Name: live-cell imaging of the life cycle of bacterial predator bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-05-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy at JoVE.com

وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل المركز الوطني للعلوم منحة أوبوس 2018/29/B/NZ6/00539 إلى J.Z.C.

1. إعداد B. bacteriovorus lysate للتحليل المجهري
<ol><li>في قارورة 250 مل، إعداد تربية الأحياء من خلال الجمع بين 1 مل من 24 ح الطازجة البكتيريا ثقافة (على سبيل المثال، HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) و 3 مل من ثقافة فريسة بين عشية وضحاها (على سبيل المثال، E. القولونية S17-1 pZMR100) مع 50 مل من Ca-HEPES العازلة (25 مل هبس...

<ol>
	<li>Shatzkes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predatory+Bacteria+Attenuate+Klebsiella+pneumoniae+Burden+in+Rat+Lungs.">Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs.</a> mBio. 7 (6), (2016).</li><li>Iebba, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bdellovibrio+bacteriovorus+directly+attacks+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+Cystic+fibrosis+isolates.">Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 5, (2014).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injections+of+Predatory+Bacteria+Work+Alongside+Host+Immune+Cells+to+Treat+Shigella+Infection+in+Zebrafish+Larvae.">Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae.</a> Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).</li><li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+flagellar+filament+and+the+role+of+motility+in+bacterial+prey-penetration+by+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).</li><li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predatory+Patchwork:+Membrane+and+Surface+Structures+of+Bdellovibrio+bacteriovorus.">A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).</li><li>Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Chromosomal+Replication+in+Predatory+Bacterium+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1898 (2016).</li><li>Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Chromosome+Replication+and+Its+Relationship+to+Predatory+Attack+Lifestyles+in+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).</li><li>Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shadowing+the+actions+of+a+predator:+backlit+fluorescent+microscopy+reveals+synchronous+nonbinary+septation+of+predatory+Bdellovibrio+inside+prey+and+exit+through+discrete+bdelloplast+pores.">Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores.</a> Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).</li><li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+D-amino-acids+reveal+bi-cellular+cell+wall+modifications+important+for+Bdellovibrio+bacteriovorus+predation.">Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation.</a> Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).</li><li>Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predation+of+human+pathogens+by+the+predatory+bacteria+Micavibrio+aeruginosavorus+and+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).</li></ol>

بسبب زيادة الاهتمام باستخدام B. bacteriovorus كمضاد حيوي حي ، هناك حاجة إلى أدوات جديدة لمراقبة دورة الحياة المفترسة ، ولا سيما التفاعلات بين الحيوانات المفترسة والمسببات. يتم استخدام البروتوكول المقدم لتتبع دورة حياة B. bacteriovorus بأكملها ، خاصة أثناء نموها داخل المضيف ، في الوقت الفعلي. ?...

Bdellovibrio bacteriovorus هي بكتيريا صغيرة (0.3-0.5 ميكرومتر من 0.5-1.4 ميكرومتر) بكتيريا سلبية الغرام التي تفترس البكتيريا الأخرى السالبة للجرام ، بما في ذلك مسببات الأمراض الضارة مثل Klebsiella pneumoniae ، Pseudomonas aeruginosa ، وSingella flexneri1،2،3. وبما أن ب. البكتيريا تقتل مسببات الأمراض، فإنه يعتبر مضاد حيوي حي محتمل يمكن تطبيقه لمكافحة العدوى البكتيرية، وخاصة تلك الناجمة عن سلالات مقاومة للأدوية المتعددة.
B. bacteriovorus يعرض دورة حياة غريبة تتكون من مرحلتين: مرحلة الهجوم غير تكراري العيش الحر ومرحلة الإنجاب داخل الخلايا(الشكل 1). في مرحلة العيش الحر ، تبحث هذه البكتيريا المتحركة العالية ، التي تتحرك بسرعة تصل إلى 160 ميكرومترًا في الثانية ، عن فريستها. بعد ربطها بالغشاء الخارجي للفريسة ، تدخل periplasm4،5. خلال مرحلة الإنجاب بين الحولية، يستخدم B. bacteriovorus مجموعة كبيرة من الإنزيمات الهيدرولوجية لإنزيمات الجزيئات الكبيرة للمضيف وإعادة استخدامها لنموها الخاص. بعد وقت قصير من غزو periplasm ، تموت الخلية المضيفة وتنتفخ في بنية كروية تسمى bdelloplast ، داخلها تتكاثر الخلية المفترسة وتستنسخ كروموسوماتها. تبدأ عملية النسخ المتماثل في أصل النسخ المتماثل (oriC)6 و تستمر حتى يتم تصنيع عدة نسخ من الكروموسوم بشكل كامل7. ومن المثير للاهتمام، لا يتبع تكرار كل كروموسوم من قبل انقسام الخلايا. بدلا من ذلك، يطول المفترس لتشكيل خلية طويلة ومتعددة النوى والخيوط. عند استنفاد المغذيات ، يخضع الخيط لزنزانة متزامنة ويتم تحرير الخلايا النسلية من bdelloplast8.
قبل أن يمكن استخدام البكتيريا البكتيرية كمضادات حيوية حية ضد العدوى البكتيرية ، من المهم فهم المراحل الرئيسية لدورة حياتها ، لا سيما تلك المتعلقة بانتشارها داخل الفريسة. وقد تم تصوير الخلايا الحية من B. bacteriovorus تحديا، وذلك بسبب الأشكال المورفولوجية المختلفة للمفترس وفريسته خلال دورة الحياة المعقدة. حتى الآن، تمت دراسة التفاعلات بين B. bacteriovorus وخليتها المضيفة بشكل رئيسي عن طريق المجهر الإلكتروني وتحليل snap-shot2،9،10، وكلاهما له قيود ، خاصة عندما يتم استخدامها لرصد المراحل المتعاقبة من دورة الحياة المفترسة. توفر هذه الطرق صورًا عالية الدقة لخلايا البكتيريا B. وتمكن من مراقبة مفترس صغير أثناء مرحلة الهجوم أو النمو. ومع ذلك، فإنها لا تسمح لتتبع واحد B. bacteriovorus الخلايا خلال كل من مراحل دورة الحياة.
هنا هو بروتوكول شامل لاستخدام الوقت الفاصل المجهر fluorescence (TLFM) لرصد دورة الحياة الكاملة من B. bacteriovorus. ويستخدم نظام يتكون من وسادة agarose في تركيبة مع طبق التصوير الخلوي، والتي يمكن أن تتحرك الخلايا المفترسة بحرية تحت لوحة agarose بينما خلايا فريسة شلت قادرة على تشكيل bdelloplasts (الشكل 2). يتم إعداد هذا الإعداد على أساس سلالات محددة من كل من الإشريكية القولونية وB. bacteriovorus، ولكن يمكن تغيير البروتوكول بسهولة لتناسب سلالات المستخدم الفردية (على سبيل المثال ، تحمل علامات اختيار مختلفة ، والبروتينات التي تنصهر مع الفلوروفورس المختلفة ، وما إلى ذلك).
في هذه الحالة، لتصور B. bacteriovorus خلال مرحلة الهجوم، سلالة محددة (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) التي تعبر عن نسخة الفلورسنت الموسومة من البروتين السيتوبلازمي، بيلز (المتاحة في مختبرنا عند الطلب)7. وتنتج هذه السلالة بالإضافة إلى ذلك DnaN (المشبك β الانزلاق)، وهي وحدة فرعية من الحمض النووي البوليمر الثالث هولوينزيم، تنصهر مع بروتين الفلورسنت. وهذا يتيح إمكانية رصد تكرار الحمض النووي المستمر داخل الخلايا المفترسة أثناء نموها داخل البلاستات.
على الرغم من أن البروتوكول والبرامج المذكورة المستخدمة للحصول على الصور تشير إلى مجهر مقلوب المقدمة من قبل شركة تصنيع محددة (انظر جدول المواد)، يمكن تعديل هذه التقنية لأي مجهر مقلوب مجهز بغرفة بيئية أو حامل تدفئة خارجي آخر وقادر على التصوير الفاصل الزمني. لتحليل البيانات، يمكن للمستخدمين اختيار أي برنامج متاح متوافق مع تنسيقات الإخراج الفردية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig01.jpg"> الشكل 1: دورة حياة ب. bacteriovorus في الإشريكية القولونية كخلية مضيفة. خلال مرحلة الهجوم، خلية سباحة حرة B. bacteriovorus تبحث عن وتعلق على خلية الإشريكية القولونية المضيف. بعد الغزو، تصبح الخلية المفترسة موضعية في periplasm الفريسة، وتغيير شكل الخلية المضيفة وتشكيل bdelloplast. تبدأ المرحلة الإنجابية بتكوين البلاست. الخلية المفترسة يهضم الخلية الفريسة ويعيد استخدام المركبات البسيطة لبناء هياكلها الخاصة. B. bacteriovorus ينمو كما خيوط واحدة طويلة داخل periplasm المضيف. عندما تستنفد موارد الخلية الفريسة ، فإن خيوط B. bacteriovorus تتزامن وتشكل الخلايا النسل. بعد الخلايا ذرية تطوير flagella بهم، أنها lyse bdelloplast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MPW MED. INSTRUMENTS</td>
			<td>MPW-260R</td>
			<td>Rotor ref. 12183</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CertifiedMolecular Biology Agarose</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td>Open source image processing package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish 35 mm</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81218-200</td>
			<td>uncoated glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>GE</td>
			<td>DeltaVision Elite</td>
			<td>Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16555----------K</td>
			<td>Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Start SoftWoRx</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td>Manufacturer-supplied imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of the life cycle of bacterial predator bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus هي بكتيريا صغيرة سالبة الغرام ، ملزمة المفترسة التي تقتل البكتيريا الأخرى سلبية الغرام ، بما في ذلك مسببات الأمراض الضارة. ولذلك، فإنه يعتبر مضاد حيوي حي. لتطبيق B. bacteriovorus كمضاد حيوي حي ، من الضروري أولاً فهم المراحل الرئيسية لدورة حياتها المعقدة ، ولا سيما انتشارها داخل الفريسة. وحتى الآن، كان من الصعب رصد المراحل المتعاقبة من دورة الحياة المفترسة في الوقت الحقيقي. هنا هو بروتوكول شامل للتصوير في الوقت الحقيقي من دورة حياة كاملة من bacteriovorus B.، وخصوصا خلال نموها داخل المضيف. لهذا الغرض، يتم استخدام نظام يتكون من وسادة agarose في تركيبة مع أطباق التصوير الخلوي، والتي يمكن للخلايا المفترسة التحرك بحرية تحت لوحة agarose بينما خلايا فريسة مشلّمة قادرة على تشكيل bdelloplasts. تطبيق سلالة إنتاج الفلورسنت الموسومة β-الوحدة الفرعية من الحمض النووي بوليميراز الثالث يسمح كذلك تكرار كروموسوم ليتم رصدها خلال مرحلة التكاثر من دورة حياة B. bacteriovorus.

نظام TLFM الموصوفة يسمح بتعقب الخلايا الفردية من B. bacteriovorus في الوقت المناسب (الشكل 3, فيلم 1) ويوفر معلومات قيمة حول كل مرحلة من مراحل دورة الحياة المفترسة المعقدة. الانصهار PilZ-mCherry تمكن الخلية المفترسة بأكملها أن تكون وصفت في مرحلة الهجوم وكذلك في مرحلة مبكرة من ?...

Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

هنا هو بروتوكول يصف رصد دورة الحياة الكاملة للبكتيريا المفترسة Bdellovibrio bacteriovorus باستخدام المجهر الفلوري الفاصل الزمني في تركيبة مع وسادة agarose وأطباق التصوير الخلوي.

التصوير الحي للخلايا من دورة حياة البكتيريا المفترس Bdellovibrio bacteriovorus باستخدام المجهر الفلوري الوقت الفاصل

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

وقد حية الخلية Bdellovibrio bacteriovorus التصوير تحديا بسبب دورة الحياة المعقدة لهذه البكتيريا المفترسة. بروتوكولنا يسمح بمراقبة مراحل دورة الحياة الكاملة في الوقت الحقيقي. على الرغم من أن بروتوكولنا يستند إلى سلالات معادلة محددة ، إلا أنه قد يكون من السهل تكييفه مع مجموعة متنوعة من السلالات البكتيرية بما في ذلك السلالات المسببة للأمراض.لإقامة ثقافة B.bacteriovorus، الجمع بين ملليلتر واحد من البكتيريا الطازجة على مدار 24 ساعة مع ثلاثة ملليلتر من ثقافة فريسة بين عشية وضحاها في قارورة 250 ملليلتر تحتوي على 50 ملليلتر من العازلة الهيبيوم الكالسيوم تكملها المضادات الحيوية حسب الحاجة. بعد حضانة 24 ساعة في 30 درجة مئوية و 200 الثورات في الدقيقة الواحدة، تحقق من أن الخلايا الفريسة قد تم lysed تماما من قبل السائل محمولة على الوجه المجهر التباين. العديد من الخلايا B.bacteriovorus متعددة التهجمات يجب أن تكون موجودة ولا يجب أن تكون خلية الإشريكية القولونية أو bdelloplast مرئية.سلالة ثقافة B.bacteriovorus من خلال مرشح حجم المسام ميكرومتر 0.45 في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وتعليق أسفل الترشيح في جهاز طرد مركزي. ثم إعادة تعليق بيليه B.bacteriovorus في ثلاثة ملليلتر من الهيبيوم الكالسيوم العازلة إلى كثافة بصرية نهائية في 600 نانومتر من حوالي 0.2 واحتضان البكتيريا في 30 درجة مئوية و 200 الثورات في الدقيقة الواحدة لمدة 30 دقيقة. لإعداد الخلايا المضيفة، حدد مستعمرة واحدة من سلالة المضيف من الفائدة و nodulate البكتيريا في 10 ملليلتر من YT المتوسطة تكملها المضادات الحيوية حسب الضرورة لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 180 الثورات في الدقيقة الواحدة.في صباح اليوم التالي نقل مليلتر من ثقافة بين عشية وضحاها إلى أنبوب اختبار ملليلتر و بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم إعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولترات من الكالسيوم hippies العازلة. من المهم جداً إعادة تعليق الخلية بالكامل بعد الطرد المركزي للتأكد من أن يتم فصل خلية الفريسة على مستوى الخلية المفردة.لإعداد الخلايا للتنظير المنظاري الفلوري الفاصل زمنيًا ، أولاً ، قم بخلط 200 ملليغرام من الفلورسنت المنخفضة من الدرجة الجزيئية agarose مع 20 ملليلترًا من عازلة الهيبيوم الكالسيوم وحل الأعواروز في الميكروويف. صب ثلاثة ملليلتر من agarose ذاب في طبق القاع الزجاج 35 ملليمتر والسماح agarose لترسيخ. باستخدام ملعقة صغيرة مختبر، وإزالة بعناية وسادة agarose من الطبق دون إزعاج القطب مركز لوحة ووضع الجانب السفلي لوحة حتى على غطاء طبق بيتري.ضع خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية المضيفة المركزة على الوسادة المنقلبة واستخدم حلقة تطعيم لنشر الخلايا في القطب الأوسط. التالي إضافة خمسة microliters من تعليق B.bacteriovorus المركزة على السطح المغلف الخلية المضيفة دون أن تنتشر والعودة بسرعة هلام إلى 35 ملليلتر الزجاج أسفل الطبق الجانب العلوي إلى أسفل. ثم غطي الطبق بغطاء.لعصر الفاصلة مجهرية من الثقافة المشتركة، ضع الطبق في حامل طبق بيتري بحيث لن يتحرك الطبق على مدار التجربة ووضع قطرة واحدة من زيت الغمر على هدف المجهر المقلوب وإسقاطة واحدة على الجزء السفلي من الطبق. جبل حامل على مرحلة المجهر داخل غرفة المجهر المقلوب وفي برنامج المجهر تعيين التكبير إلى 100X وعدسة متعددة الألوان إلى GFP و Mcherry. باستخدام iPS في برايتفيلد، حدد موقع الطائرة البؤرية وفتح المدير الذي لا طائل منه.حرك المرحلة واستخدم زر نقاط العلامة لتخزين إحداثيات 10 مواقع على الأقل ذات أهمية. قم بتبديل الكاميرا من شاشة iPS إلى الشاشة. تعيين المستوى البؤري وانقر فوق زر استبدال نقطة في لا طائل للمدير لمعايرة كل نقطة.افتح مصمم التجربة وصندوق تجميع الأمراض غير المركّب. حدد القنوات الفلورية المناسبة وإعدادات الاستبعاد الأمثل، وقم بتعيين الفواصل الزمنية بين الحصول على الصورة والوقت الإجمالي للتجربة. تمكين صيانة التركيز البؤري للمواقع المختارة وتحديد مجلد البيانات الذي يجب حفظ ملفات الصور فيه تلقائيًا.إعادة فحص كافة الإعدادات في التحكم في برنامج المجهر وبدء تجربة الفاصل الزمني. بعد الساعة الأولى من التجربة، تحقق من أن جميع مواضع المرحلة لا تزال في التركيز. عند الانتهاء من تجربة الفاصل الزمني، قم بإزالة طبق بيتري وتجاهل الطبق الذي يبلغ 35 ملليمترًا مع وسادة agarose وفقًا لبروتوكولات السلامة الحيوية المناسبة.لمعالجة بيانات الصور الفاصلة زمنياً، قم بنقل البيانات التجريبية إلى حاسوب محمل ببرمجيات فيجي وفتح صورة في فيجي. في خيارات الاستيراد تنسيقات حيوية، حدد عرض المكدس مع هايبركاكس. في وضع اللون المركب، حدد المقياس التلقائي.عن طريق التمرير من خلال كومة الصورة تقييم ما إذا كانت الخلايا وbdelloplasts ظلت التركيز على مدى التجربة. ما إذا كانت البقع الفلورية الخضراء من الحمض النووي والأخضر mNeon موجودة داخل خلايا B.bacteriovorus داخل bdelloplasts طوال مرحلة النمو وما إذا كان يمكن تصور جميع مراحل دورة حياة المفترسة. لتحليل bdelloplast الخلية B.bacteriovorus معينة، استخدم أداة اختيار لوضع علامة على الخلية من الفائدة.ثم قم بتكرار المنطقة المختارة. في الصورة المكررة، انقر فوق العملية وسلاسة ولكل قناة من قنوات الفلورسنت، انقر فوق الصورة، اللون، أدوات القنوات، وحدد القناة ذات الأهمية. ثم انقر على الصورة، وضبط، وتباين السطوع لضبط سطوع وتباين الصورة في كل قناة.لإضافة شريط مقياس، حدد تحليل، وأدوات، وشريط مقياس. لإضافة طابع زمني إلى الصور، انقر فوق الصور، والمكدسات، والطوابع الزمنية. لحفظ الصور المعدلة، حدد TIF.لحفظ البيانات كتسلسل صورة، AVI لإنتاج فيلم، أو PNG لحفظ صورة واحدة للإطار الحالي. هذا الوقت الفاصل الفلوريسنس نظام يستند المجهر يسمح لتتبع في الوقت الحقيقي من خلايا B.bacteriovorus الفردية ويوفر معلومات قيمة حول كل مرحلة من دورة حياة المفترسة المعقدة. يتيح الانصهار mCherry بحبوب الخلية المفترسة بأكملها أن تكون وصفت في مرحلة الهجوم وكذلك في مرحلة مبكرة من مرحلة النمو.يمكن تصور الانتقال من الهجوم إلى مرحلة النسخ المتماثل ليس فقط من قبل تشكيل bdelloplast المضيف ولكن أيضا من خلال ظهور replisome. يتم تجميع replisome في القطب الخلية الغازية ويمكن ملاحظة أكثر من replisome داخل خيوط B.bacteriovorus المتنامية مع تقدم مرحلة التكاثر. بعد أن يتم توليف عدة نسخ من الكروموسوم، يتم إنهاء النسخ المتماثل.وأخيراً، تخضع خيوط الخيوط المتعددة النوى للخيط ويتم تحرير الخلايا النسلية من البلاست. يجب أن تكون خلايا B.bacteriovorus مادية بما يكفي للبحث بنشاط عن فريستها ويجب أن تكون كثافة الخلايا بأكملها عالية بما يكفي للسماح بتعلق الخلايا المفترسة. قد تكون هذه المنصة مفيدة في التجارب التي تشمل مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة وتسهيل التحسينات في الهندسة الوراثية للبكتيريا B.bacteriovorus كمضاد حيوي حي في الطب البشري والطب البيطري.

Research

JoVE Journal

Biology

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

رصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن الميكروسكوب

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

الحصول على الإسفار الوقت الفاصل بين الأفلام من الخميرة في مهدها وتحليل ديناميات وحيدة الخلية باستخدام الطعوم

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

التصور التنمية الجمجمة في sox10: Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الخط الوقت الفاصل بين متحد البؤر المجهري

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

الفنية تصوير المصانع النسخ الفيروسية باستخدام مجهر الأسفار 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

أسلوب متعدد الاستخدامات لتركيب نبات يترك لتصوير الوقت الفاصل بين إينترافيتال

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...