Исследования сердечно-сосудистых заболеваний часто проводятся у мелких и млекопитающих, таких как грызуны. Тем не менее, физиология человеческого сердца значительно отличается от сердца грызунов. В нашем протоколе используются кардиомиоциты, дифференцированные от клеток iPS человека, для моделирования ишемической болезни сердца и количественной оценки повреждений и функциональных нарушений ишемических кардиомиоцитов.
Этот протокол может обеспечить удобный метод для персонализированного скрининга наркотиков с использованием клеток iPS, полученных от отдельных пациентов, надлежащее обращение с клетками iPS, например, при использовании свежей среды, и изменение среды медленно и пунктуально имеет решающее значение для обеспечения успешной дифференциации в функциональные кардиомиоциты. Демонстрация процедуры с Yun Liu, Yin Liang и Mengxue Wang будет Chen Wang, студентом PhD от лаборатории. Чтобы вызвать индуцированной человеком плюрипотентной дифференциации стволовых клеток в сердечные клетки, сначала пальто скважины 96 хорошо культуры пластины с 100 микролитров 1,675 микрограмм на миллилитр ламинина в PBS.
После 30-минутной инкубации при 37 градусах по Цельсию, увидеть три раза 10 до четвертой стволовых клеток в 200 микролитров IPS обслуживания среды дополняется 10 микромолярной Y27632 в каждой хорошо, и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток. После 24 часов, заменить супер средства с 200 микролитров IPS среднего роста на колодец, и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток в течение дополнительных двух-трех дней. Когда клетки достигают 70 до 80% слияния.
Замените среду в каждой хорошо с 200 микролитров предварительно разогретой дифференциации среды И вернуть пластину в инкубатор культуры клеток еще на 48 часов. В конце инкубации медленно заменяется супернатант в каждой хорошо с 200 микролитров предварительно разогретой дифференциации среды B и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток. Через два дня замените супернатанты 200 микролитров предварительно разогретой среды обслуживания кардиомиоцитов на колодец и назад вернули пластину в инкубатор клеточной культуры на срок до 30 дней.
Для оценки контрактности кардиомиоцитов установите велоциметрию изображения частиц j plugin и используйте фазовый контрастный микроскоп и цель вилки для записи видеоизображений клеток со примерно 20 кадрами в секунду в течение примерно 10 секунд. Затем сохраните видеофейс при анализе нашего API и создайте структуру папок, как указано. Для анализа дискретных двухмерных векторных полей клеточного смещения запустите VG и выберите плагины, макросы и отредактируйте для открытого векторного анализа.
ijm, а затем нажмите запустить анализ будет выполняться автоматически. Для ишемической обработки замените супернатант в каждой колодец 200 микролитров dmem без глюкозы и сыворотки, затем поместите пластину в Гипоксическую камеру, затем влить азотный газ в камеру, поддерживая внутреннюю концентрацию кислорода на уровне 2%и концентрацию углекислого газа на уровне 5% в течение 24 часов. Успешно дифференцированные клетки, демонстрирует спонтанное сокращение, наблюдаемое под микроскопом с 50% культурных скважин, как правило, проявляется спонтанное сокращение менее чем за 20 дней.
Сердечный маркер белка также может быть использован для подтверждения успешной дифференциации Клетки из ишемической группы, как правило, проявляют более низкую жизнеспособность в анализах МТТ, и более низкая контрактность, чем у нормоксической контрольной группы. Соотношение положительных клеток пропидия йодида также выше в ишемической группе, чем в контрольной группе, что свидетельствует о более высокой частоте повреждения клеток. Важно, чтобы вы точно найти области, представляющие интерес в захват пластины, чтобы позволить сравнение контрактности кардиомиоцитов.
Этот метод может быть использован для скрининга наркотиков, с использованием пациентов производных клеток iPS. Она также предоставляет уникальную платформу для дальнейшего выяснения механизмов, лежащих в основе ишемических заболеваний сердца
