Name: live-cell imaging of the life cycle of bacterial predator bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-05-08T14:00:00
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この研究は、国立科学センターの助成金Opusによってサポートされました 2018/29/B/NZ6/00539 J.Z.C.

1. 微視的分析のための B.バクテリオボルス リセートの調製
<ol><li>250 mL フラスコに、新鮮な 24 時間 B. バクテリオボルス 培養液の 1 mL を組み合わせて共培養を設定します( HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry)および3mLの一晩の獲物培養物(例えば、 大腸菌 S17-1 pZMR100)と50 mLのCa-HEPESバッファー(25 mM HEPES、2 mM CaCl2[pH = 7.6])が必要な場合に抗生物質を補った(ここでは50μg/mcml)。</l...

<ol>
	<li>Shatzkes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predatory+Bacteria+Attenuate+Klebsiella+pneumoniae+Burden+in+Rat+Lungs.">Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs.</a> mBio. 7 (6), (2016).</li><li>Iebba, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bdellovibrio+bacteriovorus+directly+attacks+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+Cystic+fibrosis+isolates.">Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 5, (2014).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injections+of+Predatory+Bacteria+Work+Alongside+Host+Immune+Cells+to+Treat+Shigella+Infection+in+Zebrafish+Larvae.">Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae.</a> Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).</li><li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+flagellar+filament+and+the+role+of+motility+in+bacterial+prey-penetration+by+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).</li><li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predatory+Patchwork:+Membrane+and+Surface+Structures+of+Bdellovibrio+bacteriovorus.">A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).</li><li>Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Chromosomal+Replication+in+Predatory+Bacterium+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1898 (2016).</li><li>Makowski, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Chromosome+Replication+and+Its+Relationship+to+Predatory+Attack+Lifestyles+in+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).</li><li>Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shadowing+the+actions+of+a+predator:+backlit+fluorescent+microscopy+reveals+synchronous+nonbinary+septation+of+predatory+Bdellovibrio+inside+prey+and+exit+through+discrete+bdelloplast+pores.">Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores.</a> Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).</li><li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+D-amino-acids+reveal+bi-cellular+cell+wall+modifications+important+for+Bdellovibrio+bacteriovorus+predation.">Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation.</a> Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).</li><li>Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predation+of+human+pathogens+by+the+predatory+bacteria+Micavibrio+aeruginosavorus+and+Bdellovibrio+bacteriovorus.">Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).</li></ol>

生きた抗生物質として B.バクテリオボルス を使用することに対する関心の高まりにより、捕食性のライフサイクル、特に捕食者と病原体の相互作用を観察するための新しいツールが必要です。提示されたプロトコルは 、B.バクテリオボルス のライフサイクル全体を、特にホスト内での成長中にリアルタイムで追跡するために使用されます。さらに、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素?...

Bdellovibrio bacteriovorusは、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シゲラ・フレックスネリ11,2,32,3などの有害な病原体を含む他のグラム陰性細菌を捕食する小さな(0.3-0.5 μm by 0.5-1.4 μm)グラム陰性細菌である。B.バクテリオボルスは病原体を殺すので、細菌感染症、特に多剤耐性株によって引き起こされる細菌感染と戦うために適用できる潜在的な生きている抗生物質と考えられている。
B. バクテリオボルスは、自由に生きている非複製的攻撃期と細胞内生殖期の2つの段階からなる独特のライフサイクルを示す(図1)。自由な生活段階では、最大160μm/sの速度で移動するこの高い運動性細菌は、獲物を探します。獲物の外膜に付着した後、それは、ペリプラズム44、5に入る。B.バクテリオボルスは、子宮間生殖段階で、多量の加水分解酵素を使用して宿主の高分子を分解し、それ自身の成長のために再利用する。ペリプラズムを侵略した直後、宿主細胞は死んで膨満感を放ち、その中に捕食細胞が伸び、染色体を複製する球形の構造である。複製処理は複製元(oriC)6から始まり、染色体のコピーが完全に合成されるまで続行します 7.興味深いことに、各染色体の複製は細胞分裂に続かない。代わりに、捕食者は、長い、多核及び糸状細胞を形成するために伸びる。栄養が枯渇すると、フィラメントは同期的な敗血症を受け、子孫細胞はbdelloplast8から放出される。
B.バクテリオボルスが細菌感染症に対する生きた抗生物質として使用される前に、そのライフサイクルの主要な段階、特に獲物内の増殖に関連するものを理解することが重要である。B.バクテリオボルスの生細胞イメージングは、複雑なライフサイクルの間に捕食者とその獲物の様々な形態学的形態のために困難であった。これまで、B.バクテリオボルスとその宿主細胞との相互作用は、主に電子顕微鏡法とスナップショット分析22、9、109,10によって研究されてきたが、これらは、特に捕食期の連続した段階を監視するために使用される場合、両方に限界がある。これらの方法は、B.バクテリオボルス細胞の高解像度画像を提供し、攻撃または成長段階で小さな捕食者の観察を可能にする。しかし、それらは両方のライフサイクル段階を通して単一のB.バクテリオボルス細胞の追跡を許可しません。
ここで提示されるのは、B. バクテリオボルスの完全なライフサイクルを監視するために、タイムラプス蛍光顕微鏡(TLFM)を使用するための包括的なプロトコルです。アガロースパッドからなるシステムは、細胞イメージング皿と組み合わせて使用され、捕食細胞がアガロースパッドの下を自由に移動し、固定化された獲物細胞がbdelloplastsを形成することができる(図2)。このセットアップは、 大腸菌 と B.バクテリオボルスの両方の特定の株に基づいて調製されますが、プロトコルはユーザーの個々の株に合わせて簡単に変更することができます(例えば、異なる選択マーカーを運ぶ、異なるフルオロフォアと融合したタンパク質など)。
この場合、攻撃段階中に B.バクテリオボルス を可視化するために、細胞質タンパク質の蛍光タグ付きバージョンであるPilZ(要求に応じて入手可能)を発現する特定の株(HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry)を構築した。この株は、さらにDnaN(βスライディングクランプ)、DNAポリメラーゼIIIホロエンザイムのサブユニットを、蛍光タンパク質と融合して生成する。これにより、連続的なDNA複製を、bdelloplasts内で増殖する捕食細胞内で監視することができます。
画像取得に使用されるプロトコルおよびソフトウェアは、特定の製造業者が提供する反転顕微鏡を指しますが( 材料表を参照)、この技術は、環境室または他の外部加熱ホルダを備え、タイムラプスイメージングが可能な任意の反転顕微鏡に対して調整することができます。データ分析のために、ユーザーは個々の出力形式と互換性のある利用可能なソフトウェアを選択することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig01.jpg"> 図 1:B.バクテリオボルス のライフサイクルを宿主細胞として 大腸菌 で行う。攻撃段階では、自由に泳ぐ B.バクテリオボルス 細胞が宿主 大腸菌 細胞を探し、付着する。侵入後、捕食細胞は獲物の周囲に局在し、宿主細胞の形状を変化させ、bdelloplastを形成する。生殖段階は、ブデロプラススト形成から始まる。捕食細胞は獲物細胞を消化し、単純な化合物を再利用して独自の構造を構築します。 B. バクテリオボルス は、宿主のペリプラズム内の長い単一のフィラメントとして成長する。獲物細胞の資源が枯渇すると 、B.バクテリオボルス フィラメントは同期的に敗血を起させ、前立腺細胞を形成する。子孫の細胞が彼らの旗エラを発達した後、彼らは腺芽細胞をライスする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MPW MED. INSTRUMENTS</td>
			<td>MPW-260R</td>
			<td>Rotor ref. 12183</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CertifiedMolecular Biology Agarose</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td>Open source image processing package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dish 35 mm</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81218-200</td>
			<td>uncoated glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>GE</td>
			<td>DeltaVision Elite</td>
			<td>Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16555----------K</td>
			<td>Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Start SoftWoRx</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td>Manufacturer-supplied imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of the life cycle of bacterial predator bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy

Bdellovibrio細菌は 、有害な病原体を含む他のグラム陰性細菌を殺す小さなグラム陰性、義務的な捕食細菌である。したがって、生きた抗生物質と考えられる。 B.バクテリオボルス を生きた抗生物質として適用するには、まず、その複雑なライフサイクルの主要な段階、特に獲物内での増殖を理解する必要があります。これまでのところ、捕食ライフサイクルの連続した段階をリアルタイムで監視することは困難でした。ここで提示されるB. バクテリオボルスの完全なライフサイクルのリアルタイムイメージングのための包括的なプロトコルは、特にホスト内での成長の間である。この目的のために、アガロースパッドからなるシステムは、捕食細胞がアガロースパッドの下を自由に移動し、固定化された獲物細胞がbdelloplastsを形成することができる細胞イメージング皿と組み合わせて使用される。DNAポリメラーゼIIIの蛍光タグ付きβサブユニットを産生する株の適用により 、B.バクテリオボルス のライフサイクルの再生段階で染色体複製を監視することがさらに可能になります。

記載されたTLFM系システムは、B.バクテリオボルスの個々の細胞を時間で追跡することを可能にし(図3、Movie 1)、複雑な捕食ライフサイクルの各段階に関する貴重な情報を提供する。PilZ-mCherry融合により、捕食細胞全体を攻撃段階および成長段階の初期段階で標識することができます(図3)。攻撃から複製段階への移行は、宿主のbdel...

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Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

ここで提示されるのは、アガロースパッドおよび細胞イメージングディッシュと組み合わせて、タイムラプス蛍光顕微鏡を使用した捕食細菌 Bdellovibrioバクテリオボルス の完全なライフサイクルのモニタリングを記述するプロトコルです。

タイムラプス蛍光顕微鏡を用いた細菌プレデター ブレロビトリオバクテリオボルス のライフサイクルの生細胞イメージング

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

ライブセルブレロビブリオバクテリオボルスイメージングは、これらの捕食細菌の複雑なライフサイクルのために挑戦されています。当社のプロトコルは、完全なライフサイクルの段階をリアルタイムで監視することを可能にします。我々のプロトコルは特定のイコライゼーション株に基づいているが、病原性株を含む様々な細菌株に容易に適応することができる。B.bacteriovorus培養を設定するには、必要に応じて抗生物質を添加した50ミリリットルのヒッピーバッファーを含む250ミリリットルフラスコで、新鮮な24時間培養細菌の1ミリリットルと一晩の獲物培養の3ミリリットルを組み合わせます。摂氏30度で24時間、毎分200回転でインキュベーションした後、獲物細胞が液体に取り付けられた顔コントラスト顕微鏡によって完全に取り付けられていることを確認してください。多数の多重攻撃段階的B.バクテリオボルス細胞が存在し、大腸菌細胞またはbdelloplastが見えるべきではない。B.bacteriovorus培養液を0.45マイクロメートルの孔径フィルターを通して50ミリリットルの円錐形チューブにひずみ、遠心分離機で濾液を下に吊り下げる。その後、カルシウムヒッピーのバッファーの3ミリリットルでB.bacteriovorusペレットを約0.2の600ナノメートルで最終的な光学密度に再中断し、30°Cで細菌をインキュベートし、毎分200回転で30分間インキュベートします。宿主細胞を調製するには、目的の宿主株から単一のコロニーを選択し、37°Cで一晩インキュベーションのために必要に応じて抗生物質を添加したYT培地の10ミリリットルの細菌を1分あたり37度および180回転で結節する。翌朝、一晩培養した2ミリリットルを2ミリリットルの試験管に移し、遠心分離によって細胞をペレット化する。その後、200マイクロリットルのカルシウムヒッピーバッファーにペレットを再中断します。遠心分離後に細胞ペレット全体を完全に再中断し、獲物細胞が単一細胞レベルで分離されていることを確認することが非常に重要です。蛍光顕微鏡のタイムラプスのために細胞を調製するには、まず、低蛍光分子グレードのアガロース200ミリグラムとヒッピーの20ミリリットルを混合し、電子レンジにアガロースを溶解します。溶かしたアガロースを35ミリメートルのガラス底皿に3ミリリットル注ぎ、アガロースを固める。実験室用のマイクロスパチュラを使用して、パッドの中央のポールを邪魔することなく、皿からアガロースパッドを慎重に取り出し、ペトリ皿カバーの上にパッドの底側を置きます。濃縮された宿主細胞懸濁液の5マイクロリットルを反転したパッドに置き、接種ループを使用して中央極の細胞を広げます。次に、濃縮されたB.bacteriovorus懸濁液を広げることなく宿主細胞コーティングされた表面に5マイクロリットルを加え、35ミリリットルガラス底皿の上面にゲルを素早く戻します。その後、蓋で皿を覆います。コカルチャーのタイムラプスフロリセンス顕微鏡の場合は、皿が実験の過程で動かないようにペトリ皿ホルダーに皿を置き、逆顕微鏡の目的に浸漬油を1滴、皿の底に1滴置きます。ホルダーを逆顕微鏡室内の顕微鏡ステージに取り付け、顕微鏡ソフトウェアでは倍率を100Xに、ポリクロームレンズをGFPとMcherryに設定します。ブライトフィールドでiPSを使用して、焦点面を見つけて無意味なマネージャを開きます。ステージを移動し、マーク ポイント ボタンを使用して、少なくとも 10 の位置の座標を格納します。カメラのバルをiPSからモニタに切り替えます。焦点面を設定し、各ポイントを調整するマネージャに無意味でポイントを置き換えるボタンをクリックします。実験デザイナーを開き、病気のスタッキング ボックスのマークを解除します。適切な蛍光チャネルと最適な除去設定を選択し、画像の取得と実験の合計時間の間隔を設定します。選択した位置のフォーカスメンテナンスを有効にし、画像ファイルを自動的に保存するデータフォルダを選択します。顕微鏡ソフトウェアコントロールのすべての設定を再確認し、タイムラプス実験を開始します。実験の最初の1時間後、すべてのステージ位置が依然として焦点を合わせているか確認してください。タイムラプス実験が終了したら、ペトリ皿を取り出し、適切なバイオセーフティプロトコルに従ってアガロースパッドで35ミリメートル皿を捨てます。タイムラプス画像データの処理のために、フィジーのソフトウェアを搭載したコンピュータに実験データを転送し、フィジーで画像を開きます。バイオフォーマットインポートオプションで、ハイパースタックを使用してビュースタックを選択します。コンポジット カラー モードで、自動スケールを選択します。画像スタックをスクロールすることで、細胞とbdelloplastsが実験の過程で焦点を当て続けたかどうかを評価します。DNAとmNeon緑色の緑色のスポットが、成長期を通じてB.bacteriovorus細胞内に存在するかどうか、および捕食ライフサイクルのすべての段階を視覚化できるかどうか。特定のB.バクテリオボルス細胞bdelloplastを分析するには、選択ツールを使用して対象セルをマークします。次に、選択したリージョンを複製します。複製された画像で、プロセスをクリックして滑らかにし、各蛍光チャネルについて、画像、色、チャンネルツールをクリックし、対象のチャンネルを選択します。次に、画像、調整、明るさのコントラストをクリックして、各チャンネルの画像の明るさとコントラストを調整します。縮尺バーを追加するには、分析、ツール、スケール バーを選択します。画像にタイムスタンプを追加するには、画像、スタック、および時間のスタンパーをクリックします。変更した画像を保存するには、[TIF] を選択します。データをイメージ シーケンスとして保存するには、AVI を使用してムービーを作成し、現在のフレームのイメージを 1 つ保存する PNG を作成します。このタイムラプス蛍光顕微鏡システムは、個々のB.バクテリオボルス細胞のリアルタイム追跡を可能にし、複雑な捕食ライフサイクルの各段階に関する貴重な情報を提供します。錠剤mCherry融合は、捕食細胞全体を攻撃段階および成長段階の初期段階で標識することを可能にする。攻撃から複製フェーズへの移行は、ホストのbdelloplast形成だけでなく、replisomeの外観によっても視覚化できます。このレプレッサムは、侵入した細胞極で組み立てられ、再生相が進行するにつれて、成長するB.bacteriovorusフィラメント内で複数の応答体が観察される。染色体のコピーが複数合成された後、複製は終了する。最後に、多核化フィラメントはセプテレーションを受け、子孫細胞はbdelloplastから放出される。B.bacteriovorus細胞は積極的に獲物を探索するのに十分な材料である必要があり、細胞密度全体が捕食細胞の付着を可能にするのに十分高いはずです。このプラットフォームは、多剤耐性病原体を含む実験に有用であり、ヒトおよび獣医学における生きている抗生物質としてのB.bacteriovorusの遺伝子工学の改善を促進するために有用である可能性がある。

Research

JoVE Journal

Biology

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