Name: live-cell imaging of the life cycle of bacterial predator bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-05-08T14:00:00
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इस अध्ययन को राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र अनुदान रचना 2018/29/B/NZ6/00539 से J.Z.C.

1. सूक्ष्म विश्लेषण के लिए बी बैक्टीरियोवोरस की तैयारी
<ol><li>एक 250 मिलीलीटर फ्लास्क में, ताजा 24 एच बी बैक्टीरियोवरस संस्कृति (जैसे, HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) और रात भर शिकार संस्कृति के 3 एमएल (जैसे, ई. कोलाई S17-1 pZ...

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	<li>Shatzkes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predatory+Bacteria+Attenuate+Klebsiella+pneumoniae+Burden+in+Rat+Lungs.">Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs.</a> mBio. 7 (6), (2016).</li><li>Iebba, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bdellovibrio+bacteriovorus+directly+attacks+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+Cystic+fibrosis+isolates.">Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 5, (2014).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injections+of+Predatory+Bacteria+Work+Alongside+Host+Immune+Cells+to+Treat+Shigella+Infection+in+Zebrafish+Larvae.">Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae.</a> Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).</li><li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+flagellar+filament+and+the+role+of+motility+in+bacterial+prey-penetration+by+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).</li><li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predatory+Patchwork:+Membrane+and+Surface+Structures+of+Bdellovibrio+bacteriovorus.">A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).</li><li>Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Chromosomal+Replication+in+Predatory+Bacterium+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1898 (2016).</li><li>Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Chromosome+Replication+and+Its+Relationship+to+Predatory+Attack+Lifestyles+in+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).</li><li>Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shadowing+the+actions+of+a+predator:+backlit+fluorescent+microscopy+reveals+synchronous+nonbinary+septation+of+predatory+Bdellovibrio+inside+prey+and+exit+through+discrete+bdelloplast+pores.">Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores.</a> Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).</li><li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+D-amino-acids+reveal+bi-cellular+cell+wall+modifications+important+for+Bdellovibrio+bacteriovorus+predation.">Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation.</a> Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).</li><li>Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predation+of+human+pathogens+by+the+predatory+bacteria+Micavibrio+aeruginosavorus+and+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).</li></ol>

एक जीवित एंटीबायोटिक के रूप में बी बैक्टीरियोवरस का उपयोग करने में बढ़ी हुई रुचि के कारण, शिकारी जीवन चक्र, विशेष रूप से शिकारी-रोगजनक बातचीत को देखने के लिए नए उपकरणों की आवश्यकता है। प्रस्तुत प्र?...

Bdellovibrio जीवाणु एक छोटा है (0.3-0.5 माइक्रोन द्वारा 0.5-1.4 माइक्रोन) ग्राम-नकारात्मक जीवाणु जो अन्य ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया पर शिकार करता है, जिसमें हानिकारक रोगजनकों जैसे क्लेबसिला निमोनिया, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और शिगेला फ्लेक्सनेरी1,2,,3शामिल हैं।, चूंकि बी बैक्टीरियोवरस रोगजनकों को मारता है, इसलिए इसे एक संभावित जीवित एंटीबायोटिक माना जाता है जिसे बैक्टीरियल संक्रमणों का मुकाबला करने के लिए लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से मल्टीड्रग प्रतिरोधी उपभेदों के कारण।
B. बैक्टीरियोवरस दो चरणों से मिलकर एक अजीब जीवन चक्र प्रदर्शित करता है: एक मुक्त रहने वाले गैर-प्रतिकृति हमले का चरण और एक इंट्रासेलुलर प्रजनन चरण(चित्रा 1)। मुक्त रहने वाले चरण में, यह अत्यधिक मोती जीवाणु, जो 160 माइक्रोन/एस तक की गति से चलता है, अपने शिकार की खोज करता है। शिकार की बाहरी झिल्ली से जुड़ने के बाद, यह पेरिप्लाज्म4,,5में प्रवेश करता है। इंटरपरिपिप्लाज्मिक प्रजनन चरण के दौरान, बी बैक्टीरियोवोरस मेजबान के मैक्रोमॉलिक्यूल्स को नीचा दिखाने और अपने स्वयं के विकास के लिए उनका पुन: उपयोग करने के लिए हाइड्रोलिटिक एंजाइमों की अधिकता का उपयोग करता है। पेरिप्लाज्म पर हमला करने के तुरंत बाद, मेजबान कोशिका मर जाती है और एक गोलाकार संरचना में फूल जाती है जिसे एक ब्लाडेलोप्लास्ट कहा जाता है, जिसके अंदर शिकारी कोशिका अपने गुणसूत्रों को बढ़ाती है और प्रतिकृति बनाती है। प्रतिकृति प्रक्रिया प्रतिकृति मूल(ORIC)6 से शुरू होती है और तब तक आय होती है जब तक गुणसूत्र की कई प्रतियां पूरीतरहसे संश्लेषित नहीं हो जातीं . दिलचस्प बात यह है कि प्रत्येक गुणसूत्र की प्रतिकृति कोशिका विभाजन के बाद नहीं होती है। इसके बजाय, शिकारी एक लंबी, बहुनीय और फिलामेंटस सेल बनाने के लिए आगे बढ़ जाता है। पोषक तत्वों की कमी पर, फिलामेंट सिंक्रोनस सेप्टेशन से गुजरता है और संतान कोशिकाओं को 5डेलोप्लास्ट 8 से जारी कियाजाताहै।
इससे पहले कि बी बैक्टीरियोवरस बैक्टीरिया संक्रमण के खिलाफ एक जीवित एंटीबायोटिक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, यह अपने जीवन चक्र के प्रमुख चरणों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से शिकार के अंदर इसके प्रसार से संबंधित उन । जटिल जीवन चक्र के दौरान शिकारी और उसके शिकार के विभिन्न रूपात्मक रूपों के कारण बी बैक्टीरियोवरस की लाइव-सेल इमेजिंग चुनौतीपूर्ण रही है। अब तक, बी बैक्टीरियोवोरस और इसके मेजबान सेल के बीच बातचीत मुख्य रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और स्नैप-शॉट,विश्लेषण2,,9,10द्वारा अध्ययन की गई है, जिनमें से दोनों की सीमाएं हैं, खासकर जब उनका उपयोग शिकारी जीवन चक्र के क्रमिक चरणों की निगरानी के लिए किया जाता है। ये विधियां बी बैक्टीरियोवरस कोशिकाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान करती हैं और हमले या विकास चरण के दौरान एक छोटे शिकारी के अवलोकन को सक्षम करती हैं। हालांकि, वे दोनों जीवन चक्र चरणों में एकल बी बैक्टीरियोवरस कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति नहीं देते हैं।
यहां प्रस्तुत बी बैक्टीरियोवोरसके पूर्ण जीवन चक्र की निगरानी के लिए समय-चूक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (टीएमएफएम) का उपयोग करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल है। एक प्रणाली जिसमें एक एग्राजिंग पैड होता है, जिसका उपयोग सेल-इमेजिंग डिश के संयोजन में किया जाता है, जिसमें शिकारी कोशिकाएं एगर उठे पैड के नीचे स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित हो सकती हैं जबकि स्थिर शिकार कोशिकाएं bdelloplasts(चित्रा 2)बनाने में सक्षम हैं। यह सेट-अप ई कोलाई और बी बैक्टीरियोवरसदोनों के विशिष्ट उपभेदों के आधार पर तैयार किया जाता है, लेकिन प्रोटोकॉल को उपयोगकर्ता के व्यक्तिगत उपभेदों (उदाहरण के लिए, विभिन्न चयन मार्कर, विभिन्न फ्लोरोफोरस आदि के साथ जुड़े प्रोटीन) को फिट करने के लिए आसानी से बदला जा सकता है।
इस मामले में, हमले के चरण के दौरान बी बैक्टीरियोवरस की कल्पना करने के लिए, एक विशिष्ट तनाव (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) का निर्माण किया गया था जो साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन, पिल्ज़ (अनुरोध पर हमारी प्रयोगशाला में उपलब्ध)7के फ्लोरोसेंटली टैग किए गए संस्करण को व्यक्त करता है। यह तनाव अतिरिक्त रूप से डीएनएन (ए-स्लाइडिंग क्लैंप), डीएनए पॉलीमरेज III होलोएंजाइम का एक उपइकान, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जुड़ा हुआ है। यह चल रहे डीएनए प्रतिकृति को शिकारी कोशिकाओं के अंदर निगरानी करने में सक्षम बनाता है क्योंकि वे bdelloplasts के भीतर बढ़ते हैं ।
यद्यपि छवि अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्णित प्रोटोकॉल और सॉफ्टवेयर एक विशिष्ट निर्माता (सामग्री की तालिकादेखें) द्वारा प्रदान किए गए उल्टे माइक्रोस्कोप को संदर्भित करते हैं, इस तकनीक को पर्यावरण कक्ष या अन्य बाहरी हीटिंग धारक से लैस किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए समायोजित किया जा सकता है और समय-चूक इमेजिंग में सक्षम हो सकता है। डेटा विश्लेषण के लिए, उपयोगकर्ता व्यक्तिगत आउटपुट प्रारूपों के साथ संगत किसी भी उपलब्ध सॉफ्टवेयर का चयन कर सकते हैं।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig01.jpg"> चित्रा 1: बी बैक्टीरियोवरस जीवन चक्र ई. कोलाई में एक मेजबान सेल के रूप में । हमले के चरण के दौरान, एक मुक्त तैराकी बी बैक्टीरियोवरस सेल के लिए खोज करता है और एक मेजबान ई. कोलाई सेल को देता है । आक्रमण के बाद, शिकारी कोशिका शिकार के पेरिप्लाज्म में स्थानीयकृत हो जाती है, मेजबान सेल के आकार को बदल देती है और एक 5डेलोप्लास्ट बनाती है। प्रजनन चरण bdelloplast गठन के साथ शुरू होता है। शिकारी कोशिका शिकार कोशिका को पचाती है और अपनी संरचनाओं का निर्माण करने के लिए सरल यौगिकों का पुन: उपयोग करती है। बी बैक्टीरियोवरस मेजबान के पेरिप्लाज्म के अंदर एक लंबे एकल फिलामेंट के रूप में बढ़ता है । जब शिकार सेल के संसाधन समाप्त हो जाते हैं, तो बी बैक्टीरियोवरस फिलामेंट समकालिक रूप से सेप्ट करता है और संतान कोशिकाओं का निर्माण करता है। संतान कोशिकाओं के बाद उनके फ्लैगेला विकसित होते हैं, वे ब्लाडेलोप्लास्ट को lyse करते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MPW MED. INSTRUMENTS</td>
			<td>MPW-260R</td>
			<td>Rotor ref. 12183</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CertifiedMolecular Biology Agarose</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td>Open source image processing package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish 35 mm</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81218-200</td>
			<td>uncoated glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>GE</td>
			<td>DeltaVision Elite</td>
			<td>Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16555----------K</td>
			<td>Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Start SoftWoRx</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td>Manufacturer-supplied imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of the life cycle of bacterial predator bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy

Bdellovibrio जीवाणु एक छोटा ग्राम नकारात्मक, अनिवार्य शिकारी जीवाणु है कि हानिकारक रोगजनकों सहित अन्य ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया को मारता है। इसलिए इसे लिविंग एंटीबायोटिक माना जाता है। बी बैक्टीरियोवरस को जीवित एंटीबायोटिक के रूप में लागू करने के लिए, सबसे पहले इसके जटिल जीवन चक्र के प्रमुख चरणों को समझना आवश्यक है, विशेष रूप से शिकार के अंदर इसका प्रसार। अब तक, वास्तविक समय में शिकारी जीवन चक्र के लगातार चरणों की निगरानी करना चुनौतीपूर्ण रहा है । यहां प्रस्तुत बी बैक्टीरियोवरसके पूर्ण जीवन चक्र के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल है, विशेष रूप से मेजबान के अंदर इसके विकास के दौरान। इस उद्देश्य के लिए, एक एगरेग्मेंट पैड से मिलकर एक प्रणाली का उपयोग सेल-इमेजिंग व्यंजनों के संयोजन में किया जाता है, जिसमें शिकारी कोशिकाएं एगर उठे पैड के नीचे स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित हो सकती हैं जबकि स्थिर शिकार कोशिकाएं bdelloplasts बनाने में सक्षम हैं। डीएनए पॉलीमरेज III के फ्लोरोसेंटी टैग किए गए एक तनाव का अनुप्रयोग बी बैक्टीरियोवोरस जीवन चक्र के प्रजनन चरण के दौरान गुणसूत्र प्रतिकृति की निगरानी करने की अनुमति देता है।

वर्णित टीएलएफएम-आधारित प्रणाली बीबैक्टीरियोवरस की व्यक्तिगत कोशिकाओं को समय पर ट्रैक करने की अनुमति देतीहै (चित्रा 3, मूवी 1)और जटिल शिकारी जीवन चक्र के प्रत्येक चरण के बारे में मू...

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Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जो एक एगर उठे पैड और सेल-इमेजिंग व्यंजनों के संयोजन में समय-चूक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके शिकारी जीवाणु Bdellovibrio बैक्टीरियोवोरस के पूर्ण जीवन चक्र की निगरानी का वर्णन करता है।

टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके बैक्टीरियल शिकारी बीडीलोविब्रियो बैक्टीरियोवोस के जीवन चक्र की लाइव-सेल इमेजिंग

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

इन शिकारी बैक्टीरिया के जटिल जीवन चक्र के कारण लाइव-सेल बीडीलोविब्रियो बैक्टीरियो बैक्टेरियोवोस इमेजिंग चुनौतीपूर्ण रही है। हमारा प्रोटोकॉल वास्तविक समय में पूर्ण जीवन चक्र के चरणों की निगरानी की अनुमति देता है। यद्यपि हमारा प्रोटोकॉल एक विशिष्ट बराबर उपभेदों पर आधारित है, इसे रोगजनक उपभेदों सहित विभिन्न जीवाणु उपभेदों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।एक बी बैक्टीरियोवोरस संस्कृति स्थापित करने के लिए, एक २५० मिलीलीटर फ्लास्क में रातोंरात शिकार संस्कृति के तीन मिलीलीटर के साथ ताजा 24 घंटे के सुसंस्कृत बैक्टीरिया के एक मिलीलीटर गठबंधन कैल्शियम हिप्पी बफर के ५० मिलीलीटर युक्त जरूरत के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक । 30 डिग्री सेल्सियस और प्रति मिनट 200 क्रांतियों पर 24 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, जांच करें कि शिकार कोशिकाओं को पूरी तरह से तरल घुड़सवार चेहरे के विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा lysed किया गया है । कई बहु-हमले चरणबद्ध बी बैक्टीरियोवरस कोशिकाएं मौजूद होनी चाहिए और कोई ई.कोलाई सेल या डडेलोप्लास्ट दिखाई नहीं नी चाहिए।50 मिलीलीटर शंकु नली में 0.45 माइक्रोमीटर पोर आकार फिल्टर के माध्यम से बी बैक्टीरियोवरस संस्कृति को तनाव दें और एक अपकेंद्रित्र में फिलट्रेट को निलंबित करें। फिर कैल्शियम हिप्पी बफर के तीन मिलीलीटर में बी बैक्टीरियोवोरस गोली को लगभग 0.2 के 600 नैनोमीटर पर अंतिम ऑप्टिकल घनत्व में फिर से निलंबित करें और बैक्टीरिया को 30 डिग्री सेल्सियस और 200 क्रांतियों प्रति मिनट 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। मेजबान कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, ब्याज के मेजबान तनाव से एक ही कॉलोनी का चयन करें और 37 डिग्री सेल्सियस और प्रति मिनट 180 क्रांतियों पर एक रात के इनक्यूबेशन के लिए आवश्यक के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक वाईटी माध्यम के 10 मिलीलीटर में बैक्टीरिया को नोड्यूलेट करने के लिए।अगली सुबह रातोंरात संस्कृति के दो मिलीलीटर को दो मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें और अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को गोली दें। फिर कैल्शियम हिप्पी बफर के 200 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि शिकार सेल एकल कोशिका के स्तर पर अलग हो रहे हैं, अपकेंद्रित्र के बाद पूरे सेल गोली को पूरी तरह से निलंबित करना बहुत महत्वपूर्ण है।समय-चूक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, सबसे पहले, कैल्शियम हिप्पी बफर के 20 मिलीलीटर के साथ कम फ्लोरोसेंट आणविक ग्रेड एगर उठे के 200 मिलीग्राम मिश्रण और एक माइक्रोवेव में agarose भंग। पिघले हुए एगिलिटर के तीन मिलीलीटर डालो एक 35 मिलीमीटर ग्लास नीचे पकवान में उठी और agarose जमना करने के लिए अनुमति देते हैं। एक प्रयोगशाला माइक्रो स्पैटुला का उपयोग करके, पैड के केंद्र ध्रुव को परेशान किए बिना डिश से एग्राजिंग पैड को ध्यान से हटा दें और पैड को पेट्री डिश कवर पर नीचे की ओर रखें।फ़्लिप किए गए पैड पर केंद्रित मेजबान सेल निलंबन के पांच माइक्रोलीटर रखें और केंद्र ध्रुव में कोशिकाओं को फैलाने के लिए एक टीका लूप का उपयोग करें। इसके बाद मेजबान सेल कोटेड सतह पर केंद्रित बी बैक्टीरियोवरस निलंबन के पांच माइक्रोलीटर को फैलने के बिना जोड़ें और जल्दी से जेल को 35 मिलीलीटर ग्लास बॉटम डिश टॉप साइड में वापस करें। इसके बाद डिश को ढक्कन से ढक दें।सह-संस्कृति के समय-चूक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए, पकवान को पेट्री डिश धारक में रखें ताकि पकवान प्रयोग के दौरान आगे न बढ़ें और उल्टे माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद और पकवान के तल पर एक बूंद रखें। उल्टे माइक्रोस्कोप कक्ष के भीतर माइक्रोस्कोप चरण पर और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में धारक माउंट 100X और पॉलीक्रोम लेंस के लिए GFP और Mcherry के लिए आवर्धन सेट । ब्राइटफील्ड में आईपीएस का उपयोग करके, फोकल प्लेन का पता लगाएं और व्यर्थ प्रबंधक खोलें।मंच को स्थानांतरित करें और ब्याज के कम से कम 10 पदों के निर्देशांक को स्टोर करने के लिए मार्क पॉइंट्स बटन का उपयोग करें। कैमरा वैल को आईपीएस से मॉनीटर पर स्विच करें। फोकल प्लेन सेट करें और प्रत्येक बिंदु को जांचने के लिए प्रबंधक के लिए व्यर्थ में रिप्लेस पॉइंट बटन पर क्लिक करें।प्रयोग डिजाइनर और अचिह्न रोग स्टैकिंग बॉक्स खोलें। उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनलों और इष्टतम उन्मूलन सेटिंग्स का चयन करें और छवि अधिग्रहण और प्रयोग के कुल समय के बीच अंतराल निर्धारित करें। चुनी हुई स्थितियों के लिए फोकस रखरखाव सक्षम करें और डेटा फ़ोल्डर का चयन करें जिसमें छवि फ़ाइलों को स्वचालित रूप से सहेजा जाना चाहिए।माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर कंट्रोल में सभी सेटिंग्स को फिर से चेक करें और टाइम-लैप्स एक्सपेरिमेंट शुरू करें। प्रयोग के पहले घंटे के बाद, जांच करें कि सभी चरण की स्थिति अभी भी ध्यान में है। जब समय-चूक प्रयोग समाप्त हो जाता है, तो पेट्री डिश को हटा दें और उपयुक्त जैव-सुरक्षा प्रोटोकॉल के अनुसार 35 मिलीमीटर डिश को एग्रामिंग पैड के साथ त्याग दें।समय-चूक छवि डेटा के प्रसंस्करण के लिए, प्रयोगात्मक डेटा को फिजी सॉफ्टवेयर से भरे कंप्यूटर में स्थानांतरित करें और फिजी में एक छवि खोलें। जैव-प्रारूपों में आयात विकल्प, हाइपरस्टैक के साथ व्यू स्टैक का चयन करें। कंपोजिट कलर मोड में, ऑटो स्केल का चयन करें।छवि के ढेर के माध्यम से स्क्रॉल करके यह आकलन करें कि क्या कोशिकाएं और bdelloplasts प्रयोग के दौरान ध्यान केंद्रित कर रहे थे। क्या डीएनए और एमनेन ग्रीन से हरे फ्लोरोसेंट धब्बे विकास चरण के दौरान bdelloplasts के अंदर B.bacteriovorus कोशिकाओं के भीतर मौजूद हैं और क्या शिकारी जीवन चक्र के चरणों के सभी कल्पना की जा सकती है । किसी विशेष बी बैक्टीरियोवरस सेल बडेलोप्लास्ट का विश्लेषण करने के लिए, ब्याज की कोशिका को चिह्नित करने के लिए एक चयन उपकरण का उपयोग करें।फिर चुने हुए क्षेत्र को डुप्लिकेट करें। डुप्लिकेट इमेज में, प्रक्रिया और चिकनी पर क्लिक करें और प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए, छवि, रंग, चैनल टूल पर क्लिक करें, और रुचि के चैनल का चयन करें। फिर प्रत्येक चैनल में छवि की चमक और विपरीत को समायोजित करने के लिए छवि पर क्लिक करें, समायोजित करें, और चमक विपरीत।स्केल बार जोड़ने के लिए, विश्लेषण, उपकरण और स्केल बार चुनें। छवियों में एक टाइमस्टैंप जोड़ने के लिए, छवियों, ढेर और टाइम स्टैम्पर पर क्लिक करें। संशोधित छवियों को सहेजने के लिए, टीआईएफ का चयन करें।डेटा को इमेज सीक्वेंस के रूप में सहेजने के लिए, वर्तमान फ्रेम की एक छवि को बचाने के लिए AVI एक फिल्म, या पीएनजी का उत्पादन करने के लिए। इस समय-चूक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित प्रणाली व्यक्तिगत बी बैक्टीरियोवरस कोशिकाओं की वास्तविक समय ट्रैकिंग की अनुमति देता है और जटिल शिकारी जीवनचक्र के प्रत्येक चरण के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है । पिल्सी रीचेरी फ्यूजन पूरे शिकारी कोशिका को हमले के चरण के साथ-साथ विकास चरण के प्रारंभिक चरण में लेबल करने में सक्षम बनाता है।हमले से प्रतिकृति चरण में संक्रमण को न केवल मेजबान ब्लाडेलोप्लास्ट गठन द्वारा बल्कि रिपलिसोम की उपस्थिति से भी कल्पना की जा सकती है। रिपलिसोम को हमलावर सेल पोल पर इकट्ठा किया जाता है और प्रजनन चरण की प्रगति के रूप में बढ़ते बी बैक्टीरियोवरस फिलामेंट के भीतर एक से अधिक प्रतिशोध देखा जा सकता है। गुणसूत्र की कई प्रतियां संश्लेषित होने के बाद, प्रतिकृति समाप्त हो जाती है।अंत में, बहुनीय फिलामेंट सेप्टेशन से गुजरते हैं और संतान कोशिकाओं को ब्लाडेलोप्लास्ट से छोड़ा जाता है। बी बैक्टीरियोवरस कोशिकाओं को सक्रिय रूप से अपने शिकार के लिए खोज करने के लिए पर्याप्त सामग्री होनी चाहिए और पूरे सेल घनत्व शिकारी सेल लगाव की अनुमति के लिए पर्याप्त उच्च होना चाहिए। यह मंच बहु-दवा प्रतिरोधी रोगजनकों से जुड़े प्रयोगों में उपयोगी हो सकता है और मानव और पशु चिकित्सा में जीवित एंटीबायोटिक के रूप में बी बैक्टीरियोवरस की जेनेटिक इंजीनियरिंग में सुधार की सुविधा प्रदान करने के लिए हो सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Actin Disassembly निगरानी समय चूक माइक्रोस्कोपी के साथ

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

SiRNA अभिकर्मक के बाद समय चूक सूत्रीविभाजन की इमेजिंग

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

समय चूक प्रारंभिक Embryogenesis में माइक्रोस्कोपी Caenorhabditis एलिगेंस

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

विखंडन खमीर के मात्रात्मक लाइव सेल विश्लेषण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग कक्ष रैंडम प्रवासन के मात्रात्मक विश्लेषण

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

नवोदित खमीर की प्रतिदीप्ति समय चूक सिनेमा हासिल करना और grafts का उपयोग कर एकल सेल गतिशीलता का विश्लेषण

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Sox10 में Craniofacial विकास के दृश्य: Kaede ट्रांसजेनिक Zebrafish रेखा समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के Vivo 4 आयामी ट्रैकिंग में

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

3 डी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर वायरल प्रतिलेखन कारखानों के कार्यात्मक इमेजिंग

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

Intravital समय चूक इमेजिंग के लिए बढ़ते Arabidopsis पत्तियों के लिए एक बहुमुखी विधि

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...