>
		<li>Adicione 1 mL de meio de manutenção iPS(Tabela de Materiais)contendo 10 μM Y-27632. NOTA: Adicionar Y-27632 aumenta a taxa de sobrevivência dos hiPSCs.</li>
		<li>Desalojar células usando um raspador de células, e colecioná-las em um tubo centrífuga de 15 mL.</li>
		<li>Conte o número de células. Ajuste a densidade celular para 1,5 × 104 células/mL adicionando meio de manutenção iPS contendo 10 μM Y-27632. NOTA: Não utilize centrífugas para evitar danos celulares.</li>
		<li>Semente 2 mL de mistura celular na placa de seis poços revestida de laminina (densidade final: 3 × 104 células/bem).</li>
		<li>Incubar as células a 37 °C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2.</li>
		<li>Substitua o meio de cultura por meio de manutenção iPS sem Y-27632 nos dias 1, 4, 5 e 6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Subcultura das células no dia 7. NOTA: Subcultura as células até o dia 7, a fim de inibir a diferenciação aleatória de hiPSCs.</li>
</ol>2. Indução da diferenciação cardíaca dos hiPSCs
<ol><li>Cubra uma placa de cultura de 96 poços com laminina (Tabela de Materiais).<ol>
<li>Diluir laminina a 1.675 μg/mL com PBS.</li>
		<li>Adicione a solução de laminina diluída a uma placa de 96 poços a um volume de 0,1 mL/bem.</li>
		<li>Incubar a placa a 37 °C por 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HiPSCs de sementes em uma placa de 96 poços a uma densidade de 3 × 104 células/bem.</li>
	<li>Proliferem hiPSCs a 37 °C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2.<ol>
<li>Um dia depois, substitua o meio por 200 μL/bem iPS de crescimento(Tabela de Materiais).</li>
		<li>Troque o meio todos os dias por mais 2 a 3 dias até que as células atinjam 70%-80% de confluência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplique mídia de diferenciação.<ol>
<li>Aspire o meio gasto e substitua-o lentamente por 200 μL/bem do meio de diferenciação pré-aquecido A (Tabela de Materiais).</li>
		<li>Coloque a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2.</li>
		<li>Após 48h, aspire o médio e substitua-o lentamente por 200 μL/bem de meio de diferenciação pré-aquecido B(Tabela de Materiais).</li>
		<li>Coloque a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2. NOTA: É extremamente importante que os meios de diferenciação sejam mantidos frescos. Eles gradualmente perderão seu efeito de diferenciação, tipicamente dentro de duas semanas. Se necessário, aliquot médio fresco e armazenar a −20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplique meio de manutenção de cardiomiócitos.<ol>
<li>Após 48h, aspire o médio e substitua-o lentamente por 200 μL/bem de meio de manutenção de cardiomiócito pré-aquecido(Tabela de Materiais).</li>
		<li>Coloque a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2.</li>
		<li>Substitua o meio de diferenciação de cardiomiócitos a cada dois dias até o dia 30. NOTA: É importante que a duração da aplicação das mídias de diferenciação A e B seja fixada com precisão para 48h para garantir a sequência de expressão precisa dos genes necessários para a diferenciação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Exposição à isquemia
<ol><li>Privar o meio cultural de nutrientes e oxigênio.<ol>
<li>Prepare o meio Eagle modificado (DMEM) modificado de Dulbecco sem glicose e soro.</li>
		<li>Meio de cultura aspirada dos poços da placa de 96 poços contendo hiPS-CMs.</li>
		<li>Adicione o meio de privação de nutrientes aos poços a um volume de 200 μL/bem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque a placa de cultura em uma incubadora hipoxica(Tabela de Materiais).</li>
	<li>Infundir gás nitrogênio e manter a concentração interna de oxigênio em 2% e concentração de CO2 a 5% por 24 h.</li>
	<li>Proceder às análises desejadas: por exemplo,ensaio de viabilidade, avaliação da contratilidade ou avaliação de danos celulares.</li>
</ol>4. Avaliação da viabilidade celular utilizando ensaio MTT
<ol><li>Utilize o kit de ensaio MTT (Tabela de Materiais) para avaliar quantitativamente a viabilidade das células. NOTA: A exposição ao peróxido de hidrogênio de 1 mM no DMEM por 1 h pode ser usada para danificar células (controle positivo). A exposição ao peróxido de hidrogênio de 0 mM no DMEM pode ser usada para o controle negativo.<ol>
<li>Adicione 10 μL de reagente MTT às células usando um pipettor repetitivo.</li>
		<li>Misture suavemente por um minuto em um agitador orbital.</li>
		<li>Incubar as células por 3-4 h a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%. Após a incubação, o formazan produzido nas células aparecerá como cristais escuros na parte inferior dos poços.</li>
		<li>Depois de remover o supernasce, dissolva os cristais formazan insolúveis em 100 μL de solução de sulfóxido de dimetil (DMSO). Esta solução dissolverá os cristais formazan, produzindo uma solução roxa. ATENÇÃO: O DMSO pode irritar os olhos, o sistema respiratório e a pele. Use luvas adequadas e proteção olho/rosto.</li>
		<li>Meça a absorvância de cada amostra com um leitor de microplaca a um comprimento de onda de 570 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Avaliação da contratação de iPS-CMs
<ol><li>Se não estiver instalado, obtenha o plugin Velocimetria de Imagem de Imagem de PartículasJ11 em https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv e instale.</li>
	<li>Usando um microscópio de contraste de fase, grave as imagens de vídeo de hiPS-CMs usando a lente objetiva de 4× a ~20 quadros por segundo para ~10 s e salve como "analyze.avi". Para uma comparação da contração entre antes e depois da isquemia, confirme que a localização de juros está registrada. NOTA: Um microscópio com um estágio automatizado é útil para atingir a localização de interesse. O arquivo do filme deve estar em formato .avi para análise posterior. Se não, converta o filme em .avi.</li>
	<li>Crie estrutura de pastas conforme indicado na Figura 1. Um exemplo de "joblist.txt" é indicado em arquivo suplementar.</li>
	<li>Analise campos vetoriais bidimensionais discretos de deslocamento celular.<ol>
<li>Inicie o software Fiji (ImageJ)12, vá para Plugins > Macros > Edite e abra "vector_analysis.ijm" (Arquivo de Codificação Suplementar).</li>
		<li>Clique em Executar. A análise será realizada automaticamente. NOTA: Os vetores de deslocamento D(x,y) são calculados para cada 16 × 16 pixels entre o quadro de referência (o primeiro quadro) e todos os quadros subsequentes (quadros 1 vs. 2, 1 vs. 3, 1 vs. 4, etc.). O resultado é calculado para cada quadro e salvo como "vec_x.txt"(x é um número de quadro). Um vetor de deslocamento máximo, M(x, y), é definido para cada par (x, y) da seguinte forma: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61104/61104equ01.jpg"> onde k representa o número do quadro em que | Dk (x,y)| = max [| D2 (x,y)|, | D3 (x,y)|, ..., | Dn (x,y)|] e n denota o último quadro. O resultado é salvo como "Max_vector.txt". | M(x, y)| representa o deslocamento máximo causado pela contração do cardiomiócito no ponto de análise (x, y). O valor de contratação C em unidades arbitrárias é calculado da seguinte forma: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61104/61104equ02.jpg"> Este valor é salvo na coluna 7, linha 1 no "Max_vector.txt". C representa a soma do deslocamento para todos (x, y). Quanto maior a porção onde o deslocamento devido à contração do miocárdio é grande, maior o valor de C. O campo vetorial de deslocamento máximo, M(x, y), é sobreposto com imagem de contraste de fase do primeiro quadro ("Phase_contrast.png") e salvo como "Overlaid.png". Como a magnitude do vetor de deslocamento é calculada com base no primeiro quadro do vídeo, é preferível que os hiPS-CMs estejam em período diastólico de repouso para o primeiro quadro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Avaliação dos danos celulares usando citometria de fluxo
<ol><li>Diluir uma solução de 1 mg/mL de iodeto de propidium para 1:1.000 em PBS.</li>
	<li>Manche as células separadas com iodeto de propídio.<ol>
<li>Aspire o meio e coloque-o em um tubo centrífuga de tamanho apropriado.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 1.000 × g por 5 min, e remover cuidadosamente o supernacido para não perder células sedimentadas.</li>
		<li>Incubar as células com a solução de iodeto de propidium diluído à temperatura ambiente por 15 minutos no escuro.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 1.000 × g por 5 min, e remover cuidadosamente o supernacido para não perder células sedimentadas.</li>
		<li>Reconstitua as células em ~1 mL de PBS. NOTA: É importante coletar células flutuantes separadas do meio para quantificar com precisão os danos celulares.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manchas presas com iodeto de propídio.<ol>
<li>Lave as células presas duas vezes com PBS suavemente e, em seguida, descarte o PBS.</li>
		<li>Incubar as células com a solução de iodeto de propídio diluído por 15 minutos no escuro.</li>
		<li>Aspire a solução de iodeto de propídio.</li>
		<li>Despepeme as células usando 0,25% de trippsina. Mova a solução celular para um tubo de centrífuga.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 1.000 × g por 5 min, e remover cuidadosamente o supernacido para não perder células sedimentadas.</li>
		<li>Reconstitua as células em ~1 mL de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misture as células flutuantes e anexadas para análise de triagem celular ativada por fluorescência (FACS).</li>
	<li>Passe a solução celular através de um filtro de 30 μm. NOTA: Passar as células para um filtro é muito importante para uma medição fácil precisa.</li>
	<li>Analise as amostras usando um sistema FACS.</li>
</ol>7. Imunostaining
<ol><li>Conserte a amostra celular.<ol>
<li>Aspirar o meio de cultura.</li>
		<li>Adicione 4% de paraformaldeído em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave as células três vezes com PBS. NOTA: Recomenda-se uma solução de paraformaldeído fresco para a fixação ideal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilize as células com 0,2% Triton X-100 por 15 min, depois descarte o reagente.</li>
	<li>Adicione 3% de albumina de soro bovino para bloquear as células por 30 minutos.</li>
	<li>Aplique anticorpo primário.<ol>
<li>Descarte a solução de albumina de soro bovino da placa de cultura.</li>
		<li>Incubar as células com anticorpos primários durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Remova a solução de anticorpos.</li>
		<li>Lave as células três vezes com PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplique anticorpo secundário.<ol>
<li>Descarte a solução PBS da placa de cultura.</li>
		<li>Incubar as células com anticorpos secundários por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. NOTA: O anticorpo monoclonal do rato anti-cardíaco primário T (TNNT2) é usado a uma diluição de 1:750 em 3% de BSA. O anticorpo anti-rato de cabra secundário Alexa Fluor 488 conjugado é diluído para 1:1.000 em 3% BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloração adicional de núcleo e fibras de actina.<ol>
<li>Remova a solução de anticorpos.</li>
		<li>Incubar as células no reagente de coloração do núcleo(Tabela de Materiais) e no reagente de coloração actin(Tabela de Materiais) em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. NOTA: 4', 6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) ou Hoechst 33342 podem ser usados para coloração nuclear.</li>
		<li>Lave as células três vezes com PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Capture imagens de fluorescência usando um microscópio de fluorescência.</li>
</ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+and+tissue+engineering+strategies+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening.</a> Biotechnology Advances. 35 (1), 77-94 (2017).</li><li>Sitkovsky, M., Lukashev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+immune+cells+by+local-tissue+oxygen+tension:+HIF1+alpha+and+adenosine+receptors.">Regulation of immune cells by local-tissue oxygen tension: HIF1 alpha and adenosine receptors.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (9), 712-721 (2005).</li><li>McDougal, A. D., Dewey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+oxygen+requirements+in+ischemic+cardiomyocytes.">Modeling oxygen requirements in ischemic cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11760-11776 (2017).</li><li>Rounds, S. A., Wilde, F. D., Ritz, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+A6.+Section+6.2.">Chapter A6. Section 6.2.</a> Dissolved oxygen. Report No. 09-A6.2. , (2006).</li><li>Al-Ani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygenation+in+cell+culture:+Critical+parameters+for+reproducibility+are+routinely+not+reported.">Oxygenation in cell culture: Critical parameters for reproducibility are routinely not reported.</a> PLoS One. 13 (10), 0204269 (2018).</li><li>Cadet, J. S., Kamp, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Recipe+for+T-Tubules+in+Human+iPS+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">A Recipe for T-Tubules in Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 121 (12), 1294-1295 (2017).</li><li>Halloin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+WNT+Control+Enables+Advanced+hPSC+Cardiac+Processing+and+Prognostic+Surface+Marker+Identification+in+Chemically+Defined+Suspension+Culture.">Continuous WNT Control Enables Advanced hPSC Cardiac Processing and Prognostic Surface Marker Identification in Chemically Defined Suspension Culture.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 366-379 (2019).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os pesquisadores frequentemente usam modelos de pequenos animais de laboratório para realizar experimentos de IHD. Aqui, desenvolvemos um modelo de cultura celular de IHD humano para realizar tais experimentos.
O principal problema que um usuário deste protocolo pode enfrentar é a baixa taxa de cardiomiócitos diferenciados. Vários passos devem ser tomados com muito cuidado para melhorar a taxa de diferenciação bem sucedida: (a) ser suave ao pipetar porque as células se desprendem facilmente após a adição das enzimas de dissociação celular reagente, (b) adicionar Y-27632 aumenta a taxa de sobrevivência das células iPS ao se desprender, e (c) o tempo de mudanças médias no início da diferenciação deve ser precisamente 48h de distância para garantir a expressão controlada dos genes envolvidos na diferenciação.
Em relação às proteínas de matriz extracelular utilizadas para o revestimento da superfície da placa de cultura, outros materiais que não a laminina usamos neste protocolo podem ser utilizados. Por exemplo, Matrigel14,15e gelatina16,17 são usados para a cultura de manutenção livre de alimentador de hiPSCs. De acordo com Haraguchi et al., os hiPSCs semeados em Matrigel foram diferenciados com sucesso na folha de células cardíacas18.
Há uma série de estudos anteriores sobre modelos culturais para modelagem de doenças usando cardiomiócitos derivados de hiPSCs. Quanto à modelagem da lesão isquemia-reperfusão, foram introduzidasmanipulaçõesdo ambiente celular, como hipercalemia, acidose e acúmulo de lactato. Outros métodos incluem a pelotização celular para dificultar a difusão de oxigênio20 e a inibição metabólica usando cianeto21. No protocolo atual, a lesão celular foi alcançada por método relativamente simples, ou seja, privação de oxigênio e nutrientes de 24h. No entanto, deve-se tomar cuidado para considerar processos fisiopatológicos precisos da doença isquêmica do coração, pois há de fato diferenças entre a doença in vivo e o modelo de doença do protocolo atual, como a presença ou ausência de ambiente celular tridimensional e sangue.
Quanto ao aspecto tecnológico da avaliação da função cardiomiócito, Toepfer et al. relataram um algoritmo baseado em MatLab para determinar contração e relaxamento de sarcomere em hiPS-CMs22. Smith et al. relataram um método avançado de análise eletrofisiológica de alto rendimento de células excitáveis derivadas de hiPS-CMs, utilizando matrizes multieleditos padronizadas nanotopograficamente sofisticadas23,,24. A vantagem do nosso protocolo é que ele só requer software convencional e consumíveis, como software imageJ e placas de 96 poços.
Com relação ao nível de oxigênio no coração, acredita-se que a pressão de oxigênio nas veias que atingem o coração seja de 40 mmHg25. De acordo com McDougal et al., estima-se que a pressão extracelular de oxigênio sob hipóxia seja <12,8 mmHg26. Aplicando-se o método de Rounds et al.27, calcula-se que a pressão de oxigênio no meio da cultura (salinidade: 35⁄) sob a condição hipoxica (2% de oxigênio) a 37 °C tratada com o protocolo atual é calculada como sendo de 14,9 mmHg, o que é maior do que a estimativa acima. Curiosamente, Al-Ani et al. relataram que há um gradiente de pressão de oxigênio no meio da cultura, e a pressão de oxigênio é afetada pelo tipo celular, densidade de semeadura e volume médio28. Normalmente, a concentração de oxigênio na parte inferior da placa de cultura onde as células residem é a mais baixa. Portanto, o efeito da profundidade no meio da cultura reduziria ainda mais a pressão efetiva de oxigênio perto de hiPS-CMs. Para induzir danos suficientes aos hiPS-CMs usando condição hipóxica, deve-se prestar atenção à profundidade do meio e à densidade das células.
Nosso modelo hiPS-CM, que é muito próximo das condições fisiológicas dos miócitos cardíacos humanos, imita vantajosamente a DIC humana. As abordagens baseadas em modelos animais incluem questões éticas, técnicas e acadêmicas. Particularmente, os modelos in vivo requerem uma técnica avançada de microcirurgia para alcançar dados reprodutíveis: por exemplo, oclusão do ramo descendente anterior da artéria coronária esquerda em roedores3. O modelo hiPS-CM descrito aqui supera essas barreiras críticas e fornece uma plataforma útil, relevante e repetível para doenças cardiovasculares.
No entanto, algumas limitações devem ser observadas. Uma diferença óbvia entre cardiomiócitos induzidos pelo iPS e cardiomiócitos normais é a ausência de T-túbulos29, e não incluímos fatores humorais, como danos teciduais induzidos por leucócitos e ativação de um sistema complementar em nosso estudo. Além disso, deve ser melhorada a taxa de cardiomiócitos diferenciados nesse modelo (20,7 ± 9,6%, Figura Suplementar 3). A recente publicação de Halloin et al. descreve um método escalável e quimicamente definido para induzir a pureza hiPS-CM de >95% por moduladores químicos de vias WNT sem a necessidade de qualquer seleção por marcadores30. No entanto, nosso modelo de IHD humano é relativamente simples e clinicamente aplicável (por exemplo, rastreamento de medicamentos usando células iPS derivadas do paciente). Nosso modelo também é uma plataforma única para elucidar ainda mais mecanismos subjacentes a IHDs.

A doença isquêmica do coração (IC) é reconhecida mundialmente como a principal causa de morte, e foi estimada como responsável por mais de nove milhões de mortes em 20161. A prevalência de doenças cardiovasculares continua a aumentar, e a globalização parece ter contribuído para a prevalência de fatores de risco de doenças cardíacas nos países em desenvolvimento. Portanto, o estudo da IHD está se tornando cada vez mais urgente2.
Modelos experimentais de doenças cardiovasculares são fundamentais para o estudo dos mecanismos da doença, precisão do diagnóstico e desenvolvimento de novas terapias. Vários modelos experimentais foram propostos por muitos laboratórios. É de extrema importância escolher um modelo com vantagens significativas; viabilidade, repetibilidade e similaridade com a doença humana são fatores-chave na seleção dos modelos de doenças cardiovasculares3. Células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) portadoras de mutações específicas associadas à cardiomiopatia são uma alternativa promissora aos modelos animais4. Embora muitas estratégias tenham sido descritas para induzir cardiomiócitos utilizando iPSCs5,,6,,7,,8,aquifornecemos um método simples para produzir um modelo de IHD utilizando cardiomiócitos diferenciados dos hiPSCs, nos quais não é aplicada a seleção laboriosa de cardiomócito usando marcadores. Neste método, os cardiomiócitos são selecionados funcionalmente pela análise da contração espontânea.
A indução de cardiomiócitos usando hiPSCs evita sacrifício animal e cirurgia tecnicamente difícil. Estabelecer modelos animais de YD requer técnicas cirúrgicas desafiadoras10. Simular perfeitamente os vários aspectos fisiofisiológicos de doenças cardíacas humanas, como a frequência cardíaca e os potenciais de ação da fisiologia dos roedores, é quase impossível. Aliado à moralidade e ética do uso de modelos animais, o desenvolvimento de novos modelos experimentais que não sejam modelos animais é imperativo. Cardiomiócitos diferenciados das células iPS humanas melhor imitam o estado fisiológico do coração humano. Neste protocolo, estabelecemos um modelo de IHD utilizando cardiomiócitos derivados de células hiPS (hiPS-CMs). Em nosso modelo, a privação de oxigênio e glicose leva a uma diminuição da força contratil e da viabilidade dos hiPS-CMs. Nosso método fornece uma nova abordagem para o modelo de IHD e demonstra uma nova plataforma para o estudo dessa doença.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>R37112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cardiac troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>MA5-12960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2921201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation enzymes (TrypLE Select)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2921201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2921201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria III system</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescenct microscope</td>
			<td>KEYENCE, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A28175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPS cells</td>
			<td>RIKEN, Tsukuba, Japan</td>
			<td>201B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxic incubator</td>
			<td>SANYO, Osaka, Japan</td>
			<td>MCO-175M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC growth medium (Essential 8 Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A1517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC maintenance medium (StemFit AK02N)</td>
			<td>Ajinomoto, Tokyo, Japan</td>
			<td>RCAK02N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (iMatrix-511)</td>
			<td>Nippi, Tokyo, Japan</td>
			<td>iMatrix-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit)</td>
			<td>Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA</td>
			<td>10009365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>R37606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque, Kyoto, Japan</td>
			<td>35501-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

model of ischemic heart disease and video-based comparison of cardiomyocyte contraction using hipsc-derived cardiomyocytes

Doença isquêmica do coração é uma causa significativa de morte em todo o mundo. Tem sido, portanto, objeto de uma enorme quantidade de pesquisas, muitas vezes com modelos de pequenos animais, como roedores. No entanto, a fisiologia do coração humano difere significativamente da do coração roedor, ressaltando a necessidade de modelos clinicamente relevantes para estudar doenças cardíacas. Aqui, apresentamos um protocolo para modelar doenças isquêmicas do coração usando cardiomiócitos diferenciados das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPS-CMs) e quantificar os danos e o comprometimento funcional dos cardiomiócitos isquêmicos. A exposição a 2% de oxigênio sem glicose e soro aumenta a porcentagem de células feridas, o que é indicado pela coloração do núcleo com iodeto propidium, e diminui a viabilidade celular. Essas condições também diminuem a contratibilidade dos hiPS-CMs, conforme confirmado pela análise de campo vetorial de deslocamento de imagens de vídeo microscópicas. Este protocolo pode, além disso, fornecer um método conveniente para a triagem personalizada de medicamentos, facilitando o uso de células hiPS de pacientes individuais. Portanto, este modelo de doença isquêmica do coração, baseado em iPS-CMs de origem humana, pode fornecer uma plataforma útil para o rastreamento de medicamentos e novas pesquisas sobre doenças isquêmicas do coração.

Células diferenciadas com sucesso mostram contração espontânea sob o microscópio(Vídeo 1). Normalmente, 50% dos poços apresentam contração espontânea em <20 dias(Figura Suplementar 1). A proteína do marcador cardíaco (por exemplo, cTnT) pode ser usada para confirmar a diferenciação bem sucedida(Figura 2).
Normalmente, as células do grupo isquêmico apresentam menor viabilidade nos ensaios MTT(Figura 3A) e contratilidade(Figura 3E,F, Figura Suplementar 2) do que as do grupo de controle normoxic. Além disso, a razão de células propidium iodida-positiva é maior no grupo isquêmico do que no grupo controle (Figura 3B-D), o que indica maior dano celular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61104/61104fig01.jpg"> Figura 1: Estrutura da pasta para análise vetorial de deslocamento utilizando imageJ. "joblist.txt" descreve o caminho para arquivos de filme em cada linha. Se houver três arquivos para analisar, haverá três pastas (filme1, filme2 e filme3), nas quais "analyze.avi" (o filme de interesse) deve ser colocado. Após a análise ser realizada pelo código "vector_analysis.ijm", os arquivos serão gerados (indicado em azul) em cada pasta de filme. As informações armazenadas em cada arquivo são explicadas detalhadamente no texto principal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61104/61104fig02.jpg"> Figura 2: Imagem representativa da coloração do marcador cardíaco. Expressão do marcador cardíaco proteína troponina cardíaca T (cTnT). Azul: 4',6-diamidino-2-fenilômado (DAPI), vermelho: actin, verde: cTnT. Inset: expressão estriada de cTnT, que corresponde à estrutura de sarcomere. Barra de escala, 50 μm. Este número foi modificado a partir de Wei et al.13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61104/61104fig03.jpg"> Figura 3: Imagens representativas do ensaio de viabilidade celular, avaliação de danos celulares e contratilidade. (A) Comparação da viabilidade celular (ensaio MTT). Maior absorvência indica maior viabilidade. n = 5 para cada condição. (B, C e D) Análise de citometria de fluxo de células manchadas de propidium (PI). As células isquêmicas apresentam uma intensidade reduzida de dispersão para a frente e aumento da fluorescência de PI, em comparação com o controle. (D) Percentual de células manchadas de PI na análise da citometria de fluxo. n = 3 para cada condição. (E) Análise da contractilidade iPS-CMs utilizando o software ImageJ. Os vetores vermelho e azul indicam as maiores e menores contrações, respectivamente. Barra de escala, 100 μm. (F) Análise quantitativa da contractilidade iPS-CM utilizando código. n = 3 para controle e n = 8 para condição isquêmica. As barras de erro representam erro padrão da média. Para a análise estatística, foi realizado o teste t de duas caudas não-educido. *: p < 0,05, **: p < 0,01. : p < 0,0001. Este número é citado de Wei et al.13<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo 1: Células diferenciadas mostram contração espontânea sob o microscópio. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104_before.wmv" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Figura suplementar 1: Análise kaplan-meier do percentual de amostras sem contração espontânea. 50% das amostras de iPS-CM apresentaram contração no dia 20. No dia 30, 64,4% das amostras apresentaram contração. n = 83. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104supfig01.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Figura suplementar 2: Avaliação da contralidade cardíaca. A contratibilidade dimensionada obtida pela divisão da contração C pelo número de pontos de análise (x, y) foi traçada para controle e grupos isquêmicos antes e depois da exposição à hipóxia de 24h. n = 3 para controle e n = 8 para condição isquêmica. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104supfig02.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Figura Suplementar 3: Avaliação do conteúdo dos cardiomiócitos. Imunostaining de proteína de marcador cardíaco em uma placa de 96 poços. Verde: cTnT, Azul: DAPI. A taxa das células diferenciadas foi calculada em 20,7± 9,6% dividindo a área da região manchada de TTN por região manchada de DAPI. Barra de escala = 1 mm. n = 4 para condição de controle. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104supfig03.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Arquivo de codificação suplementar. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/Supplementary_Coding_File.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Apresentamos um modelo de doença isquêmica do coração utilizando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, juntamente com um método de avaliação quantitativa dos danos teciduais causados pela isquemia. Este modelo pode fornecer uma plataforma útil para triagem de medicamentos e mais pesquisas sobre doenças isquêmicas do coração.

Modelo de Doença Cardíaca Isquêmica e Comparação Baseada em Vídeo de Contração de Cardiomiócitos usando cardiomiócitos derivados do hiPSC

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

A pesquisa de doenças cardíacas é frequentemente realizada em pequenos e mamíferos, como roedores. No entanto, a fisiologia do coração humano difere significativamente da do coração roedor. Nosso protocolo usa cardiomiócitos diferenciados das células iPS humanas para modelar doenças isquêmicas do coração e quantificar os danos e o comprometimento funcional dos cardiomiócitos isquêmicos.Este protocolo pode fornecer um método conveniente para a triagem personalizada de medicamentos usando células iPS derivadas de pacientes individuais, o manuseio adequado das células iPS, como o uso de meio fresco, e a mudança do meio de forma lenta e pontual é fundamental para garantir uma diferenciação bem sucedida em cardiomiócitos funcionais. Demonstrando o procedimento com Yun Liu, Yin Liang e Mengxue Wang será Chen Wang, um estudante de doutorado de um laboratório. Para induzir a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem em células cardíacas, primeiro cubra os poços de uma placa de cultura de 96 poços com 100 microliters de 1.675 microgramas por mililitro de laminina em PBS.Após uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, veja três vezes 10 a quarta células-tronco em 200 microliters de meio de manutenção IPS complementados com 10 micromolar Y27632 em cada poço, e devolva a placa à Incubadora de Cultura Celular. Após 24 horas, substitua os super meios por 200 microliters de meio de crescimento IPS por poço, e devolva a placa à Incubadora de Cultura Celular por mais dois ou três dias. Quando as células atingem 70 a 80% de confluência.Substitua o meio em cada poço por 200 microliters de meio de diferenciação pré-aquecido A e devolva a placa à Incubadora de Cultura Celular por mais 48 horas. No final da incubação lentamente substituiu o supernaente em cada poço por 200 microliters de meio de diferenciação pré-aquecido B e retornar a placa para a Incubadora de Cultura Celular. Após dois dias, substitua os supernacantes por 200 microlitrais de meio de manutenção de cardiomiócitos pré-aquecidos por poço e devolveu a placa à Incubadora de Cultura Celular por até 30 dias.Para avaliar a contrailidade dos cardiomiócitos, instale a imagem de velocimetria de partículas j plugin e use um microscópio de contraste de fase e os garfos objetivo para gravar imagens de vídeo das células a aproximadamente 20 quadros por segundo por cerca de 10 segundos. Em seguida, salve o arquivo de vídeo conforme analisado nossa API e crie uma estrutura de pasta como indicado. Para analisar campos vetoriais bidimensionais discretos de deslocamento celular, inicie VG e selecione plugins, macros e edite para abrir a análise vetorial.ijm, em seguida, clique em executar a análise será realizada automaticamente. Para tratamento isquêmico, substitua o supernaente em cada poço por 200 microliters de dmem sem glicose e soro, em seguida, coloque a placa em uma Câmara Hipoxica e infunda gás nitrogênio na câmara, mantendo a concentração interna de oxigênio em 2% e a concentração de dióxido de carbono em 5% por 24 horas. Células diferenciadas com sucesso, demonstra contração espontânea observada sob o microscópio com 50% dos poços de cultura tipicamente exibindo contração espontânea em menos de 20 dias.Proteína de marcador cardíaco também pode ser usada para confirmar uma diferenciação bem sucedida As células do grupo isquêmico normalmente apresentam uma menor viabilidade nos ensaios MTT, e uma contratilidade menor do que as do grupo de controle normoxic. A razão de células positivas de iodeto de propídio também é maior no grupo isquêmico do que no grupo controle, indicando maior incidência de danos celulares. É importante que você localize com precisão as regiões de interesse na placa de captura para permitir a comparação da contrativismo dos cardiomiócitos.Esta técnica pode ser usada para triagem de medicamentos, utilizando células iPS derivadas do paciente. Também fornece uma plataforma única para elucidar ainda mais os mecanismos subjacentes às doenças cardíacas isquêmicas

Research

JoVE Journal

Medicine

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

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Medicina

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

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A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

Um Guia para a geração e uso hiPSC NPCs derivados para o Estudo das Doenças Neurológicas

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Geração de cardiomiócitos derivados de HiPSC semelhantes ao Ventricular e preparações celulares de alta qualidade para caracterização de manuseio de cálcio

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Avaliação eletromecânica da atividade cardiomiocito optogeneticamente modulada

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