Name: monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis
Uploaded: 2021-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis at JoVE.com

Behandel alle influenzavirussen volgens de juiste vereisten voor het bioveiligheidsniveau (BSL-2 of hoger, afhankelijk van het subtype). Gebruik IAV-stammen met een lage passagegeschiedenis (minder dan 5x op MDCK-cellen) om een lage variatie tussen experimenten te verzekeren.
1. Bereiding van reagentia en grondstoffen
<ol><li>Bereiding van MDCK-cellen en steriel celkweekmedium<ol>
<li>Cultiveer Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellen in gemodificeerd Eagle's medium (MEM) aangevuld met 10% wa...

<ol>
	<li>Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+influenza+transmission.">Routes of influenza transmission.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).</li><li>Sooryanarain, H., Elankumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Role+in+Influenza+Virus+Outbreaks.">Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).</li><li>Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abiotic+factors+affecting+the+persistence+of+avian+influenza+virus+in+surface+waters+of+waterfowl+habitats.">Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).</li><li>Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pH,+temperature,+and+salinity+on+persistence+of+avian+influenza+viruses+in+water.">Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water.</a> Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).</li><li>Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Stability+of+Swine+and+Human+Pandemic+Influenza+Viruses+in+Water+under+Variable+Conditions+of+Temperature,+Salinity,+and+pH.">Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+influenza+A+virus+RNA+in+Siberian+lake+ice.">Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice.</a> Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).</li><li>Nazir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Study+on+Tenacity+of+Avian+Influenza+Viruses+in+Water+(Distilled+Water,+Normal+Saline,+and+Surface+Water)+at+Different+Temperatures.">Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures.</a> Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).</li><li>Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+H5+and+H7+avian+influenza+viruses+in+water.">Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water.</a> Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).</li><li>Dublineau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+the+2009+pandemic+influenza+A+(H1N1)+virus+in+water+and+on+non-porous+surface.">Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface.</a> PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).</li><li>Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: <a target="_blank" href="https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4">https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4</a> (2020)</li><li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza:+Propagation,+Quantification,+and+Storage.">Influenza: Propagation, Quantification, and Storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+Plaque+Assay+of+Influenza+Virus+in+an+Established+Line+of+Canine+Kidney+Cells.">Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells.</a> Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).</li><li>Witkowski, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+impedance+measurement+as+a+new+tool+for+poxvirus+titration,+antibody+neutralization+testing+and+evaluation+of+antiviral+substances.">Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).</li><li>Lebourgeois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Real-Time+Cell+Analysis+(RTCA)+Method+as+a+Fast+and+Accurate+Method+for+Detecting+Infectious+Particles+of+the+Adapted+Strain+of+Hepatitis+A+Virus.">Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).</li><li>Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+analysis--a+new+method+for+dynamic,+quantitative+measurement+of+infectious+viruses+and+antiserum+neutralizing+activity.">Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).</li><li>Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+flavivirus+induced+cytopathogenesis+using+cell+electric+impedance+technology.">Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology.</a> Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).</li><li>Charretier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+cell+analysis+method+for+determining+viral+infectious+titers+during+development+of+a+viral+vaccine+production+process.">Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process.</a> Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).</li><li>Tian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Analysis+for+Measuring+Viral+Cytopathogenesis+and+the+Efficacy+of+Neutralizing+Antibodies+to+the+2009+Influenza+A+(H1N1)+Virus.">Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus.</a> PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).</li><li>Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+analysis--a+new+method+for+dynamic,+quantitative+measurement+of+infectious+viruses+and+antiserum+neutralizing+activity.">Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).</li><li>Thieulent, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+evaluation+of+antiviral+compounds+against+Equid+alpha-herpesviruses+using+an+impedance-based+cellular+assay.">Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay.</a> Virology. 526, 105-116 (2019).</li><li>Labadie, T., Bat&#233;jat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+Virus+Segment+Composition+Influences+Viral+Stability+in+the+Environment.">Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).</li><li>Wiley, D. C., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+the+hemagglutinin+membrane+glycoprotein+of+influenza+virus.">The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus.</a> Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).</li></ol>

RTCA is een op impedantie gebaseerde technologie die steeds vaker wordt gebruikt voor real-time monitoring van celeigenschappen, zoals celtrouw, proliferatie, migratie en cytotoxiciteit. In deze studie wordt het vermogen van deze technologie om de IAV-overleving buiten de gastheer te beoordelen aangetoond door de virusinactivatiehelling te meten. Kieskeurige technieken zoals TCID50 en plaque-assays worden vervangen door objectieve real-time beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen, waardoor cytopathisch...

De overdracht van een virus is afhankelijk van de combinatie van verschillende factoren. Voor een virus dat in de omgeving wordt uitgescheiden, hangt de overdracht ervan ook af van het vermogen om te volharden in omstandigheden buiten de gastheer. Het bestuderen van virale inactivatie in het algemeen is daarom een cruciale stap in het helpen van nationale gezondheidsautoriteiten en beleidsmakers bij het implementeren van controle- en bioveiligheidsmaatregelen.
De kennis over de persistentie van virussen in natuurlijke en laboratoriumomgevingen is de afgelopen tien jaar aanzienlijk toegenomen. In het geval van influenza A-virussen (IAV) onderwerpen hun transmissieroutes virale deeltjes aan een breed scala aan omgevingsomstandigheden. In het bijzonder kunnen ze worden overgedragen via 1) fecaal-orale routes door water (d.w.z. vogelvirussen), of 2) direct of indirect contact door besmette fomites, evenals aerosolen en ademhalingsdruppels (d.w.z. pluimvee- en zoogdiervirussen)1. In elk geval worden IAV onderworpen aan verschillende fysisch-chemische parameters (d.w.z. pH, zoutgehalte, temperatuur en vochtigheid), die min of meer snel hun infectiviteit beïnvloeden2,3,4,5,6,7,8,9. Het is van groot belang, met name met betrekking tot zoönotische en pandemische virussen, om het potentieel van omgevingsfactoren te beoordelen om de virusdynamiek en de risico's van blootstelling en overdracht tussen soorten te beïnvloeden.
Tot nu toe zijn traditionele virologische technieken (d.w.z. virale titerbepaling door middel van plaquetests of 50% weefselkweek infectieuze dosisschatting) gebruikt om de IAV-infectiviteit in de loop van de tijd te beoordelen; maar deze technieken zijn tijdrovend en vereisen veel benodigdheden10,11,12. Het meten van de impedantie van geïnfecteerde cellen in de loop van de tijd met micro-elektroden dient als een nuttig hulpmiddel om de IAV-overleving in verschillende omgevingsomstandigheden te volgen, evenals virale inactivatie in het algemeen. Deze methode biedt objectieve, real-time gegevens die subjectieve menselijke observatie van cytopathische effecten vervangen. Het kan worden gebruikt om virustitratie te bepalen, waardoor traditionele metingen worden vervangen door lagere betrouwbaarheidsintervallen en arbeidsintensieve eindpunttests worden vermeden.
Er bestaat een lineaire correlatie tussen titratieresultaten verkregen door meting van celimpedantie en door klassieke plaquetest of TCID50-methoden. Daarom kunnen gegevens verkregen met de op impedantie gebaseerde titratiemethode eenvoudig worden omgezet in TCID50- of pfu-waarden door een standaardcurve te maken met seriële verdunning van het virus13,14,15,16,17. Detectie, kwantificering en werkzaamheid van neutraliserende antilichamen in serummonsters kunnen ook worden bereikt met behulp van deze experimentele benadering18,19. Meer recent zijn op impedantie gebaseerde cellulaire assays gebruikt om antivirale verbindingen tegen Equid alphaherpesvirussen20 te screenen en te evalueren.
Deze technologie is gebruikt om de persistentie van IAV's in zout water bij verschillende temperaturen te evalueren en om mutaties in het hemagglutinine van IAV te identificeren die de IAV-persistentie in de omgeving verhogen of verlagen21. Een dergelijke screening zou uitgebreid werk vereisen als traditionele titratiemethoden worden gebruikt. Deze methodologie kan echter worden gebruikt voor elk virus dat van invloed is op de celmorfologie, het celnummer en de hechtingssterkte van het celoppervlak. Het kan ook worden gebruikt om persistentie in verschillende omgevingsomstandigheden (d.w.z. in de lucht, in water of op oppervlakken) te controleren.
Het hier beschreven protocol past IAV-overleving in water toe als voorbeeld. Menselijke influenzavirussen worden gedurende langere perioden blootgesteld aan verschillende fysisch-chemische parameters. Zout water (35 g/L NaCl) bij 35 °C werd gekozen als milieumodel op basis van eerdere resultaten9. Resterende infectiviteit van blootgestelde virussen wordt gekwantificeerd op verschillende tijdstippen door celinfectie. MDCK-cellen, het referentieceltype voor IAV-amplificatie, worden gezaaid op 16 goed microtiterplaten bedekt met micro-elektrodesensoren en 24 uur later geïnfecteerd door blootgestelde virussen. Celimpedantie wordt elke 15 minuten gemeten en uitgedrukt als een willekeurige eenheid die de celindex (CI) wordt genoemd. Cytopathische effecten geïnduceerd door het influenzavirus, waarvan de snelheid van aanvang direct afhangt van het aantal infectieuze virale deeltjes dat in de celkweek wordt geënt, leidt tot CI-afname, die vervolgens wordt gekwantificeerd als de CIT50-waarde . Deze waarde komt overeen met de tijd die nodig is om een reductie van 50% ten opzichte van het initiële CI te meten (d.w.z. vóór virustoevoeging). CIT50-waarden berekend voor verschillende omgevingsblootstellingstijden maken het mogelijk om de inactiveringshelling van een virus af te trekken na lineaire regressie van CIT50-waarden .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25%Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Plate 16 (6 plates)</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>5469830001</td>
			<td>E-plates are avalible in different packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 1X</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>31095029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK-Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>380601310</td>
			<td>The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis

Methoden voor het kwantificeren van virusdeeltjes vormen een cruciaal aspect van veel virologische studies. Hoewel er verschillende betrouwbare technieken bestaan, zijn ze tijdrovend of niet in staat om kleine variaties te detecteren. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de nauwkeurige kwantificering van virale titer door elektrische impedantievariaties van geïnfecteerde cellen in realtime te analyseren. Cellulaire impedantie wordt gemeten door middel van gouden micro-elektrode biosensoren onder de cellen in microplaten, waarbij de grootte afhangt van het aantal cellen en hun grootte en vorm. Dit protocol maakt real-time analyse van celproliferatie, levensvatbaarheid, morfologie en migratie mogelijk met verbeterde gevoeligheid. Ook wordt een voorbeeld gegeven van een praktische toepassing door het kwantificeren van het verval van influenza A-virus (IAV) onderworpen aan verschillende fysisch-chemische parameters die de virale infectiviteit in de loop van de tijd beïnvloeden (d.w.z. temperatuur, zoutgehalte en pH). Voor dergelijke toepassingen vermindert het protocol de benodigde werklast en genereert het ook nauwkeurige kwantificeringsgegevens van infectieuze virusdeeltjes. Het maakt de vergelijking van inactiveringshellingen tussen verschillende IAV's mogelijk, wat hun vermogen weerspiegelt om in een bepaalde omgeving te blijven bestaan. Dit protocol is gemakkelijk uit te voeren, is zeer reproduceerbaar en kan worden toegepast op elk virus dat cytopathische effecten in celkweek produceert.

Ruwe gegevens verkregen na 120 uur met verschillende concentraties MDCK-cellen, van 15.000 tot 120.000 cellen per put, zijn weergegeven in figuur 1. Na 24 uur tonen CI-metingen aan dat cellen in putten met 30.000 cellen zich nog steeds in de exponentiële groeifase bevonden en deze celconcentratie werd gebruikt voor verdere experimenten. Figuur 2 illustreert de lineaire correlatie tussen CIT50-waarden en de initiële veelheid van infectie. MDCK-cellen...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis at JoVE.com

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Hier is een protocol gerapporteerd voor de kwantificering van infectieuze virale deeltjes met behulp van real-time monitoring van elektrische impedantie van geïnfecteerde cellen. Een praktische toepassing van deze methode wordt gepresenteerd door het kwantificeren van influenza A-virusverval onder verschillende fysisch-chemische parameters die omgevingsomstandigheden nabootsen.

Monitoring influenzavirusoverleving buiten de gastheer met behulp van real-time celanalyse

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Methoden voor verschillende deeltjeskwantificering vertegenwoordigen een kritisch aspect van de meeste biologiestudies. Dit protocol maakt een nauwkeurige kwantificering van de virale gegevens in realtime mogelijk. Deze techniek vervangt de traditionele meting van virale gegevens.Door objectieve realtime gegevens zitten we onder ons betrouwbaarheidsinterval, waardoor arbeidsintensieve eindpunten worden vermeden. Deze methode kan worden gebruikt voor alle virussen die een cytopathisch effect induceren. De procedure wordt gedemonstreerd door Quentin Grassin, een laborant van ons laboratorium.Om H1N1-virussen te verspreiden en te versterken, zaait u 7,5 keer 10 tot de 6 MDCK-cellen op twee weefselkweekkolven van 75 vierkante centimeter volgens standaardprotocollen en incubeert u de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius om 90 tot 100% confluentie te bereiken. Was de volgende dag de cellen twee keer met vijf milliliter steriel PBS per kolf per wasbeurt en label één kolf als controlemiddel. Verdun vervolgens een ontdooide injectieflacon met influenza A-virusvoorraad tot de juiste experimentele concentratie in een buis van 1,5 milliliter met vers viruspropagatiemedium.Gebruik één milliliter van de verdunde bouillon om de MDCK-cellen te infecteren bij een veelheid van infectie van 1 maal 10 tot de negatieve 3, of 1 maal 10 tot de negatieve 4 plaquevormende eenheden per cel, en voeg één milliliter virusvoortplantingsmedium toe aan de controlekolf. Adsorbeer het virus gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur aan de cellen, met elke 15 minuten roeren. Verwijder aan het einde van de incubatie het entmateriaal en vervang het door 15 milliliter virusvermeerderingsmedium aangevuld met één microgram per milliliter TPCK-trypsine om de splitsing van virale hemagglutinine HA0 in HA1- en HA2-subeenheden te vergemakkelijken.Plaats de kolf vervolgens drie dagen in de couveuse van 35 graden Celsius. Vergelijk aan het einde van de incubatie de cellen in elke cultuur onder een 40x objectief op een lichtmicroscoop om de cytopathische effecten op de cellen te beoordelen. Wanneer het cytopathische effect is voltooid, voegt u de celkweeksupernatanten toe aan een buis van 15 millimeter en verzamelt u het cellulaire puin van elke cultuur door centrifugatie.Breng vervolgens het geklaarde viruscultuursupernatant over naar een buis van 15 milliliter en aliquot de nageslachtsvirussen naar steriele cryogene injectieflacons voor eenmalig gebruik voor opslag van min 80 graden Celsius. Om de juiste celhoeveelheid voor celinfectie te bepalen, bereidt u 24 uur per dag ongeveer 80% confluente MDCK-celculturen zoals aangetoond voordat de cellen met PBS worden gewassen en geoogst met een incubatie van 45 minuten in drie milliliters van 0,25% Trypsine-EDTA per kolf bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, stop de reactie met zeven milliliter vers kweekmedium per kolf en tel de cellen van elke cultuur.Verdun de cellen tot 4 maal 10 tot de 5e cellen per milliliter celkweekmedium en voer tweevoudige seriële verdunningen van de cellen uit zoals aangegeven. Plaats een E-plaat enkele minuten op kamertemperatuur voordat u 100 microliter celkweekmedium aan elke put toevoegt zonder de elektroden van de E-plaat aan te raken. Ontgrendel de houders en steek de voorkant van de plaat in het houdervak van het impedantiemeetinstrument.Sluit de deur van de incubator en open de software. Markeer in de standaardinstelling voor experimentpatroon de geselecteerde houder en dubbelklik op de bovenste pagina om de naam van het experiment in te voeren. Klik op Lay-out en voer de benodigde voorbeeldinformatie in voor elke geselecteerde put van de plaat.Klik op Plannen, stappen en Een stap toevoegen. De software voegt automatisch een stap van één seconde toe om de achtergrondimpedantie te meten Klik op Uitvoeren en Starten, Doorgaan. Klik op Plotten en toevoegen om de juiste putjes te selecteren en bevestig dat de achtergrondimpedantie tussen negatief 0,1 en 0,1 ligt voordat u doorgaat naar de volgende stap.Verwijder vervolgens de plaat uit de houder en voeg 100 microliter van elke celsuspensie in tweevoud toe aan de juiste putjes. Laat de E-plaat 30 minuten bij kamertemperatuur in de laminaire stroomkap om een gelijkmatige verdeling van de cellen over de bodem van de putten mogelijk te maken voordat de E-plaat in de houderzak wordt geladen. Klik op Stap plannen en toevoegen en voer waarden in om de cellen elke 30 minuten op 200 herhalingen te controleren voordat u Start, Doorgaan selecteert.Als u de celimpedantiegegevens wilt controleren en plotten, klikt u op Plot en selecteert u de concentratie cellen die net voor de stationaire fase 24 uur na het zaaien is om cellen te verkrijgen die zich nog in een groeifase bevinden tijdens de virale infectie. Om de correlatie tussen de CIT50-waarden en de veelheid van infectie te bepalen, na het kweken van 3 keer 10 tot de 4e vers gesplitste MDCK-cellen in elke put van de elektronische microtiterplaat gedurende 24 uur, wast u de cellen twee keer met 100 microliter vers virusvoortplantingsmedium per put, per wasbeurt en gebruikt u een pipet met één kanaal om 100 microliter virale suspensie aan elke put toe te voegen. Wanneer alle virusverdunningen zijn toegevoegd, laadt u de plaat voorzichtig in de wiegzak van het instrument bij 35 graden Celsius en begint u de celimpedantie elke 15 minuten gedurende ten minste 100 uur te controleren, zoals aangetoond.Klik na twee meetcycli om het apparaat te pauzeren en verwijder de E-plaat uit de houder. Voeg 100 microliter viruspropagatiemedium aangevuld met TPCK-trypsine toe aan elke put en breng de E-plaat terug in de wiegzak. Start vervolgens de analyse.Om de overlevingskinetiek van het influenza A-virus te beoordelen, voegt u natriumchloride toe aan een eindconcentratie van 35 gram per liter in gedestilleerd water en voegt u 900 microliter van de resulterende zoutoplossing toe aan cryobuizen van twee milliliter. Voeg 100 microliter virale bouillon toe aan elke cryobuis en plaats de buizen in de incubator van 35 graden Celsius voor de juiste experimentele periode. De dag voor het einde van de incubatie, zaad 3 keer 10 tot de 4e vers gesplitste MDCK-cellen en 100 microliter viruspropagatiemedium per put in een 16-well microtiterplaat in herhaalde stappen, waardoor de achtergrondimpedantie en uniforme verdeling van de cellen op de bodem van de putten kunnen worden gemeten.Vervolgens groeien de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Was de volgende dag de cellen twee keer, infecteer vervolgens de cellen met 100 microliter van het zoutoplossing gedestilleerde virus dat 10 keer is verdund in vers kweekmedium, zoals aangetoond, en controleer de celimpedantie elke 15 minuten gedurende ten minste 100 uur. Hier worden ruwe gegevens getoond die na 120 uur zijn verkregen met verschillende concentraties MDCK-cellen.Na 24 uur onthulden celindexmetingen dat cellen in putten gezaaid met 3 keer 10 tot de 4e cellen zich nog steeds in de exponentiële groeifase bevonden, daarom werd deze celconcentratie gebruikt voor latere experimenten. MDCK-celculturen tonen een duidelijke lineaire relatie tussen de CIT50 en de initiële veelheid van infectie door influenzavirus. De resultaten van een typisch overlevingskinetisch experiment tonen een afname van de celindex als gevolg van virusgeïnduceerd cytopathisch effect.De CIT50 kan worden gebruikt om de virale inactivatiehelling voor elk virus in elke toestand te berekenen voor de bepaling van welk virus de grootste stabiliteit had in de bestudeerde omgeving. De stabiliteit van het virus correleert indirect met de inactivatiehelling, waardoor bijvoorbeeld aminozuurresiduen in het hemagglutinineglycoproteïne die betrokken zijn bij de overleving van het influenza A-virus buiten de gastheer kunnen worden geïdentificeerd. Deze techniek is erg gevoelig voor kleine variaties.Daarom wordt het gebruik van een automatische celteller aangemoedigd om reproduceerbare resultaten tussen experimenten te verkrijgen. Deze methode kan ook worden gebruikt om de replicatie van verschillende virussen te vergelijken, om het virustropisme voor meerdere cellijnen tegelijk te onderzoeken of om specifieke stappen van de viruscyclus te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Met behulp van Bioluminescent Imaging naar Synergie Onderzoek Between Streptococcus pneumoniae En influenza A-virus bij jonge muizen

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Inductie van Graft-versus-host ziekte en<em&gt; In Vivo</em&gt; T-cel monitoren door gebruik van een MHC-matched muizenmodel

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasale Doekjes voor het influenza A-virus detectie en isolatie van Varkens

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Geminiaturiseerde Glycan Microarray Assay voor het beoordelen van Avidity en specificiteit van influenza A-virus hemagglutinine

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generatie van Escape varianten van het Influenza Virus monoklonale antistoffen neutraliseren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...