Name: model of ischemic heart disease and video-based comparison of cardiomyocyte contraction using hipsc-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2020-05-05T15:00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Это исследование было поддержано JSPS KAKENHI, Фондом содействия совместным международным исследованиям (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Авторы с благодарностью признают Центральную исследовательскую лабораторию, Медицинскую школу Университета Окаяма за помощь FACS.

<ol>
	<li>Naghavi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Burden+of+Disease+Self-Harm,+C.+Global,+regional,+and+national+burden+of+suicide+mortality+1990+to+2016:+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">Global Burden of Disease Self-Harm, C. Global, regional, and national burden of suicide mortality 1990 to 2016: systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> BMJ. 364, 94 (2019).</li><li>Nowbar, A. N., Gitto, M., Howard, J. P., Francis, D. P., Al-Lamee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+From+Ischemic+Heart+Disease.">Mortality From Ischemic Heart Disease.</a> Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (6), 005375 (2019).</li><li>Oh, J. G., Ishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Models+of+Cardiovascular+Diseases:+Overview.">Experimental Models of Cardiovascular Diseases: Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 3-14 (2018).</li><li>Brodehl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem-Cell-Derived+Cardiomyocytes+as+Models+for+Genetic+Cardiomyopathies.">Human Induced Pluripotent Stem-Cell-Derived Cardiomyocytes as Models for Genetic Cardiomyopathies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), (2019).</li><li>Garbern, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mTOR+Signaling+Enhances+Maturation+of+Cardiomyocytes+Derived+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+via+p53-Induced+Quiescence.">Inhibition of mTOR Signaling Enhances Maturation of Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells via p53-Induced Quiescence.</a> Circulation. , (2019).</li><li>Horikoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+Acid-Treated+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Human+Cardiomyocytes+Exhibit+Adult+Cardiomyocyte-Like+Energy+Metabolism+Phenotypes.">Fatty Acid-Treated Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Cardiomyocytes Exhibit Adult Cardiomyocyte-Like Energy Metabolism Phenotypes.</a> Cells. 8 (9), (2019).</li><li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Maturation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+by+Inhibition+of+HIF1alpha+and+LDHA.">Metabolic Maturation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes by Inhibition of HIF1alpha and LDHA.</a> Circulation Research. 123 (9), 1066-1079 (2018).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+carbon+sources+affect+structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Distinct carbon sources affect structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8590 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li><li>Tamargo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mice+as+a+model+for+studying+cardiac+arrhythmias.">Genetically engineered mice as a model for studying cardiac arrhythmias.</a> Frontiers in Bioscience. 12, 22-38 (2007).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Wei, H., Wang, C., Guo, R., Takahashi, K., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+model+of+ischemic+heart+disease+using+cardiomyocytes+differentiated+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Development of a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 520 (3), 600-605 (2019).</li><li>Ghaedi, M., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cells+(iPSC)+Generation,+Culture,+and+Differentiation+to+Lung+Progenitor+Cells.">Human Pluripotent Stem Cells (iPSC) Generation, Culture, and Differentiation to Lung Progenitor Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 55-92 (2019).</li><li>Hou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retaining+mTeSR1+Medium+during+Hepatic+Differentiation+Facilitates+Hepatocyte-Like+Cell+Survival+by+Decreasing+Apoptosis.">Retaining mTeSR1 Medium during Hepatic Differentiation Facilitates Hepatocyte-Like Cell Survival by Decreasing Apoptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (4), 1533-1543 (2018).</li><li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+iPS+cells+into+ameloblast-like+cells+in+cultures+using+medium+conditioned+by+epithelial+cell+rests+of+Malassez+and+gelatin-coated+dishes.">Differentiation of mouse iPS cells into ameloblast-like cells in cultures using medium conditioned by epithelial cell rests of Malassez and gelatin-coated dishes.</a> Medical Molecular Morphology. 48 (3), 138-145 (2015).</li><li>Guzzo, R. M., Drissi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Chondrocytes.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1340, 79-95 (2015).</li><li>Haraguchi, Y., Matsuura, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+suspension+culture+system+of+human+iPS+cells+maintaining+their+pluripotency+for+cardiac+cell+sheet+engineering.">Simple suspension culture system of human iPS cells maintaining their pluripotency for cardiac cell sheet engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (12), 1363-1375 (2015).</li><li>Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Ischemia-Reperfusion+Injury.">In vitro Models of Ischemia-Reperfusion Injury.</a> Regenerative Engineering and Translational Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).</li><li>Strijdom, H., Genade, S., Lochner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+Oxide+synthase+(NOS)+does+not+contribute+to+simulated+ischaemic+preconditioning+in+an+isolated+rat+cardiomyocyte+model.">Nitric Oxide synthase (NOS) does not contribute to simulated ischaemic preconditioning in an isolated rat cardiomyocyte model.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 18 (2), 99-112 (2004).</li><li>Cavalheiro, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+cardioprotective+effect+of+the+4-anilinoquinazoline+derivative+PD153035:+involvement+of+mitochondrial+K(ATP)+channel+activation.">Potent cardioprotective effect of the 4-anilinoquinazoline derivative PD153035: involvement of mitochondrial K(ATP) channel activation.</a> PLoS One. 5 (5), 10666 (2010).</li><li>Toepfer, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SarcTrack.">SarcTrack.</a> Circulation Research. 124 (8), 1172-1183 (2019).</li><li>Smith, A. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoMEA:+A+Tool+for+High-Throughput,+Electrophysiological+Phenotyping+of+Patterned+Excitable+Cells.">NanoMEA: A Tool for High-Throughput, Electrophysiological Phenotyping of Patterned Excitable Cells.</a> Nano Letters. , (2019).</li><li>Smith, A. S., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+and+tissue+engineering+strategies+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening.</a> Biotechnology Advances. 35 (1), 77-94 (2017).</li><li>Sitkovsky, M., Lukashev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+immune+cells+by+local-tissue+oxygen+tension:+HIF1+alpha+and+adenosine+receptors.">Regulation of immune cells by local-tissue oxygen tension: HIF1 alpha and adenosine receptors.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (9), 712-721 (2005).</li><li>McDougal, A. D., Dewey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+oxygen+requirements+in+ischemic+cardiomyocytes.">Modeling oxygen requirements in ischemic cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11760-11776 (2017).</li><li>Rounds, S. A., Wilde, F. D., Ritz, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+A6.+Section+6.2.">Chapter A6. Section 6.2.</a> Dissolved oxygen. Report No. 09-A6.2. , (2006).</li><li>Al-Ani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygenation+in+cell+culture:+Critical+parameters+for+reproducibility+are+routinely+not+reported.">Oxygenation in cell culture: Critical parameters for reproducibility are routinely not reported.</a> PLoS One. 13 (10), 0204269 (2018).</li><li>Cadet, J. S., Kamp, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Recipe+for+T-Tubules+in+Human+iPS+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">A Recipe for T-Tubules in Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 121 (12), 1294-1295 (2017).</li><li>Halloin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+WNT+Control+Enables+Advanced+hPSC+Cardiac+Processing+and+Prognostic+Surface+Marker+Identification+in+Chemically+Defined+Suspension+Culture.">Continuous WNT Control Enables Advanced hPSC Cardiac Processing and Prognostic Surface Marker Identification in Chemically Defined Suspension Culture.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 366-379 (2019).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Исследователи часто используют лабораторные модели малых животных для проведения экспериментов с ИБС. Здесь мы разработали модель клеточной культуры человеческого ИБС для проведения таких экспериментов.
Основная проблема, с которой может столкнуться пользователь этого протокола, это низкий уровень дифференцированных кардиомиоцитов. Несколько шагов следует предпринять с большой осторожностью, чтобы улучшить скорость успешной дифференциации: а) быть нежным, когда пипетки, потому что клетки легко отделить после добавления реагента ферментов диссоциации клеток, (б) добавление Y-27632 увеличивает выживаемость клеток iPS при отсоединения, и (с) сроки средних изменений в начале дифференциации должны быть точно 48 ч друг от друга, чтобы обеспечить контролируемое выражение генов, участвующих в дифференциации.
Что касается внеклеточных белков матрицы, используемых для покрытия поверхности пластины культуры, другие материалы, чем ламинин мы использовали в этом протоколе могут быть использованы. Например, Matrigel14,15, ижелатин 16,17 используются для подачи свободной культуры обслуживания hiPSCs. Согласно Haraguchi et al., hiPSCs посеянные на Matrigel успешно были продифференцированы в лист сердечной клетки18.
Есть ряд предыдущих исследований, касающихся моделей культуры для моделирования заболеваний с использованием кардиомиоцитов, полученных из hiPSCs. Что касается моделирования ишемии-реперфузии травмы, манипуляции клеточной среды, такие как гиперкалиемия, ацидоз, и накоплениелактата, были введены 19. Другие методы включают гранулирование клеток, чтобы препятствовать распространению кислорода20 и метаболические ингибирования с использованиемцианида 21. В текущем протоколе, повреждение клеток было достигнуто относительно простым методом, а именно 24 ч лишения кислорода и питательных веществ. Однако следует позаботиться о точных патофизиологических процессах ишемической болезни сердца, так как действительно существуют различия между болезнью in vivo и моделью заболевания текущего протокола, такие как наличие или отсутствие трехмерной клеточной среды и крови.
Что касается технологического аспекта оценки функции кардиомиоцитов, Toepfer et al. сообщили о алгоритме на основе MatLab для определения саркомерного сокращения и релаксации в hiPS-CMs22. Smith et al. сообщили о передовом методе высокопрофильного электрофизиологического анализа возбудимых клеток, полученных из hiPS-CMs, используя сложные нанотопографически узорчатые многоэлектрозныемассивы 23,24. Преимущество нашего протокола в том, что он требует только обычного программного обеспечения и расходных материалов, таких как программное обеспечение ImageJ и 96-колодец пластин.
Что касается уровня кислорода в сердце, давление кислорода в венах, которые достигают сердца, как полагают, 40 мм рт.ст. 25. По данным McDougal et al., внеклеточное давление кислорода при гипоксии оценивается в 12,8 мм рт.ст. Применяя метод Раундов и др.27, давление кислорода в среде культуры (соленость: 35‰) при гипоксической состоянии (2% кислорода) при 37 градусах Цельсия, обработанных текущим протоколом, рассчитывается на уровне 14,9 мм рт. ст., что выше выше выше оценки выше. Интересно, что Аль-Ани и др. сообщили, что существует градиент кислородного давления в среде культуры, и давление кислорода зависит от типа клеток, плотности посева, исредний объем 28. Как правило, концентрация кислорода в нижней части пластины культуры, где находятся клетки, является самой низкой. Таким образом, эффект глубины в среде культуры будет еще больше снизить эффективное давление кислорода вблизи hiPS-CMs. Для того, чтобы вызвать достаточный ущерб hiPS-CMs с использованием гипоксического состояния, пристальное внимание должно быть уделено глубине среды и плотности клеток.
Наша модель hiPS-CM, которая очень близка к физиологическим условиям сердечных миоцитов человека, выгодно имитирует ИБС человека. Подходы, основанные на модели животных, включают этические, технические и академические вопросы. В частности, в моделях in vivo требуется передовая методика микрохирургии для достижения воспроизводимых данных: например, окклюзия передней нисходящей ветви левой коронарной артерии угрызунов 3. Описанная в настоящем случае модель hiPS-CM преодолевает эти критические барьеры и обеспечивает полезную, релевантную и повторяемую платформу для сердечно-сосудистых заболеваний.
Однако следует отметить некоторые ограничения. Очевидная разница между iPS-индуцированных кардиомиоцитов и нормальных кардиомиоцитов является отсутствиеТ-труб 29, и мы не включают гуморальные факторы, такие как повреждение тканей, вызванных лейкоцитов и активации системы дополнения в нашем исследовании. Кроме того, следует улучшить скорость дифференцированных кардиомиоцитов в этой модели (20,7 ± 9,6%, дополнительный рисунок 3). Недавняя публикация Halloin et al. описывает масштабируемый, химически определенный метод, чтобы вызвать чистоту hiPS-CM в размере 95% от химических модуляторов пути WNT без требования какого-либо выбора маркерами30. Тем не менее, наша модель ИБС человека относительно проста и клинически применима (например, скрининг на наркотики с использованием клеток iPS, полученных пациентом). Наша модель также является уникальной платформой для дальнейшего выяснения механизмов, лежащих в основе IHD.

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) признана во всем мире в качестве основной причины смерти, и, по оценкам, она несет ответственность за более чем девять миллионов смертельных исходов в 2016году 1. Распространенность сердечно-сосудистых заболеваний продолжает расти, и глобализация, как представляется, способствовала распространенности факторов риска сердечных заболеваний в развивающихся странах. Таким образом, изучение ИБС становится все более актуальным2.
Экспериментальные модели сердечно-сосудистых заболеваний имеют решающее значение для изучения механизмов заболевания, точности диагностики и разработки новых методов лечения. Многие лаборатории предложили несколько экспериментальных моделей. Крайне важно выбрать модель со значительными преимуществами; осуществимость, повторяемость и сходство с болезнью человека являются ключевыми факторами при выборе моделей сердечно-сосудистыхзаболеваний 3. Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (гипСК), несущие специфические кардиомиопатия связанных мутаций являются перспективной альтернативой животныхмоделей 4. Хотя многие стратегии были описаны для индуцирования кардиомиоцитовс использованиемiPSCs 5,6,7,8,9, здесь мы предоставляем простой метод для производства модели IHD с использованием кардиомиоцитов отличается от hiPSCs, в котором трудоемкий выбор кардиомиоцитов с использованием маркеров не применяется. В этом методе, кардиомиоциты выбираются функционально путем анализа спонтанного сокращения.
Индукция кардиомиоцитов с использованием hiPSCs позволяет избежать жертвоприношений животных и технически сложной хирургии. Создание животных моделей IHD требует сложных хирургическихметодов 10. Идеально имитировать различные патофизиологические аспекты сердечных заболеваний человека, такие как пульс и потенциал действия от физиологии грызунов практически невозможно. В сочетании с моралью и этикой использования моделей животных, разработка новых экспериментальных моделей, помимо моделей животных, является настоятельной необходимостью. Кардиомиоциты, дифференцированные от клеток iPS человека, лучше имитируют физиологическое состояние сердца человека. В этом протоколе мы устанавливаем модель ИБС с использованием кардиомиоцитов, полученных из клеток hiPS (hiPS-CMs). В нашей модели лишение кислорода и глюкозы приводит к снижению контрактной силы и жизнеспособности hiPS-CMs. Наш метод обеспечивает новый подход к модели IHD и демонстрирует новую платформу для изучения этого заболевания.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>R37112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti cardiac troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>MA5-12960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2921201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation enzymes (TrypLE Select)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2921201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2921201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria III system</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescenct microscope</td>
			<td>KEYENCE, Osaka, Japan</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A28175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPS cells</td>
			<td>RIKEN, Tsukuba, Japan</td>
			<td>201B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxic incubator</td>
			<td>SANYO, Osaka, Japan</td>
			<td>MCO-175M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC growth medium (Essential 8 Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A1517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC maintenance medium (StemFit AK02N)</td>
			<td>Ajinomoto, Tokyo, Japan</td>
			<td>RCAK02N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (iMatrix-511)</td>
			<td>Nippi, Tokyo, Japan</td>
			<td>iMatrix-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit)</td>
			<td>Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA</td>
			<td>10009365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>R37606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque, Kyoto, Japan</td>
			<td>35501-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

model of ischemic heart disease and video-based comparison of cardiomyocyte contraction using hipsc-derived cardiomyocytes

Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти во всем мире. Поэтому он был предметом огромного количества исследований, часто с мелкими животными моделями, такими как грызуны. Тем не менее, физиология человеческого сердца значительно отличается от сердца грызунов, подчеркивая необходимость клинически значимых моделей для изучения сердечных заболеваний. Здесь мы представляем протокол для моделирования ишемической болезни сердца с использованием кардиомиоцитов, дифференцированных от индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPS-CMs) и количественной оценки ущерба и функциональных нарушений ишемических кардиомиоцитов. Воздействие 2% кислорода без глюкозы и сыворотки увеличивает процент травмированных клеток, что указывается на окрашивание ядра йодидом пропидия, и снижает клеточную жизнеспособность. Эти условия также снижают контрактность hiPS-CMs, что подтверждается анализом векторных векторов смещения микроскопических видеосъемок. Этот протокол может также обеспечить удобный метод для персонализированного скрининга снадобья путем облегчать пользу клеток hiPS от индивидуальных пациентов. Таким образом, эта модель ишемической болезни сердца, основанная на iPS-CMs человеческого происхождения, может обеспечить полезную платформу для скрининга наркотиков и дальнейших исследований ишемической болезни сердца.

Успешно дифференцированные клетки показывают спонтанное сжатие под микроскопом(Видео 1). Как правило, 50% скважин показывают спонтанное сокращение в lt;20 дней(Дополнительный рисунок 1). Сердечный маркер белка (например, cTnT) может быть использован для подтверждения успешной дифференциации (Рисунок 2).
Как правило, клетки из ишемической группы показывают более низкую жизнеспособность в анализахMTT (рисунок 3A)и контрактность(рисунок 3E,F, Дополнительный рисунок 2), чем у нормоксической контрольной группы. Кроме того, соотношение пропидий йодид-положительных клеток выше в ишемической группе, чем в контрольной группе(рисунок 3B-D), что указывает на более высокий уровень повреждения клеток.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61104/61104fig01.jpg"> Рисунок 1: Структура folder для анализа вектора перемещения с помощью imageJ. "joblist.txt" описывает путь к файлам фильмов каждой строки. Если есть три файла для анализа, будет три папки (movie1, movie2 и movie3), в которых "analyze.avi" (фильм, представляющий интерес) должны быть размещены. После того, как анализ выполняется кодом "vector_analysis.ijm", файлы будут генерироваться (указанные синим цветом) в каждой папке фильма. Информация, хранящаяся в каждом файле, подробно описана в основном тексте. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61104/61104fig02.jpg"> Рисунок 2: Репрезентативное изображение окрашивания сердечного маркера. Выражение сердечного маркера белка сердечный тропонин Т (cTnT). Синий: 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), красный: актин, зеленый: cTnT. Вставка: полосатый экспрессия cTnT, которая соответствует структуре саркомера. Шкала бар, 50 мкм. Эта цифра была изменена с Вэй и др.13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61104/61104fig03.jpg"> Рисунок 3: Репрезентативные изображения клеточной жизнеспособности анализа, оценки повреждения клеток, и контрактность. (A) Сравнение жизнеспособности клеток (анализ МТТ). Более высокая абсорбтность указывает на более высокую жизнеспособность. n No 5 для каждого условия. (B, C и D) Анализ цитометрии пропидия йодида (PI)-окрашенных клеток. Ишемические клетки обладают уменьшенной интенсивностью рассеяния вперед и повышенной флуоресценцией PI, по сравнению с контролем. (D) Процент PI-окрашенных клеток в анализе цитометрии потока. n No 3 для каждого условия. (E) Анализ контрактности iPS-CMs с использованием программного обеспечения ImageJ. Красный и синий векторы указывают на самые большие и маленькие сокращения, соответственно. Шкала бар, 100 мкм. (F) Количественный анализ контрактности iPS-CM с использованием кода. n No 3 для контроля и n No 8 для ишемического состояния. Бары ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего. Для статистического анализа был проведен неспареный двуххвостый тест студента. Вопрос: р хт; 0,05, й: р йт; 0,01. : p Lt; 0.0001. Эта цифра приводится из Вэй и др.13 Пожалуйста, нажмите<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104fig03large.jpg" target="_blank">здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.</a>
Видео 1: Дифференцированные клетки показывают спонтанное сокращение под микроскопом. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104_before.wmv" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.</a>
Дополнительная цифра 1: Каплан-Мейер анализ процент образцов без спонтанного сокращения. 50% образцов iPS-CM показали сокращение на 20-й день. На 30-й день 64,4% образцов показали сокращение. n No 83. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104supfig01.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.</a>
Дополнительная цифра 2: Оценка сердечной контрактности. Масштабируемая контрактность, полученная путем деления контрактности С на количество точек анализа (x, y), была рассчитана на контрольные и ишемические группы до и после воздействия гипоксии 24 ч. n No 3 для контроля и n No 8 для ишемического состояния. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104supfig02.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.</a>
Дополнительная цифра 3: Оценка содержания кардиомиоцитов. Иммуностимулятор сердечного маркера белка на пластине 96 хорошо. Зеленый: cTnT, синий: DAPI. Скорость дифференцированных клеток была рассчитана на 20,7 ± 9,6%, разделив площадь окрашенных цТН на область, окрашенную DAPI. Масштабная планка 1 мм. n No 4 для управления состоянием. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/61104supfig03.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.</a>
Дополнительный файл кодирования. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61104/Supplementary_Coding_File.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Мы представляем модель ишемической болезни сердца с использованием кардиомиоцитов, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, вместе с методом количественной оценки повреждения тканей, вызванного ишемией. Эта модель может обеспечить полезную платформу для скрининга лекарств и дальнейших исследований ишемической болезни сердца.

Модель ишемической болезни сердца и видео-сравнение кардиомиоцитов схватки с использованием hiPSC-производных кардиомиоцитов

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Исследования сердечно-сосудистых заболеваний часто проводятся у мелких и млекопитающих, таких как грызуны. Тем не менее, физиология человеческого сердца значительно отличается от сердца грызунов. В нашем протоколе используются кардиомиоциты, дифференцированные от клеток iPS человека, для моделирования ишемической болезни сердца и количественной оценки повреждений и функциональных нарушений ишемических кардиомиоцитов.Этот протокол может обеспечить удобный метод для персонализированного скрининга наркотиков с использованием клеток iPS, полученных от отдельных пациентов, надлежащее обращение с клетками iPS, например, при использовании свежей среды, и изменение среды медленно и пунктуально имеет решающее значение для обеспечения успешной дифференциации в функциональные кардиомиоциты. Демонстрация процедуры с Yun Liu, Yin Liang и Mengxue Wang будет Chen Wang, студентом PhD от лаборатории. Чтобы вызвать индуцированной человеком плюрипотентной дифференциации стволовых клеток в сердечные клетки, сначала пальто скважины 96 хорошо культуры пластины с 100 микролитров 1,675 микрограмм на миллилитр ламинина в PBS.После 30-минутной инкубации при 37 градусах по Цельсию, увидеть три раза 10 до четвертой стволовых клеток в 200 микролитров IPS обслуживания среды дополняется 10 микромолярной Y27632 в каждой хорошо, и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток. После 24 часов, заменить супер средства с 200 микролитров IPS среднего роста на колодец, и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток в течение дополнительных двух-трех дней. Когда клетки достигают 70 до 80% слияния.Замените среду в каждой хорошо с 200 микролитров предварительно разогретой дифференциации среды И вернуть пластину в инкубатор культуры клеток еще на 48 часов. В конце инкубации медленно заменяется супернатант в каждой хорошо с 200 микролитров предварительно разогретой дифференциации среды B и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток. Через два дня замените супернатанты 200 микролитров предварительно разогретой среды обслуживания кардиомиоцитов на колодец и назад вернули пластину в инкубатор клеточной культуры на срок до 30 дней.Для оценки контрактности кардиомиоцитов установите велоциметрию изображения частиц j plugin и используйте фазовый контрастный микроскоп и цель вилки для записи видеоизображений клеток со примерно 20 кадрами в секунду в течение примерно 10 секунд. Затем сохраните видеофейс при анализе нашего API и создайте структуру папок, как указано. Для анализа дискретных двухмерных векторных полей клеточного смещения запустите VG и выберите плагины, макросы и отредактируйте для открытого векторного анализа.ijm, а затем нажмите запустить анализ будет выполняться автоматически. Для ишемической обработки замените супернатант в каждой колодец 200 микролитров dmem без глюкозы и сыворотки, затем поместите пластину в Гипоксическую камеру, затем влить азотный газ в камеру, поддерживая внутреннюю концентрацию кислорода на уровне 2%и концентрацию углекислого газа на уровне 5% в течение 24 часов. Успешно дифференцированные клетки, демонстрирует спонтанное сокращение, наблюдаемое под микроскопом с 50% культурных скважин, как правило, проявляется спонтанное сокращение менее чем за 20 дней.Сердечный маркер белка также может быть использован для подтверждения успешной дифференциации Клетки из ишемической группы, как правило, проявляют более низкую жизнеспособность в анализах МТТ, и более низкая контрактность, чем у нормоксической контрольной группы. Соотношение положительных клеток пропидия йодида также выше в ишемической группе, чем в контрольной группе, что свидетельствует о более высокой частоте повреждения клеток. Важно, чтобы вы точно найти области, представляющие интерес в захват пластины, чтобы позволить сравнение контрактности кардиомиоцитов.Этот метод может быть использован для скрининга наркотиков, с использованием пациентов производных клеток iPS. Она также предоставляет уникальную платформу для дальнейшего выяснения механизмов, лежащих в основе ишемических заболеваний сердца

Research

JoVE Journal

Medicine

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Перенос генов для ишемической сердечной недостаточности в доклинических моделей

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Оценка функции сердца и инфаркта Морфология Использование мелких животных Look-шкафчик Инверсия-восстановление (SALLI) МРТ у крыс

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Implantation of Total Artificial Heart in Congenital Heart Disease

Имплантация Всего искусственного сердца в врожденный порок сердца

In patients with end-stage heart failure (HF), a total artificial heart (TAH) may be implanted as a bridge to cardiac transplant. However, in congenital ...

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

Руководство по составления и использования hiPSC, полученных НПС по изучению неврологических заболеваний

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Demonstration of the Rat Ischemic Skin Wound Model

Демонстрация Крыса ишемической кожной раны модели

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Изоляция предсердий кардиомиоцитов из крыса модели метаболических связанных с синдром сердечной недостаточности с фракция изгнания сохранившихся

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Изометрические сократимости измерение верхней брыжеечной артерии мыши, с помощью проволоки миография

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Имплантация hiPSC производные патчей сердечной мышцы после миокардиального ушиба в модели морской свинки

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Поколение вентрикулярно-как HiPSC-производные кардиомиоциты и высококачественные клеточные препараты для обработки кальция характеристика

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Электромеханическая оценка оптогенетически модулированной кардиомиоцитной активности

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...