Hjärtsjukdom forskning utförs ofta i små och däggdjur som Gnagare. Människohjärtats fysiologi skiljer sig dock avsevärt från Gnagarhjärtats. Vårt protokoll använder kardiomyocyter differentierade från mänskliga iPS-celler till modell ischemisk hjärtsjukdom och att kvantifiera skador och funktionsförsämring av ischemisk kardiomyocyter.
Detta protokoll kan ge en bekväm metod för personligt läkemedel screening med hjälp av iPS-celler som härrör från enskilda patienter, lämplig hantering av iPS-cellerna, såsom i att använda färskt medium, och ändra mediet långsamt och punktligt är avgörande för att säkerställa en lyckad differentiering till funktionella kardiomyocyter. Demonstrera förfarandet med Yun Liu, Yin Liang och Mengxue Wang kommer att Chen Wang, en doktorand från ett laboratorium. För att inducera Human induced Pluripotent stamcellsdifferentiering till hjärtceller, först päls brunnarna i en 96 väl odlingsplatta med 100 mikroliter av 1.675 mikrogram per milliliter av laminin i PBS.
Efter en 30 minuters inkubation vid 37 grader Celsius, se tre gånger 10 till de fjärde stamcellerna i 200 mikroliter av IPS underhållsmedium kompletterat med 10 mikromolar Y27632 i varje brunn, och returnera plattan till Cell Kultur Inkubatorn. Efter 24 timmar, ersätta super innebär med 200 mikroliter av IPS tillväxt medium per brunn, och returnera plattan till Cell Culture Incubator för ytterligare två till tre dagar. När cellerna når 70 till 80%konfluency.
Byt ut mediet i varje brunn med 200 mikroliter av förvarna differentieringsmedium A och returnera plattan till Cell Culture Incubator i ytterligare 48 timmar. Vid slutet av inkubationen ersatte långsamt supernatanten i varje brunn med 200 mikroliter av pre värmt differentieringsmedium B och återför plattan till CellKultur Inkubatorn. Efter två dagar, ersätta supernatanterna med 200 mikroliter av pre värmt kardiomycyt underhållsmedium per brunn och återvände plattan till Cell Culture Incubator i upp till 30 dagar.
För att bedöma kontraktilitet av kardiomyocyter, installera partikelbild velocimetry bild j plugin och använda en faskontrast mikroskop och gafflarna målet att spela in videobilder av cellerna på cirka 20 bilder per sekund i ca 10 sekunder. Spara sedan videofilen som analyserat vårt API och skapa en mappstruktur som anges. För att analysera diskreta tvådimensionella vektorfält av cellulära förskjutning, starta VG och välj plugins, makron och redigera för att öppna vektoranalys.
ijm, klicka sedan på Kör analysen kommer att utföras automatiskt. För ischemisk behandling, byt ut supernatanten i varje brunn med 200 mikroliter av dmem utan glukos och serum, placera sedan plattan i en Hypoxisk kammare sedan ingjuta kvävegas i kammaren, bibehålla den inre syrekoncentrationen vid 2%och koldioxidkoncentrationen vid 5%i 24 timmar. Framgångsrikt differentierade celler, visar spontan kontraktion som observerats under mikroskop med 50%av de kultur brunnar typiskt uppvisar spontana kontraktion på mindre än 20 dagar.
Hjärt markör protein kan också användas för att bekräfta en framgångsrik differentiering Celler från den ischemiska gruppen uppvisar typiskt en lägre lönsamhet i MTT analyser, och en lägre kontraktilitet än de från normoxic kontrollgruppen. Förhållandet mellan propidium iodid positiva celler är också högre i den ischemiska gruppen, än i kontrollgruppen, vilket tyder på en högre förekomst av cellulära skador. Det är viktigt att du exakt lokalisera de regioner av intresse i fångstplattan för att möjliggöra jämförelse av kontraktilitet av kardiomyocyter.
Denna teknik kan användas för läkemedelsscreening, med hjälp av patienten härledda iPS-celler. Det ger också en unik plattform för att ytterligare belysa de mekanismer som ligger bakom ischemiska hjärtsjukdomar
