Name: live-cell imaging of the life cycle of bacterial predator bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-05-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענק מרכז המדע הלאומי אופוס 2018/29/B/NZ6/00539 לג'יי.זי.סי.

1. הכנת ב. בקטריובוס לניתוח מיקרוסקופי
<ol><li>בקבוקון 250 מ"ל, להגדיר את coculture על ידי שילוב 1 מ"ל של תרבות בקטריובוז 24 h רענן (למשל, HD100 DnaN-mNeonGreen / PilZ-mCherry) ו 3 מ"ל של תרבות טרף לילה (למשל, E. coli S17-1 pZMR100) עם 50 מ"ל של מאגר Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 מ'מ CaCl2 [pH = 7.6]) בתוספת עם אנטיביוטיקה בעת הצורך (כאן, 50 ?...

<ol>
	<li>Shatzkes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predatory+Bacteria+Attenuate+Klebsiella+pneumoniae+Burden+in+Rat+Lungs.">Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs.</a> mBio. 7 (6), (2016).</li><li>Iebba, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bdellovibrio+bacteriovorus+directly+attacks+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+Cystic+fibrosis+isolates.">Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 5, (2014).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injections+of+Predatory+Bacteria+Work+Alongside+Host+Immune+Cells+to+Treat+Shigella+Infection+in+Zebrafish+Larvae.">Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae.</a> Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).</li><li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+flagellar+filament+and+the+role+of+motility+in+bacterial+prey-penetration+by+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).</li><li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predatory+Patchwork:+Membrane+and+Surface+Structures+of+Bdellovibrio+bacteriovorus.">A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).</li><li>Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Chromosomal+Replication+in+Predatory+Bacterium+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1898 (2016).</li><li>Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Chromosome+Replication+and+Its+Relationship+to+Predatory+Attack+Lifestyles+in+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).</li><li>Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shadowing+the+actions+of+a+predator:+backlit+fluorescent+microscopy+reveals+synchronous+nonbinary+septation+of+predatory+Bdellovibrio+inside+prey+and+exit+through+discrete+bdelloplast+pores.">Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores.</a> Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).</li><li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+D-amino-acids+reveal+bi-cellular+cell+wall+modifications+important+for+Bdellovibrio+bacteriovorus+predation.">Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation.</a> Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).</li><li>Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predation+of+human+pathogens+by+the+predatory+bacteria+Micavibrio+aeruginosavorus+and+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).</li></ol>

בשל העניין המוגבר בשימוש B. bacteriovorus כאנטיביוטיקה חיה, כלים חדשים להתבוננות במחזור החיים הטורף, במיוחד אינטראקציות טורפים-פתוגן, נדרשים. הפרוטוקול המוצג משמש למעקב אחר כל מחזור החיים B. bacteriovorus, במיוחד במהלך הצמיחה שלה בתוך המארח, בזמן אמת. יתר על כן, היישום של זן המייצר פלואורסצנט מ?...

Bdellovibrio bacteriovorus הוא קטן (0.3-0.5 μm על ידי 0.5-1.4 μm) חיידק גרם שלילי הטורף חיידקים אחרים גרם שלילי, כולל פתוגנים מזיקים כגון Klebsiella דלקת ריאות, פסאודומונס aeruginosa, ו Shigella flexneri1,,2,3.3 מאז B. bacteriovorus הורג פתוגנים, הוא נחשב אנטיביוטיקה חיה פוטנציאלית שניתן להחיל כדי להילחם בזיהומים חיידקיים, במיוחד אלה הנגרמת על ידי זנים עמידים לתרופות מרובות.
ב. bacteriovorus מציג מחזור חיים מוזר המורכב משני שלבים: שלב התקפה חיים חופשיים שאינם משוכפלים ושלב רבייה תאית(איור 1). בשלב החיים החופשיים, החיידק המוטיב הזה, אשר נע במהירויות של עד 160 μm / s, מחפש את טרפו. לאחר הצמדה לממברנה החוצה של הטרף, הוא נכנס פריפלסמה4,5. במהלך שלב הרבייה הבין-פריפלסמית, ב. בקטריובוס משתמש בשפע של אנזימים הידרולטיסיים כדי להשפיל את המקרומולקולות של המארח ולהשתמש בהם מחדש לצמיחה שלו. זמן קצר לאחר הפלישה פריפלסמה, התא המארח מת ומתנפח לתוך מבנה כדורי הנקרא bdelloplast, שבו התא הטורף מארכת ושכפול כרומוזומים שלה. תהליך השכפול מתחיל במקור השכפול (oriC)6 וממשיך עד שמספר עותקים של הכרומוזום מסונתזיםלחלוטין 7. מעניין, שכפול של כל כרומוזום אינו מלווה על ידי חלוקת תאים. במקום זאת, הטורף מתעצם כדי ליצור תא ארוך, רב-גרעיני ונימה. עם דלדול תזונתי, חוט החוט עובר ספיגה סינכרונית ותאי הצבי משתחררים bdelloplast8.
לפני B. bacteriovorus יכול לשמש כאנטיביוטיקה חיה נגד זיהומים חיידקיים, זה חיוני כדי להבין את השלבים העיקריים של מחזור החיים שלה, במיוחד אלה הקשורים להתפשטותו בתוך הטרף. הדמיה חיה של ב. בקטריובוס הייתה מאתגרת, בשל הצורות המורפולוגיות השונות של הטורף וטרפו במהלך מחזור החיים המורכב. עד כה, האינטראקציות בין B. bacteriovorus והתא המארח שלה נחקרו בעיקר על ידי מיקרוסקופאלקטרונים וניתוח snap-shot 2,9,10, שניהם יש מגבלות, במיוחד כאשר הם משמשים כדי לפקח על שלביםרצופיםשל מחזורהחייםהטורף. שיטות אלה מספקות תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי B. bacteriovorus ומאפשרות התבוננות טורף קטן במהלך שלב ההתקפה או הצמיחה. עם זאת, הם אינם מאפשרים מעקב אחר תאים B. bacteriovorus יחיד לאורך שני שלבי מחזור החיים.
מוצג כאן פרוטוקול מקיף לשימוש מיקרוסקופית פלואורסצנית זמן לשגות (TLFM) כדי לפקח על מחזור החיים המלא של B. bacteriovorus. מערכת המורכבת משטח agarose משמש בשילוב עם צלחת הדמיה תא, שבו התאים הטורפים יכולים לנוע בחופשיות מתחת למשטח agarose בעוד תאי טרף משותקים מסוגלים ליצור bdelloplasts(איור 2). הגדרה זו מוכנה בהתבסס על זנים ספציפיים של חיידקי אי-קולי ו-B. bacteriovorus, אך ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כך שיתאים לזנים האישיים של המשתמש (לדוגמה, נשיאת סמני בחירה שונים, חלבונים המותכים לפלואורופורים שונים וכו').
במקרה זה, כדי לדמיין B. bacteriovorus במהלך שלב ההתקפה, זן ספציפי (HD100 DnaN-mNeonGreen / PilZ-mCherry) נבנה המבטא גרסה מתויגת פלורסנטית של חלבון cytoplasmic, PilZ (זמין במעבדה שלנו על פי בקשה)7. זן זה בנוסף מייצר DnaN (β-הזזה מהדק), תת-אחד של הולוגאנזים DNA פולימראז השלישי, התמזגו עם חלבון פלורסנט. זה מאפשר שכפול DNA מתמשך להיות במעקב בתוך התאים הטורפים כפי שהם גדלים בתוך bdelloplasts.
למרות הפרוטוקול המתואר והתוכנה המשמשים לרכישת תמונה מתייחסים מיקרוסקופ הפוך המסופק על ידי יצרן מסוים (ראה טבלת חומרים),טכניקה זו עשויה להיות מותאמת עבור כל מיקרוסקופ הפוך מצויד תא סביבתי או מחזיק חימום חיצוני אחר ומסוגל הדמיה לשגות זמן. עבור ניתוח נתונים, משתמשים יכולים לבחור כל תוכנה זמינה התואמת לתבניות פלט בודדות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig01.jpg"> איור 1: מחזור חיים ב. bacteriovorus ב E. coli כתא מארח. במהלך שלב ההתקפה, תא B. bacteriovorus שחיה חופשית מחפש ומתחבר לתא E. coli מארח. לאחר הפלישה, התא הטורף הופך למקומי בפריפלסמה של הטרף, משנה את צורת התא המארח ויוצר bdelloplast. שלב הרבייה מתחיל במבנה bdelloplast. התא הטורף מעכל את תא הטרף ומהשתמש מחדש בתרכובות פשוטות כדי לבנות מבנים משלו. ב. bacteriovorus גדל כתרימה אחת ארוכה בתוך פריפלסמה של המארח. כאשר המשאבים של תא הטרף מוצו, חוט החיידק B. סינכרוני ספיגה ויוצר תאים צגידים. לאחר שתאי הצולה מפתחים את הפלגלה שלהם, הם מלקטים את ה-bdelloplast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MPW MED. INSTRUMENTS</td>
			<td>MPW-260R</td>
			<td>Rotor ref. 12183</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CertifiedMolecular Biology Agarose</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td>Open source image processing package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish 35 mm</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81218-200</td>
			<td>uncoated glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>GE</td>
			<td>DeltaVision Elite</td>
			<td>Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16555----------K</td>
			<td>Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Start SoftWoRx</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td>Manufacturer-supplied imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of the life cycle of bacterial predator bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus הוא קטן גרם שלילי, חיידק טורף חובה שהורג חיידקים אחרים גרם שלילי, כולל פתוגנים מזיקים. לכן, הוא נחשב אנטיביוטיקה חיה. כדי להחיל B. bacteriovorus כאנטיביוטיקה חיה, זה הראשון הכרחי כדי להבין את השלבים העיקריים של מחזור החיים המורכב שלה, במיוחד התפשטותו בתוך טרף. עד כה, זה היה מאתגר לעקוב אחר שלבים רצופים של מחזור החיים הטורף בזמן אמת. מוצג כאן פרוטוקול מקיף להדמיה בזמן אמת של מחזור החיים המלא של B. bacteriovorus, במיוחד במהלך הצמיחה שלה בתוך המארח. לשם כך, מערכת המורכבת משטח agarose משמש בשילוב עם צחות הדמיה תא, שבו התאים הטורפים יכולים לנוע בחופשיות מתחת למשטח agarose בעוד תאי טרף משותקים מסוגלים ליצור bdelloplasts. היישום של זן המייצר שפעת מתויגת β-subunit של פולימראז DNA III עוד יותר מאפשר שכפול כרומוזום להיות במעקב במהלך שלב הרבייה של מחזור החיים B. bacteriovorus.

המערכת המתוארת מבוססת TLFM מאפשרת מעקב אחר תאים בודדים של B. bacteriovorus (איור 3, סרט 1) ומספקתמידע רב ערך על כל שלב במחזור החיים הטורף המורכב. היתוך PilZ-mCherry מאפשר לתייג את כל התא הטורף בשלב ההתקפה, כמו גם בשלב מוקדם של שלב הצמיחה (איור 3). המעבר מן ההתקפה ל...

Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

מוצג כאן פרוטוקול המתאר ניטור של מחזור החיים המלא של חיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצני זמן לשגות בשילוב עם כרית agarose ומנות הדמיה תא.

הדמיה חיה של מחזור החיים של החיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצני זמן לשגות

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

הדמיה חיה-תא Bdellovibrio בקטריובורוס כבר מאתגר בשל מחזור החיים המורכב של חיידקים טורפים אלה. הפרוטוקול שלנו מאפשר ניטור של שלבי מחזור החיים המלא בזמן אמת. למרות שהפרוטוקול שלנו מבוסס על זני שוויון ספציפיים, הוא עשוי להיות מותאם בקלות למגוון זנים חיידקיים כולל זנים פתוגניים.כדי להקים תרבות B.bacteriovorus, לשלב מיליליטר אחד של חיידקים מתורבתים טריים 24 שעות ביממה עם שלושה מיליליטר של תרבות טרף לילה בבקבוק 250 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר של חיץ היפים סידן בתוספת אנטיביוטיקה לפי הצורך. לאחר דגירה של 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס ו 200 מהפכות לדקה, לבדוק כי תאי הטרף כבר lysed באופן מלא על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פנים רכוב נוזלי. תאים רבים של B.bacteriovorus מרובי התקפה צריכים להיות נוכחים ואין תא E.coli או bdelloplast צריך להיות גלוי.מסננים את תרבות B.bacteriovorus באמצעות מסנן בגודל נקבובית 0.45 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר ולהשעות את הסינון בצנטריפוגה. ואז להשעות מחדש את גלולת B.bacteriovorus בשלושה מיליליטר של חיץ היפים סידן לצפיפות אופטית סופית ב 600 ננומטר של כ 0.2 ו דגירה החיידקים ב 30 מעלות צלזיוס ו 200 מהפכות לדקה במשך 30 דקות. כדי להכין את התאים המארחים, בחר מושבה אחת מן הזן המארח של עניין כדי להנהן את החיידקים ב 10 מיליליטר של מדיום YT בתוספת אנטיביוטיקה לפי הצורך עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 180 מהפכות לדקה.למחרת בבוקר להעביר שני מיליליטר של תרבות הלילה למבחנה שני מיליליטר ו גלולה התאים על ידי צנטריפוגה. ואז להשעות מחדש את גלולה ב 200 microliters של חיץ היפים סידן. חשוב מאוד להשעות מחדש את כל גלולת התא לאחר צנטריפוגה כדי לוודא שתא הטרף מופרד ברמת התא הבודד.כדי להכין את התאים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית לשגות בזמן, הראשון, לערבב 200 מיליגרם של כיתה מולקולרית פלואורסצנטי נמוך agarose עם 20 מיליליטר של חיץ היפים סידן ולהמיס את התעוררות במיקרוגל. יוצקים שלושה מיליליטר של אגרוז נמס לתוך צלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר ולאפשר אגרוז להתגבש. באמצעות מרית מיקרו מעבדה, להסיר בזהירות את כרית agarose מן המנה מבלי להפריע את הקוטב המרכזי של כרית מניחים את הצד התחתון כרית על כיסוי צלחת פטרי.מניחים חמישה מיקרוליטרים של ההשעיה מרוכזת תא המארח על כרית הפוכה ולהשתמש לולאת חיסון כדי להפיץ תאים בקוטב המרכזי. לאחר מכן להוסיף חמישה microliters של השעיה מרוכזת B.bacteriovorus על פני השטח מצופה התא המארח מבלי להתפשט במהירות להחזיר את הג'ל לצלחת התחתונה 35 מיליליטר זכוכית בצד העליון למטה. ואז לכסות את המנה עם מכסה.למיקרוסקופיית Time-Lapse Florescence של תרבות השיתוף, מניחים את המנה במחזיק צלחת פטרי כך שהמנה לא תזוז במהלך הניסוי ותמקם טיפה אחת של שמן טבילה על מטרת המיקרוסקופ ההפוך וירידה אחת בתחתית המנה. הר את המחזיק על שלב המיקרוסקופ בתוך תא המיקרוסקופ ההפוך ובתוכנות המיקרוסקופ הגדר את ההגדלה ל- 100X ואת עדשת הפוליכרום ל- GFP ו- Mcherry. באמצעות IPS בברייטפילד, לאתר את המטוס המוקד ולפתוח את המנהל חסר טעם.הזז את הבמה ולהשתמש בלחצן נקודות סימון כדי לאחסן את הקואורדינטות של לפחות 10 עמדות עניין. העבר את val המצלמה מ IPS לצג. הגדר את מישור המוקד ולחץ על לחצן נקודת ההחלפה בחוסר הטעם למנהל כדי לכייל כל נקודה.פתח את מעצב הניסויים וסמן תיבת ערימת מחלות. בחר את הערוצים הפלורסנטיים המתאימים ואת הגדרות האי כלילה אופטימלית ולהגדיר את המרווחים בין רכישת התמונה ואת הזמן הכולל של הניסוי. אפשר תחזוקת מוקד עבור המיקומים שנבחרו ובחר את תיקיית הנתונים שבה יש לשמור את קבצי התמונה באופן אוטומטי.בדוק מחדש את כל ההגדרות בבקרת תוכנת המיקרוסקופ והתחל את ניסוי לשגות הזמן. לאחר השעה הראשונה של הניסוי, בדקו שכל עמדות הבמה עדיין בפוקוס. כאשר הניסוי לשגות זמן הוא סיים, להסיר את צלחת פטרי להשליך את המנה 35 מילימטר עם כרית אגרוז על פי פרוטוקולי ביו בטיחות המתאימים.לעיבוד נתוני התמונה לשגות בזמן, להעביר את הנתונים הניסיוניים למחשב טעון עם תוכנת פיג'י ולפתוח תמונה בפיג'י. באפשרויות ייבוא בתבניות ביולוגיות, בחר מחסנית תצוגה עם היפר-סטאק. במצב צבע ללא הפרדות צבע, בחר שינוי גודל אוטומטי.על ידי גלילה בערימות התמונה להעריך אם התאים bdelloplasts נשאר להתמקד במהלך הניסוי. האם כתמי הפלואורסצנטי הירוקים מהדנ"א וירוק ה-mNeon נמצאים בתאי B.bacteriovorus בתוך bdelloplasts לאורך כל שלב הצמיחה והאם ניתן לדמיין את כל שלבי מחזור החיים הטורף. כדי לנתח B.bacteriovorus תא bdelloplast מסוים, להשתמש בכלי בחירה כדי לסמן את התא של עניין.לאחר מכן שכפל את האזור הנבחר. בתמונה המשוכפלת, לחצו על 'תהליך' ו'חלק' ולכל ערוץ פלואורסצנטי לחצו על תמונה, צבע, כלי ערוצים ובחרו בערוץ המעניין. לאחר מכן לחצו על חדות תמונה, כוונון ובהירות כדי להתאים את הבהירות והניגודיות של התמונה בכל ערוץ.להוספת סרגל קנה מידה, בחרו 'נתח', 'כלים' ו'סרגל שינוי קנה מידה'. להוספת חותמת זמן לתמונות, לחצו על 'תמונות', 'ערימות' ו'חותמת זמן'. לשמירת התמונות ששונו, בחרו TIF.לשמירת הנתונים כרצף תמונות, AVI להפקת סרט או PNG לשמירת תמונה בודדת של המסגרת הנוכחית. מערכת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תאי B.bacteriovorus בודדים ומספקת מידע רב ערך על כל שלב של מחזור החיים הטורף המורכב. היתוך mCherry גלולות מאפשר התא הטורף כולו להיות מסומן בשלב ההתקפה, כמו גם בשלב מוקדם של שלב הצמיחה.המעבר מההתקפה לשלב השכפול יכול להיות חזותי לא רק על ידי היווצרות bdelloplast המארח, אלא גם על ידי המראה של השיבה. השיבה מורכבת בקוטב התא הפולש ויותר מתשיב אחד ניתן לראות בתוך סיסם B.bacteriovorus גדל ככל שלב הרבייה מתקדם. לאחר מספר עותקים של הכרומוזום מסונתזים, השכפול הסתיים.לבסוף, התסיסה הרב-גרעינית עוברת ספיגה והתאים הצאצאים משתחררים מהלדלופלסטיק. התאים B.bacteriovorus צריך להיות חומר מספיק כדי לחפש באופן פעיל את הטרף שלהם ואת צפיפות התא כולו צריך להיות גבוה מספיק כדי לאפשר חיבור תא טורף. פלטפורמה זו עשויה להיות שימושית בניסויים מעורבים פתוגנים עמידים לתרופות מרובות כדי להקל על שיפורים בהנדסה הגנטית של B.bacteriovorus כמו אנטיביוטיקה בחיים ברפואה האנושית והווטרינרית.

Research

JoVE Journal

Biology

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

הדמיה תפקודית של מפעלי שעתוק ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות תלת-ממד

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...