Name: live-cell imaging of the life cycle of bacterial predator bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-05-08T14:00:00
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这项研究得到了国家科学中心授予Opus 2018/29/B/NZ6/00539给J.Z.C的支持。

1. B. 细菌纤维素 的制备，用于微观分析
<ol><li>在250 mL烧瓶中，通过结合1 mL的新鲜24 小时B.细菌 培养（例如，HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry）和3mL的隔夜猎物培养（例如， 大肠杆菌 S17-1 pZMR100）与50 mL的Ca-HEPES缓冲液（25 mM HEPES，2 mM CaCl2 [pH = 7.6]）根据需要补充抗生素（这里，50μg/mL卡那霉素）。</li>
	<li>在 30°C 下孵育共培养 24 小时，在 200 rpm 时摇动。</li>
	<li>检查猎物细?...

<ol>
	<li>Shatzkes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predatory+Bacteria+Attenuate+Klebsiella+pneumoniae+Burden+in+Rat+Lungs.">Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs.</a> mBio. 7 (6), (2016).</li><li>Iebba, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bdellovibrio+bacteriovorus+directly+attacks+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+Cystic+fibrosis+isolates.">Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 5, (2014).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injections+of+Predatory+Bacteria+Work+Alongside+Host+Immune+Cells+to+Treat+Shigella+Infection+in+Zebrafish+Larvae.">Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae.</a> Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).</li><li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+flagellar+filament+and+the+role+of+motility+in+bacterial+prey-penetration+by+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).</li><li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predatory+Patchwork:+Membrane+and+Surface+Structures+of+Bdellovibrio+bacteriovorus.">A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).</li><li>Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Chromosomal+Replication+in+Predatory+Bacterium+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1898 (2016).</li><li>Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Chromosome+Replication+and+Its+Relationship+to+Predatory+Attack+Lifestyles+in+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).</li><li>Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shadowing+the+actions+of+a+predator:+backlit+fluorescent+microscopy+reveals+synchronous+nonbinary+septation+of+predatory+Bdellovibrio+inside+prey+and+exit+through+discrete+bdelloplast+pores.">Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores.</a> Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).</li><li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+D-amino-acids+reveal+bi-cellular+cell+wall+modifications+important+for+Bdellovibrio+bacteriovorus+predation.">Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation.</a> Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).</li><li>Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predation+of+human+pathogens+by+the+predatory+bacteria+Micavibrio+aeruginosavorus+and+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).</li></ol>

由于人们越来越有兴趣使用 B.细菌 作为活抗生素，因此需要新的工具来观察掠夺性生命周期，特别是捕食者-病原体相互作用。所提出的协议用于实时跟踪整个 B.细菌 生命周期，特别是在宿主内部生长过程中。此外，利用一种产生荧光标记β夹的DNA聚合酶III全息酶的菌株的应用，能够监测染色体复制进展在整个 B.细菌的繁殖阶段。
此方法的关键步骤是正确...

Bdellovibrio细菌是一种小（0.3±0.5μm ×0.5±1.4μm）克阴性细菌，可捕食其他克阴性细菌，包括有害的病原体，如肺炎克勒布西拉、伪多莫纳斯aeruginosa和Shigella弹性神经1，2，3。2,3由于B.细菌杀死病原体，它被认为是一种潜在的活抗生素，可以用于对抗细菌感染，特别是那些由耐多药菌株引起的细菌感染。
B. 细菌具有一个奇特的生命周期，由两个阶段组成：自由生命的非复制性攻击阶段和细胞内生殖阶段（图1）。在自由生活阶段，这种高度移动的细菌，其移动速度高达160μm/s，搜索其猎物。附着在猎物的外膜上后，它进入4，5的内膜5。在白细胞间生殖阶段，B.细菌使用大量的水解酶来降解宿主的大分子，并重复使用它们以促进自身的生长。在入侵腹膜后不久，宿主细胞死亡并膨胀成一个球形结构，称为bdelloplast，其中掠夺性细胞拉长并复制其染色体。复制过程从复制源（oriC）6开始，一直持续到染色体的几个副本被完全合成7。有趣的是，每个染色体的复制后面不跟随细胞分裂。相反，捕食者拉长形成一个长，多核和丝状细胞。当营养枯竭时，灯丝经过同步隔膜，后代细胞从bdelloplast8中释放。
在B.细菌可以用作对抗细菌感染的活抗生素之前，了解其生命周期的主要阶段，特别是与猎物内增殖有关的阶段至关重要。由于在复杂的生命周期中，由于捕食者及其猎物的各种形态形式，B.细菌的活细胞成像一直具有挑战性。到目前为止，B.细菌与其宿主细胞之间的相互作用主要通过电子显微镜和,捕捉分析2、9、10进行了研究，9这两者都有局限性，特别是当它们被用来监测掠食性生命周期的连续阶段时。10这些方法提供B.细菌细胞的高分辨率图像，并使我们能够在攻击或生长阶段观察一个小捕食者。然而，它们不允许在两个生命周期阶段跟踪单个B.细菌。
这里介绍的是一个全面的协议，使用延时荧光显微镜（TLFM）来监测B.细菌的整个生命周期。由阿加罗斯垫组成的系统与细胞成像盘结合使用，其中掠夺性细胞可以在阿加罗斯垫下自由移动，而固定化的猎物细胞能够形成白杨拉斯特（图2）。此设置是根据大肠杆菌和B.细菌的特定菌株准备的E. coli，但协议可以很容易地改变，以适应用户的个人菌株（例如，携带不同的选择标记，蛋白质与不同的荧光团融合，等等）。
在这种情况下，为了在攻击 阶段可视化B.细菌 ，构建了一种特定的菌株（HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry），它表达了细胞质蛋白的荧光标记版本，PilZ（可应要求在我们的实验室中提供）7。该菌株还产生DnaN（+滑动夹），DNA聚合酶III全息酶的亚基，与荧光蛋白融合。这使得正在进行的DNA复制在掠食性细胞内被监测，因为它们在bdelloplast中生长。
虽然所述用于图像采集的协议和软件是指特定制造商提供的倒置显微镜（参见材料 表），但该技术可针对任何配备环境室或其他外部加热支架且能够延时成像的倒置显微镜进行调整。对于数据分析，用户可以选择与单个输出格式兼容的任何可用软件。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig01.jpg"> 图1： 大肠杆菌作为宿主 细胞的B. 细菌 生命周期。在攻击阶段，自由游 的B.细菌沃鲁斯 细胞搜索并附着在宿主 大肠杆菌细胞上 。入侵后，掠食性细胞在猎物的周围质中变得局部化，改变宿主细胞的形状，形成一个卵母细胞。生殖阶段从 bdelloplast 形成开始。掠夺性细胞消化猎物细胞，并重复使用简单的化合物来构建自己的结构。 B. 细菌作为 长丝生长在宿主的内皮。当猎物细胞的资源耗尽时 ，B.细菌丝 同步分裂并形成后代细胞。后代细胞发育后，它们就使白细胞发育成白细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MPW MED. INSTRUMENTS</td>
			<td>MPW-260R</td>
			<td>Rotor ref. 12183</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CertifiedMolecular Biology Agarose</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td>Open source image processing package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish 35 mm</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81218-200</td>
			<td>uncoated glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>GE</td>
			<td>DeltaVision Elite</td>
			<td>Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16555----------K</td>
			<td>Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Start SoftWoRx</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td>Manufacturer-supplied imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of the life cycle of bacterial predator bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy

Bdellovibrio 细菌是一 种小克阴性，强制性掠夺性细菌，可以杀死其他克阴性细菌，包括有害的病原体。因此，它被认为是一种活的抗生素。为了 将B.细菌作为一种 活抗生素，首先需要了解其复杂生命周期的主要阶段，特别是其在猎物体内的增殖。到目前为止，实时监控掠夺性生命周期的连续阶段一直具有挑战性。这里介绍的是一个全面的协议，用于 实时成像B.细菌的整个生命周期，特别是在它生长在宿主体内。为此，一个由阿加罗斯垫组成的系统与细胞成像盘结合使用，其中掠夺性细胞可以在阿加罗斯垫下自由移动，而固定猎物细胞能够形成白细胞。产生荧光标记的β-亚基的DNA聚合酶III的菌株的应用进一步允许在 B.细菌生命周期 的繁殖阶段监测染色体复制。

所述的基于TLFM的系统允许及时跟踪B.细菌的单个细胞（图3，电影1），并提供有关复杂掠夺性生命周期每个阶段的宝贵信息。PilZ-mCherry融合使整个掠食细胞在攻击阶段以及生长阶段的早期阶段被标记（图3）。从攻击阶段到复制阶段的过渡不仅由宿主的 bdelloplast 形成，而且由以 DnaN-mNeonGreen 荧光源为标志的复方体（复制机械）的外观?...

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Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

此处介绍的是一个协议，它描述了使用延时荧光显微镜与 agarose 垫和细胞成像盘相结合的掠夺性细菌 Bdellovibrio 细菌的完整生命周期的监测。

使用延时荧光显微镜对细菌捕食者 Bdellovibrio 细菌的生命周期进行活细胞成像

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

由于这些掠夺性细菌的复杂生命周期，活细胞Bdellovibrio细菌成像一直具有挑战性。我们的协议允许实时监控整个生命周期的各个阶段。虽然我们的协议是基于一个特定的均衡菌株，它可以很容易地适应各种细菌菌株，包括致病菌株。为了建立B.bacteriovorus培养，将一毫升新鲜24小时培养的细菌与三毫升隔夜猎物培养剂混合在250毫升的烧瓶中，含有50毫升的嬉皮士钙缓冲液，并根据需要补充抗生素。在30摄氏度和每分钟200转的24小时孵育后，检查猎物细胞已被液体安装的面部对比度显微镜完全lyly。大量的多攻击阶段B.细菌杆菌细胞应该存在，不应该看到大肠杆菌细胞或bdelloplast。通过0.45微米孔径过滤器将B.bacteriovorus培养物应变到50毫升锥形管中，并在离心机中悬浮滤土。然后将B.bacteriovorus颗粒重新悬浮在三毫升嬉皮士钙缓冲液中，最终光学密度为600纳米（约0.2），并在30摄氏度和每分钟200转200圈时孵育细菌，30分钟。为了准备宿主细胞，从宿主兴趣菌株中选择一个菌落，并在10毫升YT介质中点结核细菌，并辅之以抗生素，必要时在37摄氏度和每分钟180圈进行夜间孵育。第二天早上，将两毫升的隔夜培养转移到两毫升试管中，通过离心使细胞产生颗粒。然后在200微升的嬉皮士钙缓冲液中重新悬浮颗粒。离心后完全重新悬浮整个细胞颗粒，以确保猎物细胞在单个细胞水平上分离是非常重要的。为了准备细胞的延时荧光显微镜，首先，混合200毫克的低荧光分子级阿加罗斯与20毫升的钙嬉皮士缓冲液，并在微波炉中溶解阿加罗斯。将三毫升融化的阿加罗斯倒入35毫米的玻璃底盘中，使加糖凝固。使用实验室微铲，小心地从盘子中取出阿加罗斯垫，而不干扰垫的中心杆，将垫底部侧放在培养皿盖上。将浓缩宿主细胞悬浮液的五微升放在翻转垫上，并使用接种回路在中心极中传播细胞。接下来，在不扩散的情况下将浓缩B.bacteriovorus悬浮液的5微升添加到宿主细胞涂层表面，并快速将凝胶返回到35毫升玻璃底部盘顶部侧下。然后用盖子盖住盘子。对于共培养的延时浮光显微镜，将菜放在培养皿架中，使该菜在实验过程中不会移动，并将一滴浸入油放在倒置的显微镜上，将一滴放在盘子底部。将支架安装在倒置显微镜室内的显微镜舞台上，在显微镜软件中将放大倍数设置为 100 倍，将多色透镜安装到 GFP 和 Mcherry。在布莱特菲尔德使用 iPS，找到焦点平面并打开无意义的管理器。移动舞台并使用标记点按钮存储至少 10 个感兴趣位置的坐标。将摄像机 val 从 iPS 切换到监视器。设置焦平面，然后单击无意义的"管理器"中的替换点按钮以校准每个点。打开实验设计器，并无标记疾病堆叠框。选择适当的荧光通道和最佳消除设置，并设置图像采集与实验总时间之间的间隔。为所选位置启用对焦维护，并选择应自动保存图像文件的数据文件夹。重新检查显微镜软件控制中的所有设置，然后开始延时实验。实验的第一个小时后，检查所有阶段位置是否仍在聚焦中。延时实验完成后，取出培养皿，根据适当的生物安全方案，将35毫米的盘与阿加罗斯垫丢弃。为了处理延时图像数据，请将实验数据传输到装有斐济软件的计算机，并在斐济打开图像。在生物格式导入选项中，选择具有超堆栈的视图堆栈。在复合颜色模式下，选择自动缩放。通过滚动浏览图像堆栈，评估细胞和 bdelloplasts 在实验过程中是否仍然保持焦点。DNA和mNeon绿色的绿色荧光点是否存在于B.300年代生长阶段的B.310细胞中，以及掠食性生命周期的所有阶段是否都可以可视化。要分析特定的B.细菌杆菌细胞，请使用选择工具标记感兴趣的细胞。然后复制所选区域。在复制的图像中，单击过程并平滑，对于每个荧光通道，单击图像、颜色、通道工具，然后选择感兴趣的通道。然后单击图像、调整和亮度对比度，以调整每个通道中图像的亮度和对比度。要添加比例图条，请选择分析、工具和缩放栏。要向图像添加时间戳，请单击图像、堆栈和时间戳。要保存修改后的图像，请选择 TIF。若要将数据另存为图像序列，AVI 要生成影片，或 PNG 以保存当前帧的单个图像。这种基于时移荧光显微镜的系统允许实时跟踪单个 B.bacteriovorus 细胞，并提供有关复杂掠食生命周期每个阶段的宝贵信息。丸状mCherry融合使整个掠食性细胞在攻击阶段以及生长阶段的早期阶段被标记。从攻击阶段到复制阶段的转换不仅可以通过主机 bdelloplast 形成来可视化，还可以通过复制体的外观来可视化。随着繁殖阶段的推进，在入侵的细胞极中组装再体，在生长的B.1.17纤维丝中可以观察到不止一个再质量。合成染色体的几个副本后，复制将终止。最后，多核长丝经过隔膜，后代细胞从白细胞中释放。B.细菌细胞应该足够物质，以积极寻找他们的猎物，整个细胞密度应该足够高，允许捕食性细胞附着。该平台可能有助于涉及多药耐药病原体的试验，并有助于改进B.bacteriovorus作为人类和兽医医学中活抗生素的基因工程。

Research

JoVE Journal

Biology

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

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