Name: evaluation of oxidative stress in biological samples using the thiobarbituric acid reactive substances assay
Uploaded: 2020-05-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay at JoVE.com

המחקר שדווח כאן נתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס לא. R33 CA217702 והיוזמה למיקסום תוכנית פיתוח התלמידים (IMSD). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפה הרשמית של המכונים הלאומיים לבריאות.

דגימות סרום אנושי התקבלו ממתנדבים בהסכמה באישור IRB ובהתאם לעקרונות שבאו לידי ביטוי בהצהרת הלסינקי. דגימות קודדו ולא זוהו לפני המעבר למעבדה האנליטית.
1. הכנת מדגם
<ol><li>תפילת תאים HepG2
	<ol>
<li>זרע על 10 x 106 HepG2 תאים לכל בקבוקון ב 16 T75 צלוחיות עם 14 מ"ל של מדיה EMEM בתוספת 10...

<ol>
	<li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lipid+peroxidation+by+measuring+malondialdehyde+(MDA)+and+relatives+in+biological+samples:+Analytical+and+biological+challenges.">Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges.</a> Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).</li><li>Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+of+linoleic+acid+hydroperoxide+with+thiobarbituric+acid.">Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid.</a> Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoid+Using+Spectrophotometric+Determination+of+Malondialdehyde+as+a+Biomarker+of+Oxidative+Stress.">Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress.</a> Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).</li><li>Morales, M., Munn&#233;-Bosch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malondialdehyde:+Facts+and+artifacts.">Malondialdehyde: Facts and artifacts.</a> Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).</li><li>Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+estimating+lipid+peroxidation:+An+analysis+of+merits+and+demerits.">Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits.</a> Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).</li><li>Dasgupta, A., Klein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Measuring+Oxidative+Stress+in+the+Laboratory.">Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory.</a> Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).</li><li>Wade, C. R., van Rij, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+malondialdehyde,+lipid+peroxides,+and+the+thiobarbituric+acid+reaction.">Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction.</a> Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+malondialdehyde+as+a+biomarker+of+oxidative+stress+in+psychological+disorders.">Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders.</a> BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+Concerning+"Comparison+of+Airway+and+Systemic+Malondialdehyde+Levels+for+Assessment+of+Oxidative+Stress+in+Cystic+Fibrosis".">Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis".</a> Lung. 193 (5), 867-868 (2015).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+"Salivary+8-hydroxy-2-deoxyguanosine,+malondialdehyde,+vitamin+C,+and+vitamin+E+in+oral+pre-cancer+and+cancer:+diagnostic+value+and+free+radical+mechanism+of+action".">Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action".</a> Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+"An+Investigation+into+the+Serum+Thioredoxin+Superoxide+Dismutase,+Malondialdehyde,+and+Advanced+Oxidation+Protein+Products+in+Patients+with+Breast+Cancer".">Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer".</a> Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).</li><li>Azizi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+analytical+procedures+on+the+repeatability+of+malondialdehyde+determinations+in+biological+samples.">Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples.</a> Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).</li><li>Azizi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+reason+for+the+low+reproducibility+of+malondialdehyde+determinations+in+biological+samples.">A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples.</a> Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).</li><li>Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+steps+in+fluorometric+determination+of+thiobarbituric+acid-+reactive+substances+in+serum:+Importance+of+extraction+pH+and+influence+of+sample+preservation+and+storage.">Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage.</a> Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).</li><li>Jentzsch, A. M., Bachmann, H., F&#252;rst, P., Biesalski, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+of+malondialdehyde+in+human+body+fluids.">Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids.</a> Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).</li><li>Buege, J. A., Aust, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsomal+lipid+peroxidation.">Microsomal lipid peroxidation.</a> Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).</li><li>Gutteridge, J. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-Radical+Damage+to+Lipids,+Amino-Acids,+Carbohydrates+and+Nucleic-Acids+Determined+by+Thiobarbituric+Acid+Reactivity.">Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity.</a> International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+malondialdehyde+as+an+oxidative+stress+biomarker+in+oral+and+systemic+diseases.">Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases.</a> J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+How+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Lee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+oxidative+stress+in+human+cardiovascular+disease:+methodological+aspects+and+considerations.">Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations.</a> Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).</li><li>Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+lipoprotein+cytotoxicity+induced+by+free+radical+peroxidation+of+lipid.">Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid.</a> Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).</li><li>Guzm&#225;n-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guill&#233;n-Sans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-thiobarbituric+acid+test+for+lipid+oxidation+in+food:+Synthesis+and+spectroscopic+study+of+2-thiobarbituric+acid-malonaldehyde+adduct.">2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct.</a> Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).</li><li>Shibata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+lipid+peroxidation+product+as+a+potential+trigger+of+the+p53+pathway.">Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).</li><li>Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling,+standardization,+and+calibration.">Sampling, standardization, and calibration.</a> Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , 153-196 (2014).</li><li>Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , 1-24 (2007).</li><li>Seibig, S., Van Eldik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+[FeII(edta)]+Oxidation+by+Molecular+Oxygen+Revisited.+New+Evidence+for+a+Multistep+Mechanism.">Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism.</a> Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).</li><li>Jeffs, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delta-S-Cys-Albumin:+A+Lab+Test+that+Quantifies+Cumulative+Exposure+of+Archived+Human+Blood+Plasma+and+Serum+Samples+to+Thawed+Conditions.">Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).</li><li>Yagi, K., Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Assay+for+the+Level+of+Total+Lipid+Peroxides+in+Serum+or+Plasma.">Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma.</a> Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. , 101-106 (1998).</li><li>Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+thiobarbituric+acid+and+the+oxidation+products+of+certain+lipides.">The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides.</a> Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).</li><li>Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiobarbituric+acid+reagent+as+a+test+for+the+oxidation+of+unsaturated+fatty+acids+by+various+agents.">The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents.</a> Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).</li><li>Kwon, T. W., Watts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+malonaldehyde+by+ultraviolet+spectrophotometry.">Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry.</a> Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).</li><li>Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biochemistry+of+4-hydroxynonenal,+malonaldehyde+and+related+aldehydes.">Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).</li><li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease.">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).</li><li>Jentzsch, A. M., Bachmann, H., F&#252;rst, P., Biesalski, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+of+malondialdehyde+in+human+body+fluids.">Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids.</a> Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).</li><li>Jo, C., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Analysis+of+2-Thiobarbituric+Acid+Reactive+Substances+in+Turkey.">Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey.</a> Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).</li><li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+validation+and+biomedical+applications+of+stable-isotope+dilution+GC-MS+and+GC-MS/MS+techniques+for+circulating+malondialdehyde+(MDA)+after+pentafluorobenzyl+bromide+derivatization:+MDA+as+a+biomarker+of+oxidative+stress+and+its+relation+to+15(S)-8-iso-prostaglandin+F2&#945;+and+nitric+oxide+(NO).">Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2&#945; and nitric oxide (NO).</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).</li><li>Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+artifactual+elevation+of+lipid+peroxidation+products+(F+2-isoprostanes)+in+plasma+during+collection+and+storage.">Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage.</a> Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).</li><li>Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+instability+of+glycated+albumin:+A+role+for+autoxidative+glycation.">Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).</li><li>Lee, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malondialdehyde+in+Stored+Plasma.">Malondialdehyde in Stored Plasma.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).</li><li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+GC-MS/MS+measurement+of+malondialdehyde+and+4-hydroxy-2-nonenal+in+human+plasma:+Effects+of+long-term+L-arginine+administration.">Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration.</a> Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).</li></ol>

למרות מגבלותיו1,3,4,7,8,10,12,13,14,15,19 וחוסר התאמה להשוואה בין מעבדות, מתקן TBARS הוא אחד הוותיקים ביותר <sup ...

peroxidation השומנים הוא תהליך שבו רדיקלים חופשיים, כגון מינים חמצן תגובתי ומינים חנקן תגובתי, לתקוף קשרים כפולים פחמן פחמן שומנים, תהליך הכולל הפשטה של מימן מפחמן והכנסת מולקולת חמצן. תהליך זה מוביל לתערובת של מוצרים מורכבים כולל, רדיקלים פרוקסיל שומנים, הידרופרוקסידים כמוצרים העיקריים, כמו גם malondialdehyde (מד"א) ו 4-hydroxynonenal כמוצרים משניים השולטים1.
מד"א נמצא בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כסמן של פרוקסידציה שומנית בשל תגובתו הקלינית עם חומצה תיוברביטורית (TBA). התגובה מובילה להיווצרות מד"א-TBA2, מצומדת הנקלטת בספקטרום הנראה ב-532 ננומטר ומייצרת צבע אדום-ורוד2. מולקולות אחרות המופקות מפרוקסידציה שומנית מלבד מד"א יכולות להגיב גם הן עם TBA ולספוג אור במהירות של 532 ננומטר, מה שתורם לאות הקליטה הכולל הנמדד. באופן דומה, מד"א יכול להגיב עם רוב המעמדות העיקריים האחרים של ביומולקולים, מה שעלול להגביל את הנגישות שלו לתגובה עם TBA3,4. ככזה, זה בדיקת מסורתית נחשב פשוט למדוד "חומרים תגובתי חומצה thiobarbituric" או TBARS5.
כאשר מיושם כראוי ופרש, TBARS assay נחשב בדרך כלל אינדיקטור טוב של רמות הכולל של עקה חמצונית במדגם ביולוגי6. למרבה הצער, כפי שתועד על ידי Khoubnasabjafari ואחרים, TBARS בדיקות מתבצע לעתים קרובות ומתפרש בדרכים המאפשרות מסקנות מפוקפקות3,4,7,8,9,10,11. הסיבות לכך נעוצות בעיקר במשתנים טרום-אנליטיים הקשורים לדגימה ובהיעדר קשיחות של מטען האוסר על שינויים קלים לכאורה בפרוטוקול ההסתה ללא שינויים מהותיים בתוצאות ה-assay1,7,12,13.
משתנים preanalytical הקשורים biospecimen טיפול ואחסון (למשל, פלזמת דם נשמר באופן זמני ב -20 °C)14,15 יכול להיות בעל השפעה גדולה על תוצאות בדיקת TBARS16,17; עד כדי כך, כי תוצאות TBARS בוחן אין להשוות על פני מעבדות שונות אלא אם כן מוצדק על ידי נתוני אימות אנליטיים interlaboratory מפורשים. המלצה זו דומה לאופן שבו נפוץ להשתמש בכתמים מערביים ולפרש. השוואות של צפיפות רצועות תקפות למחקרים בתוך כתם ואולי בתוך המעבדה, אבל השוואת צפיפות הרצועה בין מעבדות נחשבת בדרך כלל פרקטיקה לא חוקית.
כמה חוקרים הציעו כי מד"א כפי שנמדד על ידי TBARS בחינה פשוט לא עונה על הקריטריונים האנליטיים או הקליניים הנדרשים של סמן ביולוגי מקובל3,9,10,18,19. ואכן, אם ההבחנה לא הייתה מפותחת לפני יותר מ -50 שנה, היא כנראה לא הייתה זוכה לשימוש הנרחב ולמקובלות שבשתהון שיש לה כיום. למרות שיש בדיקות אחרות עם רגישות אנליטית גדולה יותר, ספציפיות, ו מחוספס המשמש לקביעת עקה חמצונית, TBARS בדיקות המבוססות על ספיגה ב 532 ננומטר נשאר ללא ספק אחד בדיקות הנפוצות ביותר לקביעת peroxidation השומנים20, ובכך הערכה של עקה חמצונית.
ניתן למצוא את TBARS assay רק כערכה יקרה (מעל 400 דולר אמריקאי), שבה ההוראות אינן מספקות מידע מפורט על רוב הריכוזים של ריאגנטים בשימוש. בנוסף, ריאגנטים שסופקו יכולים לשמש רק לניסוי אחד, מכיוון שניתן לבצע רק עקומת תקן צבעונית אחת לכל ערכה. זה יכול להיות בעייתי עבור חוקרים שמתכוונים לקבוע רמות של חמצון בתוך כמה דגימות בנקודות זמן שונות, כי אותה עקומה סטנדרטית לא ניתן להשתמש במספר פעמים. לפיכך, ערכות מרובות יש לרכוש עבור ניסויים מרובים. נכון לעכשיו, אלא אם כן נרכשת ערכה יקרה, אין פרוטוקול מפורט זמין לביצוע בדיקות TBARS. כמה חוקרים בעבר תיארו במעורפל כיצד לבצע TBARS assay21,22, אבל לא פרוטוקול מפורט לחלוטין או וידאו מקיף על איך לנהל את TBARS בדיקה ללא ערכה יקרה זמין בספרות.
כאן אנו מדווחים על מתודולוגיה מפורטת, מאומתת אנליטית למטרה כיצד לבצע בדיקת TBARS בצורה פשוטה, ניתנת לשחזור וזולה. שינויים peroxidation השומנים של סרום אנושי, HepG2 ליסאטים, וליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה על הטיפול עם Cu(II) יונים מוצגים כיישומים להמחשה עבור בדיקת TBARS. התוצאות מראות כי ת.ב.ס.ק זה עקבי וזמין לשחזור על בסיס יומיומי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Sterile PBS pH 7.4 1 L</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>101642--262</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL self-standing centrifuge tube</td>
			<td>Corning, NY</td>
			<td>CLS430897</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA</td>
			<td>280895</td>
			<td>To measure absorbance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>LDL purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for glass tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA</td>
			<td>14-930-15D</td>
			<td>for TBARS assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper II Chloride</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>222011-250G</td>
			<td>to induce oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>for TBARS assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium (EMEM)</td>
			<td>ATCC, VA</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>HepG2 cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf, NY</td>
			<td>22363204</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Genesee Sceitific, CA</td>
			<td>22363352</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum US Source</td>
			<td>Omega Scientific, CA</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>27225-1L-R</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>87786</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td>LDL solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 Cells</td>
			<td>ATCC, VA</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Biological matrix prototype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legend Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>75002431</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Density Lipoprotein, Human Plasma</td>
			<td>Athens Research &#38; Technology, GA</td>
			<td>12-16-120412</td>
			<td>Biological matrix prototype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>58948-025</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>8207560250</td>
			<td>TBARS Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan Go Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>51119200</td>
			<td>To measure absorbance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>EMD Millipore Corp, MA</td>
			<td>492016-100ML</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>436143-100G</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>367176-2.5KG</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>SC250EXP</td>
			<td>For concentrating cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap</td>
			<td>USA Scientific, FL</td>
			<td>658175</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiobarbituric Acid</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>T5500-100G</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS base</td>
			<td>Fluka, GA</td>
			<td>93362</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1x)</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>16777-166</td>
			<td>To detach HepG2 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of oxidative stress in biological samples using the thiobarbituric acid reactive substances assay

למרות הספציפיות האנליטית המוגבלת שלה ואת המחוספס, החומרים תגובתי חומצה thiobarbituric (TBARS) בדיקה כבר בשימוש נרחב כמדד גנרי של peroxidation שומנים בדם בנוזלים ביולוגיים. זה נחשב לעתים קרובות אינדיקטור טוב של רמות של עקה חמצונית בתוך מדגם ביולוגי, בתנאי המדגם טופל כראוי מאוחסן. ההבחנה כוללת תגובה של מוצרי פרוקסידציה שומנים בדם, בעיקר malondialdehyde (מד"א), עם חומצה thiobarbituric (TBA), אשר מוביל להיווצרות של תוספים מד"א-TBA2 בשם TBARS. TBARS מניב צבע אדום-ורוד שניתן למדוד באופן ספקטרופוטומטרי ב- 532 ננומטר. בדיקת TBARS מתבצעת בתנאים חומציים (pH = 4) וב 95 °C (75 °F). מד"א טהור אינו יציב, אך תנאים אלה מאפשרים את שחרורו של מד"א מד"א (דימתיל אצטל), המשמש כסטנדרט אנליטי בשיטה זו. בדיקת TBARS היא שיטה פשוטה שניתן להשלים בכ 2 שעות. הכנת ריאגנטים של בדיקות מתוארים בפירוט כאן. חוקרים מודעים לתקציב יכולים להשתמש בריגנטים אלה לניסויים מרובים בעלות נמוכה במקום לקנות ערכת TBARS יקרה המאפשרת בניית עקומה סטנדרטית אחת בלבד (ולכן ניתן להשתמש בה רק לניסוי אחד). הישימות של בדיקת TBARS זו מוצגת בסרום אנושי, ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה, וליזאטים לתאים. ההסתה עקבית וניתן לשחזור, וניתן להגיע למגבלות הזיהוי של 1.1 מיקרומטר. המלצות לשימוש ופרשנות של בדיקת TBARS ספקטרופוטומטרית מסופקות.

בתנאים חומציים (pH = 4) וב 95 °C(5 °F), malondialdehyde (מד"א) ביס (דימתיל אצטל) מניב מד"א23. מד"א ומקורבים כימיים קשורים מגיבים עם שתי מולקולות של חומצה תיוברביטורית (TBA) כדי לייצר תרכובות הנקראות חומרים תגובתיים לחומצה תיוברביטורית (TBARS), המעניקות צבע אדום-ורוד ויש להן λmax סופג ב-532 ננומטר (...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay at JoVE.com

Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay

המטרה של חומרים תגובתיים חומצה thiobarbituric assay היא להעריך מתח חמצוני בדגימות ביולוגיות על ידי מדידת הייצור של מוצרי peroxidation השומנים, בעיקר malondialdehyde, באמצעות ספקטרופוטומטריית אורך גל גלוי ב 532 ננומטר. השיטה המתוארת כאן ניתן ליישם סרום אנושי, ליסאטים תאים, ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה.

הערכה של עקה חמצונית בדגימות ביולוגיות באמצעות חומצה Thiobarbituric חומרים תגובתיים אסייד

Despite its limited analytical specificity and ruggedness, the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay has been widely used as a generic ...

So the TBARS assay is best used for intra-laboratory general assessment of oxidative stress in biological samples, in which relative TBARS levels are directly compared between samples that were stored and processed together. These assay has an extremely low cost of about 3 for testing 96 samples compared to commercially available kits, which costs about 400, and permit only a single batch samples to be analyzed. The method described here can be further adapted for specific applications including biospecimens stability studies, and those for which the addition of antioxidants or other types of sample preservatives prior to analysis is appropriate or mandated.To avoid highly variable results, prepare fresh reagents, making sure that the pH is not greater than four for the color reagents and remove any bubbles in the nidese swell plate before measuring the absorbance. Begin by preparing a 0.8%aqueous solution of thiobarbituric acid. Prepare a five molar sodium hydroxide solution by dissolving four grams of sodium hydroxide beads in 20 milliliters of water.Store the solution in a plastic container. It should be freshly prepared for each batch. Add four grams of thiobarbituric acid to 450 milliliters of deionized water and use a magnetic stir bar to gently dissolve it.Slowly add approximately four milliliters of the sodium hydroxide solution in 100 microliter increments, checking the pH as the thiobarbituric acid particles dissolve. Continue adding the sodium hydroxide until all particles dissolve. Verify that the pH of the solution is no higher than four with a pH strip, then bring the final volume to 500 milliliters with deionized water and store the aqueous thiobarbituric barbaric acid solution at room temperature.Prepare MDA bis dimethyl acetal standard curve solutions in two milliliter snap cap polypropylene tubes. By diluting the 200 micromolar stock solution in water as described in the text manuscript. Vortex the samples.Label the glass tubes for the samples to be analyzed, then add 100 microliters of the prepared sample to each tube. Add 200 microliters of 8.1%SDS to each sample and gently swirl the glass tube in a circular motion to mix. Add 1.5 milliliters of 3.5 molar sodium acetate buffer to each sample, then add 1.5 milliliters of the aqueous 0.8%thiobarbituric acid solution.Bring the final in each tube to four milliliters by adding 700 microliters of deionized water. Tightly cap the glass tubes and incubate them in a heating block set to 95 degrees Celsius for one hour. Cover the tubes with aluminum foil to prevent condensation, then remove the tubes from the block and incubate them on ice for 30 minutes.After the incubation, centrifuge the samples and standards at 1, 500 times G for 10 minutes at four degrees Celsius. Transfer 150 microliters of supernatant from each tube to a well in a 96 well plate, removing any air bubbles with the pipette tip. Measure the absorbance of the samples at 532 nanometers, then subtract the average absorbent reading of the blank samples from all other absorbents readings.Create a standard curve and use it to calculate unknown sample concentrations. MDA bis dimethyl acetol standard curves were generated to determine the limits of detection and sensitivity of the assay and levels of oxidation in three different biological samples. A total of 9 TBARS assays were performed on the three samples on different days.To determine the limits of detection, absorbance of blank samples was measured on three different days. The minimum concentration of TBARS substance needed to give a detectable non noise absorbent signal is 1.1 micromolar. And the sensitivity of the assay is about 0.0016 absorbents units per micromolar increase in concentration.The TBARS assay can be used to detect changes in lipid peroxidation of various biological matrices. To demonstrate this copper two chloride was used to induce the invitro oxidation of human serum HEPG2 cell lysates and low density lipoproteins it. A TBARS assay was performed on LDL samples containing EDTA and the levels of TBARS did not change between the copper two treated and untreated LDL samples.However, after EDTA was removed by spin filtration, LDL underwent copper two mediated oxidation. To illustrate the dynamic range of the TBARS assay in human serum, a concentration of two millimolar copper two ions was added to the samples, which resulted in a six to seven fold increase in TBARS. When attempting this protocol, do not leave the samples on ice for longer than 10 minutes, and leave them at room temperature after centrifugation.For batches or subsets of biospecimens that were not originally collected, processed, and stored together, one should statistically evaluate the data for batch effects to ensure that artifactual oxidation did not contribute to the results. Intentional quantifiable invitro oxidation off low density lipoprotein makes it possible to understand how oxidation affects it's functioning biology.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

עיבוד חנקן סופר קריטי עבור הטיהור של חומרים נקבוביים ריאקטיבי

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Using Polystyrene-block-poly(acrylic acid)-coated Metal Nanoparticles as Monomers for Their Homo- and Co-polymerization

Using Polystyrene-block-polyacrylic acid-coated Metal Nanoparticles as Monomers for Their Homo- and Co-polymerization

באמצעות Polystyrene-<em&gt; בלוק</em&gt; -poly (חומצה אקרילית) -coated מתכת חלקיקים כמו מונומרים להומו- ושיתוף פילמור

We present a template-free method for &#8220;polymerizing&#8221; nanoparticles into long chains without side branches. A variety of nanoparticles are ...

Photochemical Oxidative Growth of Iridium Oxide Nanoparticles on CdSe@CdS Nanorods

צמיחת פוטו חמצונים של חלקיקים אירידיום תחמוצת על Nanorods CdSe @ התקליטורים

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide ...

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

פרוטוקול MPLEx עבור ניתוחים מולטי-omic של דגימות אדמה

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

Separation of Aldehydes and Reactive Ketones from Mixtures Using a Bisulfite Extraction Protocol

פרידה של Aldehydes, קטונים תגובתי תערובות באמצעות פרוטוקול החילוץ ביסולפאט

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer ...

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

הדפסת הזרקת דיו וניתוח הנעה של משי מבוסס עצמית הנעה מיקרו-שטירים

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

סינתזה, Bioconjugation של תיול-תגובתי ריאגנטים עבור הקמת האתר באופן סלקטיבי שונה Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

היבט טכני של סינתזה אוטומטי הערכה בזמן אמת קינטי של [11ג] הצמד-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...