Name: monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis
Uploaded: 2021-02-20T13:00:00
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Manipuler tous les virus de la grippe selon les exigences appropriées en matière de niveau de biosécurité (BSL-2 ou plus selon le sous-type). Utilisez des souches IAV avec un faible historique de passage (moins de 5x sur les cellules MDCK) pour assurer une faible variation entre les expériences.
1. Préparation des réactifs et des matières premières
<ol><li>Préparation de cellules MDCK et d’un milieu de culture cellulaire stérile<ol>
<li>Cultiver des cellules du rein canin Madin-...

<ol>
	<li>Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+influenza+transmission.">Routes of influenza transmission.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).</li><li>Sooryanarain, H., Elankumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Role+in+Influenza+Virus+Outbreaks.">Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).</li><li>Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abiotic+factors+affecting+the+persistence+of+avian+influenza+virus+in+surface+waters+of+waterfowl+habitats.">Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).</li><li>Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pH,+temperature,+and+salinity+on+persistence+of+avian+influenza+viruses+in+water.">Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water.</a> Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).</li><li>Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Stability+of+Swine+and+Human+Pandemic+Influenza+Viruses+in+Water+under+Variable+Conditions+of+Temperature,+Salinity,+and+pH.">Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+influenza+A+virus+RNA+in+Siberian+lake+ice.">Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice.</a> Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).</li><li>Nazir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Study+on+Tenacity+of+Avian+Influenza+Viruses+in+Water+(Distilled+Water,+Normal+Saline,+and+Surface+Water)+at+Different+Temperatures.">Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures.</a> Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).</li><li>Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+H5+and+H7+avian+influenza+viruses+in+water.">Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water.</a> Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).</li><li>Dublineau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+the+2009+pandemic+influenza+A+(H1N1)+virus+in+water+and+on+non-porous+surface.">Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface.</a> PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).</li><li>Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: <a target="_blank" href="https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4">https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4</a> (2020)</li><li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza:+Propagation,+Quantification,+and+Storage.">Influenza: Propagation, Quantification, and Storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+Plaque+Assay+of+Influenza+Virus+in+an+Established+Line+of+Canine+Kidney+Cells.">Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells.</a> Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).</li><li>Witkowski, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+impedance+measurement+as+a+new+tool+for+poxvirus+titration,+antibody+neutralization+testing+and+evaluation+of+antiviral+substances.">Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).</li><li>Lebourgeois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Real-Time+Cell+Analysis+(RTCA)+Method+as+a+Fast+and+Accurate+Method+for+Detecting+Infectious+Particles+of+the+Adapted+Strain+of+Hepatitis+A+Virus.">Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).</li><li>Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+analysis--a+new+method+for+dynamic,+quantitative+measurement+of+infectious+viruses+and+antiserum+neutralizing+activity.">Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).</li><li>Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+flavivirus+induced+cytopathogenesis+using+cell+electric+impedance+technology.">Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology.</a> Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).</li><li>Charretier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+cell+analysis+method+for+determining+viral+infectious+titers+during+development+of+a+viral+vaccine+production+process.">Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process.</a> Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).</li><li>Tian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Cell+Analysis+for+Measuring+Viral+Cytopathogenesis+and+the+Efficacy+of+Neutralizing+Antibodies+to+the+2009+Influenza+A+(H1N1)+Virus.">Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus.</a> PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).</li><li>Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+analysis--a+new+method+for+dynamic,+quantitative+measurement+of+infectious+viruses+and+antiserum+neutralizing+activity.">Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).</li><li>Thieulent, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+evaluation+of+antiviral+compounds+against+Equid+alpha-herpesviruses+using+an+impedance-based+cellular+assay.">Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay.</a> Virology. 526, 105-116 (2019).</li><li>Labadie, T., Bat&#233;jat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+Virus+Segment+Composition+Influences+Viral+Stability+in+the+Environment.">Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).</li><li>Wiley, D. C., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+the+hemagglutinin+membrane+glycoprotein+of+influenza+virus.">The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus.</a> Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).</li></ol>

RtCA est une technologie basée sur l’impédance qui est de plus en plus utilisée pour la surveillance en temps réel des propriétés cellulaires, telles que l’adhérence cellulaire, la prolifération, la migration et la cytotoxicité. Dans cette étude, la capacité de cette technologie à évaluer la survie de la VAI à l’extérieur de l’hôte est démontrée en mesurant la pente d’inactivation du virus. Les techniques fastidieuses telles que TCID50 et les tests de plaque sont remplacées par une...

La transmission d’un virus repose sur la combinaison de plusieurs facteurs. Pour un virus sécrété dans l’environnement, sa transmission dépend également de sa capacité à persister dans des conditions extérieures à l’hôte. L’étude de l’inactivation virale en général est donc une étape cruciale pour aider les autorités sanitaires nationales et les décideurs politiques à mettre en œuvre des mesures de contrôle et de biosécurité.
Les connaissances sur la persistance du virus dans les milieux naturels et de laboratoire ont considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. Dans le cas des virus de la grippe A (IAV), leurs voies de transmission soumettent les particules virales à un large éventail de conditions environnementales. Plus précisément, ils peuvent être transmis par 1) voies fécales-orales par l’eau (c.-à-d. les virus aviaires), ou 2) par contact direct ou indirect par des fomites contaminés, ainsi que par des aérosols et des gouttelettes respiratoires (c.-à-d. des virus de volaille et de mammifères)1. Dans tous les cas, les IAV sont soumis à divers paramètres physico-chimiques (p.a., salinité, température et humidité), ce qui affecte plus ou moins rapidement leur infectiosité2,3,4,5,6,7,8,9. Il est très important, en particulier en ce qui concerne les virus zoonotiques et pandémiques, d’évaluer le potentiel des facteurs environnementaux à affecter la dynamique du virus et les risques d’exposition et de transmission interspécifique.
Jusqu’à présent, des techniques virologiques traditionnelles (c.-à-d. la détermination du titre viral par des essais de plaque ou l’estimation de la dose infectieuse par culture tissulaire à 50 %) ont été utilisées pour évaluer l’infectiosité de l’IAV au fil du temps; mais ces techniques prennent beaucoup de temps et nécessitent de nombreux approvisionnements10,11,12. La mesure de l’impédance des cellules infectées au fil du temps avec des microélectrodes est un outil utile pour surveiller la survie aux MII dans différentes conditions environnementales, ainsi que l’inactivation virale en général. Cette méthode fournit des données objectives en temps réel qui remplacent l’observation humaine subjective des effets cytopathiques. Il peut être utilisé pour déterminer le titrage du virus, remplaçant ainsi les mesures traditionnelles par des intervalles de confiance plus faibles et évitant les tests d’évaluation à forte intensité de main-d’œuvre.
Il existe une corrélation linéaire entre les résultats de titrage obtenus par mesure de l’impédance cellulaire et par les méthodes classiques de dosage de la plaque ou TCID50. Par conséquent, les données obtenues avec la méthode de titrage basée sur l’impédance peuvent être facilement transformées en valeurs TCID50 ou pfu en créant une courbe standard avec dilution en série du virus13,14,15,16,17. La détection, la quantification et l’efficacité des anticorps neutralisants présents dans les échantillons de sérum peuvent également être obtenues à l’aide de cette approche expérimentale18,19. Plus récemment, des tests cellulaires basés sur l’impédance ont été utilisés pour dépister et évaluer les composés antiviraux contre les alphaherpèsvirus Equid20.
Cette technologie a été utilisée pour évaluer la persistance des IAV dans l’eau saline à différentes températures et pour identifier les mutations dans l’hémagglutinine de l’IAV qui augmentent ou diminuent la persistance de l’IAV dans l’environnement21. Un tel dépistage nécessiterait un travail approfondi s’il utilisait des méthodes de titrage traditionnelles. Cependant, cette méthodologie peut être utilisée pour tout virus qui a un impact sur la morphologie cellulaire, le nombre de cellules et la force d’attachement de la surface cellulaire. Il peut également être utilisé pour surveiller la persistance dans diverses conditions environnementales (c.-à-d. dans l’air, dans l’eau ou sur les surfaces).
Le protocole décrit ici applique la survie IAV dans l’eau à titre d’exemple. Les virus de la grippe humaine sont exposés à différents paramètres physico-chimiques pendant de longues périodes. L’eau saline (35 g/L de NaCl) à 35 °C a été choisie comme modèle environnemental sur la base des résultats précédents9. L’infectiosité résiduelle des virus exposés est quantifiée à différents moments par le biais de l’infection cellulaire. Les cellules MDCK, le type de cellule de référence pour l’amplification IAV, sont ensemencées sur 16 plaques de microtitrage de puits recouvertes de capteurs à microélectrodes et infectées par des virus exposés 24 heures plus tard. L’impédance cellulaire est mesurée toutes les 15 minutes et exprimée sous la forme d’une unité arbitraire appelée indice cellulaire (IC). Les effets cytopathiques induits par le virus de la grippe, dont le taux d’apparition dépend directement du nombre de particules virales infectieuses inoculées à la culture cellulaire, entraînent une diminution de l’IC, qui est ensuite quantifiée comme la valeur CIT50 . Cette valeur correspond au temps nécessaire pour mesurer une réduction de 50 % par rapport à l’IC initial (c.-à-d. avant l’ajout du virus). Les valeurs CIT50 calculées pour plusieurs temps d’exposition environnementale permettent de déduire la pente d’inactivation d’un virus après régression linéaire des valeurs CIT50 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25%Trypsin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Plate 16 (6 plates)</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>5469830001</td>
			<td>E-plates are avalible in different packaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 1X</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>31095029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>14040091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life technologies (gibco)</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPCK-Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>380601310</td>
			<td>The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis

Les méthodes de quantification des particules virales représentent un aspect essentiel de nombreuses études virologiques. Bien qu’il existe plusieurs techniques fiables, elles prennent beaucoup de temps ou sont incapables de détecter de petites variations. Présenté ici est un protocole pour la quantification précise du titre viral en analysant les variations d’impédance électrique des cellules infectées en temps réel. L’impédance cellulaire est mesurée à l’aide de biocapteurs à microélectrodes d’or situés sous les cellules dans des microplaques, dont l’ampleur dépend du nombre de cellules ainsi que de leur taille et de leur forme. Ce protocole permet une analyse en temps réel de la prolifération, de la viabilité, de la morphologie et de la migration cellulaires avec une sensibilité accrue. Un exemple d’application pratique est également fourni en quantifiant la désintégration du virus de la grippe A (VAI) soumise à divers paramètres physicochimiques affectant l’infectiosité virale au fil du temps (c.-à-d. température, salinité et pH). Pour de telles applications, le protocole réduit la charge de travail nécessaire tout en générant des données de quantification précises des particules virales infectieuses. Il permet de comparer les pentes d’inactivation entre différents IAV, ce qui reflète leur capacité à persister dans un environnement donné. Ce protocole est facile à réaliser, est hautement reproductible et peut être appliqué à tout virus produisant des effets cytopathiques en culture cellulaire.

Les données brutes obtenues après 120 h avec différentes concentrations de cellules MDCK, de 15 000 à 120 000 cellules par puits, sont présentées à la figure 1. Après 24 h, les mesures de l’IC montrent que les cellules dans les puits ensemencés avec 30 000 cellules étaient encore dans la phase exponentielle de croissance, et cette concentration cellulaire a été utilisée pour d’autres expériences. La figure 2 illustre la corrélation linéaire e...

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Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Il est rapporté ici un protocole pour la quantification des particules virales infectieuses en utilisant la surveillance en temps réel de l’impédance électrique des cellules infectées. Une application pratique de cette méthode est présentée en quantifiant la désintégration du virus de la grippe A sous différents paramètres physicochimiques imitant les conditions environnementales.

Surveillance de la survie du virus de la grippe à l’extérieur de l’hôte à l’aide d’une analyse cellulaire en temps réel

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Les méthodes de quantification de diverses particules représentent un aspect critique de la plupart des études de biologie. Ce protocole permet une quantification précise des données virales en temps réel. Cette technique remplace la mesure traditionnelle des données virales.Grâce à des données objectives en temps réel, nous sommes en dessous de notre intervalle de confiance, évitant les critères d’évaluation à forte intensité de main-d’œuvre. Cette méthode peut être utilisée pour tous les virus qui induisent un effet cytopathique. Quentin Grassin, un technicien de laboratoire de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Pour propager et amplifier les virus H1N1, ensemencez 7,5 fois 10 aux 6 cellules MDCK sur deux flacons de culture tissulaire de 75 centimètres carrés selon les protocoles standard, et incubez les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius pour atteindre 90 à 100% de confluence. Le lendemain, lavez les cellules deux fois avec cinq millilitres de PBS stérile par flacon et par lavage et étiquetez une fiole comme témoin. Ensuite, diluer un flacon décongelé de virus de la grippe A à la concentration expérimentale appropriée dans un tube de 1,5 millilitre contenant un milieu de propagation du virus frais.Utilisez un millilitre du stock dilué pour infecter les cellules MDCK à une multiplicité d’infection de 1 fois 10 à 3 négatifs, ou de 1 fois 10 à 4 unités formant de la plaque négative par cellule, et ajoutez un millilitre de milieu de propagation du virus à la fiole témoin. Adsorbez le virus dans les cellules pendant 45 minutes à température ambiante, en remuant toutes les 15 minutes. À la fin de l’incubation, retirer l’inoculum et le remplacer par 15 millilitres de milieu de propagation du virus complétés par un microgramme par millilitre de trypsine TPCK pour faciliter le clivage de l’hémagglutinine virale HA0 en sous-unités HA1 et HA2.Ensuite, placez la fiole dans l’incubateur à 35 degrés Celsius pendant trois jours. À la fin de l’incubation, comparez les cellules de chaque culture sous un objectif 40x sur un microscope optique pour évaluer les effets cytopathiques sur les cellules. Lorsque l’effet cytopathique est terminé, ajoutez les surnageants de culture cellulaire dans un tube de 15 millimètres et collectez les débris cellulaires de chaque culture par centrifugation.Ensuite, transférez le surnageant de culture du virus clarifié dans un tube de 15 millilitres et aliquotez les virus de la progéniture dans des flacons cryogéniques stériles à usage unique pour un stockage de moins 80 degrés Celsius. Pour déterminer la quantité cellulaire appropriée pour l’infection cellulaire, préparez des cultures cellulaires MDCK confluentes d’environ 80 % sur 24 heures, comme démontré, avant de laver les cellules avec du PBS et de les récolter avec une incubation de 45 minutes dans trois millilitres de 0,25 % de trypsine-EDTA par flacon à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la réaction avec sept millilitres de milieu de culture frais par fiole et comptez les cellules de chaque culture.Diluer les cellules à 4 fois 10 à 5ème cellules par millilitre de milieu de culture cellulaire et effectuer deux fois les dilutions en série des cellules comme indiqué. Placez une plaque E à température ambiante pendant plusieurs minutes avant d’ajouter 100 microlitres de milieu de culture cellulaire à chaque puits sans toucher les électrodes de la plaque E. Déverrouillez les berceaux et insérez l’extrémité avant de la plaque dans la poche du berceau de l’instrument de mesure de l’impédance.Fermez la porte de l’incubateur et ouvrez le logiciel. Dans la configuration du modèle d’expérience par défaut, mettez en surbrillance les stations d’accueil sélectionnées et double-cliquez sur la page supérieure pour entrer le nom de l’expérience. Cliquez sur Disposition et entrez les informations d’échantillon nécessaires pour chaque puits sélectionné de la plaque.Cliquez sur Planifier, Étapes et Ajouter une étape. Le logiciel ajoutera automatiquement une étape d’une seconde pour mesurer l’impédance d’arrière-plan Cliquez sur Exécuter et Démarrer, Continuer. Cliquez sur Tracer et ajouter pour sélectionner les puits appropriés, en confirmant que l’impédance d’arrière-plan est comprise entre 0,1 et 0,1 négatif avant de passer à l’étape suivante.Ensuite, retirez la plaque du berceau et ajoutez 100 microlitres de chaque suspension cellulaire aux puits appropriés en double exemplaire. Laissez la plaque E dans la hotte à écoulement laminaire pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre une distribution uniforme des cellules sur le fond des puits avant de charger la plaque E dans la poche du berceau. Cliquez sur Planifier et ajouter une étape et entrez des valeurs pour surveiller les cellules toutes les 30 minutes pendant 200 répétitions avant de sélectionner Démarrer, Continuer.Pour vérifier et tracer les données d’impédance cellulaire, cliquez sur Tracer et sélectionnez la concentration de cellules qui se trouve juste avant la phase stationnaire 24 heures après l’ensemencement pour obtenir des cellules qui sont encore dans une phase de croissance pendant l’infection virale. Pour déterminer la corrélation entre les valeurs CIT50 et la multiplicité de l’infection, après avoir cultivé 3 fois 10 à la 4e cellule MDCK fraîchement divisée dans chaque puits de la plaque de microtitrage électronique pendant 24 heures, laver les cellules deux fois avec 100 microlitres de milieu de propagation du virus frais par puits, par lavage, et utiliser une pipette à canal unique pour ajouter 100 microlitres de suspension virale à chaque puits. Lorsque toutes les dilutions du virus ont été ajoutées, chargez doucement la plaque dans la poche du berceau de l’instrument à 35 degrés Celsius et commencez à surveiller l’impédance cellulaire toutes les 15 minutes pendant au moins 100 heures, comme démontré.Après deux cycles de mesures, cliquez pour mettre l’appareil en pause et retirez la plaque E du berceau. Ajouter 100 microlitres de milieu de propagation du virus complété par de la trypsine TPCK à chaque puits et retourner la plaque E dans la poche du berceau. Ensuite, commencez l’analyse.Pour évaluer la cinétique de survie du virus de la grippe A, ajouter du chlorure de sodium à une concentration finale de 35 grammes par litre dans de l’eau distillée et ajouter 900 microlitres de la solution saline résultante dans des cryotubes de deux millilitres. Ajouter 100 microlitres de matière virale à chaque cryotube et placer les tubes dans l’incubateur à 35 degrés Celsius pendant la période expérimentale appropriée. La veille de la fin de l’incubation, ensemencez 3 fois 10 à la 4ème cellule MDCK fraîchement divisée et 100 microlitres de milieu de propagation du virus par puits dans une plaque de microtitrage de 16 puits par étapes répétées, permettant de mesurer l’impédance de fond et la distribution uniforme des cellules sur le fond des puits.Ensuite, cultivez les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, lavez les cellules deux fois, puis infectez les cellules avec 100 microlitres du virus distillé dans une solution saline diluée 10 fois dans un milieu de culture frais, comme démontré, et surveillez l’impédance cellulaire toutes les 15 minutes pendant au moins 100 heures. Ici, les données brutes obtenues après 120 heures avec différentes concentrations de cellules MDCK sont montrées.Après 24 heures, les mesures de l’indice cellulaire ont révélé que les cellules dans les puits ensemencés avec 3 fois 10 à la 4ème cellule étaient encore dans la phase exponentielle de croissance, par conséquent, cette concentration cellulaire a été utilisée pour des expériences ultérieures. Les cultures de cellules MDCK démontrent une relation linéaire claire entre le CIT50 et la multiplicité initiale de l’infection par le virus de la grippe. Les résultats d’une expérience cinétique de survie typique montrent une diminution de l’indice cellulaire due à l’effet cytopathique induit par le virus.Le CIT50 peut être utilisé pour calculer la pente d’inactivation virale pour chaque virus dans chaque condition afin de déterminer quel virus avait la plus grande stabilité dans l’environnement étudié. La stabilité du virus est indirectement corrélée à la pente d’inactivation, ce qui permet, par exemple, d’identifier les résidus d’acides aminés dans la glycoprotéine d’hémagglutinine qui sont impliqués dans la survie du virus de la grippe A à l’extérieur de l’hôte. Cette technique est très sensible aux petites variations.Par conséquent, l’utilisation d’un compteur de cellules automatique est encouragée afin d’obtenir des résultats reproductibles entre les expériences. Cette méthode peut également être utilisée pour comparer la réplication de différents virus, pour étudier le tropisme du virus pour plusieurs lignées cellulaires à la fois, ou pour étudier des étapes spécifiques du cycle du virus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Recherche

Immunologie et infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

L&#39;induction de la réaction du greffon contre l&#39;hôte et des maladies<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des lymphocytes T utilisant un modèle murin MHC-apparié

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

En temps réel l&#39;imagerie en direct de T-signalisation cellulaire Formation Complex

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Lingettes nasal pour la grippe détection d&#39;un virus et l&#39;isolement des porcs

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Utilisation de modèles Zebrafish de grippe humaine A Infections au virus pour le dépistage médicaments antiviraux et Caractériser hôte réponses immunitaires cellulaires

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Génération des variantes d’évasion de neutraliser les anticorps monoclonaux Influenza Virus

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...