Name: using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions
Uploaded: 2020-06-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

نشكر مركز علم الوراثة في Caenorhabditis ، الممول من المركز الوطني لموارد البحوث في المعاهد القومية للصحة (NCRR) ، على بعض سلالات النيماتودا. تم الحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي طورها H.F. Epstein من بنك الدراسات التنموية الهجين الذي تم تطويره تحت رعاية NICHD وصيانته من قبل قسم البيولوجيا في جامعة أيوا. وقد تم دعم هذا البحث بمنحة من مؤسسة العلوم الإسرائيلية (المنحة رقم 278/18) ومنحة من وزارة العلوم والتكنولوجيا الإسرائيلية ووزارة الخارجية والتعاون الدولي، المديرية العامة لتعزيز الدولة، الجمهورية الإيطالية (المنحة رقم 3-14337). نشكر أعضاء مختبر بن زفي على مساعدتهم في إعداد هذه المخطوطة.

1. إعداد لوحات وسائل الإعلام نمو النيماتودا لRNAi
<ol><li>إلى زجاجة 1 لتر، أضف 3 غرام من NaCl، 2.5 غرام من Bacto-Peptone، 17 غرام من أجار والماء المقطر تصل إلى 1 لتر وautclave.</li>
	<li>زجاجة باردة إلى 55 درجة مئوية.</li>
	<li>إضافة 25 مل من 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 مل من 1 M CaCl2, 1 مل من 1 M MgSO4, و 1 مل من محلول الكوليست?...

لا تزال هناك صورة متكاملة لشبكة البروتيوستازي تعكس كيفية تنظيمها ووظائفها في خلايا وأنسجة ميتازوان مختلفة. ولمعالجة هذا القصور، يلزم الحصول على معلومات محددة عن تفاعلات مختلف مكونات هذه الشبكة، مثل المرافقين الجزيئيين، في أنسجة محددة أثناء التطور والشيخوخة. هنا، أظهرنا كيف أن استخدام ا...

الخلايا التعامل مع تلف البروتين عن طريق استخدام آلات مراقبة الجودة التي إصلاح, عزل أو إزالة أي البروتينات التالفة1,2. ويدعم للطي وتجميع مجمعات البروتين من قبل المرافقين الجزيئية، ومجموعة متنوعة من البروتينات المحفوظة للغاية التي يمكن إصلاح أو عزل البروتينات التالفة3،4،5،6،7. تتم إزالة البروتينات التالفة بوساطة نظام ubiquitin-proteasome (UPS)8 أو بواسطة الآلات autophagy9 بالتعاون مع المرافقين10،11،12. البروتين التوازن (proteostasis) هو، لذلك، التي تحتفظ بها شبكات مراقبة الجودة تتألف من للطي والآلات تدهور3،13. ومع ذلك ، فإن فهم التفاعلات بين المكونات المختلفة لشبكة البروتيوستازي في الجسم الحي هو تحد كبير. في حين أن شاشات التفاعل البروتين البروتين تسهم بمعلومات هامة عن التفاعلات المادية والمجمعاتالمرافقين 14،15، فهم التنظيم وآليات تعويضية داخل شبكات المرافقين الأنسجة الخاصة في الجسم الحي غير موجود.
وغالبا ما تستخدم التفاعلات الجينية كأداة قوية لدراسة العلاقة بين أزواج من الجينات التي تشارك في المسارات البيولوجية المشتركة أو التعويضية16،17،18. ويمكن قياس هذه العلاقات من خلال الجمع بين أزواج من الطفرات وتحديد تأثير طفرة في جين واحد على شدة phenotypic الناجمة عن طفرة في الجين الثاني16. في حين أن معظم هذه المجموعات لا تظهر أي تأثير من حيث النمط الظاهري، يمكن لبعض التفاعلات الجينية إما أن تفاقم أو تخفف من شدة النمط الظاهري المقاس. ويلاحظ الطفرات المشددة عندما يكون النمط الظاهري للحذف المزدوج متحولة أكثر حدة من النمط الظاهري المتوقع ينظر عند الجمع بين المسوخ حذف واحد، مما يعني أن الجينات اثنين تعمل في مسارات متوازية، مما يؤثر معا على وظيفة معينة. في المقابل ، لوحظ تخفيف الطفرات عندما يكون النمط الظاهري للحذف المزدوج متحولة أقل حدة من النمط الظاهري ينظر مع المسوخ حذف واحد ، مما يعني أن الجينين تعمل معا كمعقدة أو المشاركة في نفس المسار16،18. وبناء على ذلك، استخدمت أنماط ظاهرة متنوعة يمكن قياسها كميا، بما في ذلك الأنماط الظاهرية الواسعة، مثل الفتك ومعدلات النمو وحجم الحضنة، فضلا عن أنماط ظاهرة محددة، مثل المراسلين النسخيين، لتحديد التفاعلات الجينية. على سبيل المثال، اعتمد Jonikas وآخرون على مراسل الإجهاد ER لدراسة التفاعلات من Cerevisiae Cerevisiae ER ER تكشفت شبكة الاستجابة البروتينية proteostasis باستخدام تحليلات حذف الجينات pairwise19.
شاشات التفاعل الجيني تنطوي على عبور منهجي الطفرات حذف pairwise لتوليد مجموعة شاملة من المسوخ مزدوجة20. ومع ذلك ، في النماذج الحيوانية ، وتحديدا في C. elegans، هذا النهج على نطاق واسع غير ممكن. بدلا من ذلك، يمكن اختبار السلالات المتحولة لأنماط تفاعلها الجيني عن طريق خفض تنظيم التعبير الجيني باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي (RNAAi)21. C. elegans هو نظام قوي للشاشات على أساس RNAi22،23. في C. elegans، يتم تحقيق تسليم الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA) عن طريق التغذية البكتيرية ، مما يؤدي إلى انتشار جزيئات dsRNA إلى العديد من الأنسجة. وبهذه الطريقة ، فإن جزيئات dsRNA المقدمة تؤثر على الحيوان عن طريق إجراء سريع وبسيط21. ولذلك، يمكن لشاشة التفاعل الجيني باستخدام RNAi أن تكشف عن تأثير خفض تنظيم مجموعة من الجينات أو معظم جينات ترميز C. elegans باستخدام مكتبات RNAi24. في مثل هذه الشاشة ، يضرب التي تؤثر على سلوك متحولة من الفائدة ولكن ليس سلالة نوع البرية هي المعدلات المحتملة للنمط الظاهري يجري رصدها25. هنا، ونحن نطبق مزيجا من الطفرات وفحص RNAi لرسم خريطة منهجية التفاعلات المرافق الأنسجة محددة في C. elegans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

للطي الصحيح وتجميع البروتينات ومجمعات البروتين ضرورية لوظيفة الخلوية. تستخدم الخلايا مسارات مراقبة الجودة التي تصحح البروتينات التالفة أو تعزلها أو تقضي عليها للحفاظ على بروتيوم صحي ، وبالتالي ضمان البروتيستاسيس الخلوي ومنع المزيد من تلف البروتين. بسبب الوظائف الزائدة داخل شبكة البروتيوستاسي ، يؤدي فحص الأنماط الظاهرية القابلة للكشف باستخدام الضربة القاضية أو الطفرات في الجينات ترميز المرافقين في الكائن الحي متعدد الخلايا Caenorhabditis elegans إلى الكشف عن الأنماط الظاهرية البسيطة أو معدومة في معظم الحالات. لقد وضعنا استراتيجية فحص مستهدفة لتحديد المرافقين المطلوبين لوظيفة محددة وبالتالي سد الفجوة بين النمط الظاهري والوظيفة. على وجه التحديد ، نحن نراقب تفاعلات المرافق الجديدة باستخدام شاشات التفاعل الاصطناعية RNAi ، والتعبير عن المرافق ، ومرافق واحد في وقت واحد ، في الحيوانات التي تحمل طفرة في جين ترميز المرافق أو الإفراط في التعبير عن مرافق من الاهتمام. من خلال تعطيل اثنين من المرافقين التي تقدم بشكل فردي أي النمط الظاهري الإجمالي، يمكننا تحديد المرافقين التي تفاقم أو فضح النمط الظاهري محددة عندما يكون كل من المضطربة. ونحن نثبت أن هذا النهج يمكن تحديد مجموعات محددة من المرافقين التي تعمل معا لتعديل طي مجمعات البروتين أو البروتين المرتبطة النمط الظاهري معين.

استخدام الطفرات الحساسة لدرجة الحرارة في UNC-45 للكشف عن تفاقم أو تخفيف التفاعلات في ظل ظروف متساهلة أو تقييدية، على التوالي تجميع العضلات وصيانتها توفر نظاما فعالا لدراسة التفاعلات المرافق الأنسجة محددة. الوحدة الوظيفية للعضلات المتقلصة، الساركومير، تقدم ترتيبا يشبه البلورية ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

لدراسة مرافق مرافق ومرافق التفاعلات الركيزة، ونحن أداء شاشات التفاعل الاصطناعية في Elegans Caenorhabditis باستخدام تدخل الجيش الملكي النيبالي في تركيبة مع الطفرات الخفيفة أو الإفراط في التعبير عن المرافقين ورصد خلل البروتين الأنسجة محددة على مستوى الكائن الحي.

استخدام Elegans Caenorhabditis إلى الشاشة لتفاعلات Chaperone الأنسجة محددة

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

The overall goal of the following experiment in genetically trackable design Caenorhabditis elegans is to identify tissue-specific chaperone interactions. The main advantage of this technique is that it combines easy to use assays such as fitting Golan AI and behavioral readouts to expose novel tissue specific interactions. For a non-stressful embryo synchronization, use a worm pick to move about 100 eggs from an unsynchronized worm plate to a newly seated NGM plate and cultivate the animals according to the appropriate experimental schedule.When the animals reach the first day of egg-laying, slowly add one milliliter of M9 buffer to the plate, distant to the bacterial lawn, and rotate the plate so that the buffer completely covers the plate. Tilt the plate to one side to remove the liquid and wash the animals from the plate. When all of the worms have been washed from the plate, use a standard plastic pipette tip to cut a square of Agar around where the eggs are concentrated and place the piece of Agar onto a newly seated NGM plate.Cultivate the eggs under the same culture conditions. At the end of the incubation, the plate should be covered with synchronized eggs. After washing all of the animals from the plate as just demonstrated, add one milliliter of fresh M9 buffer and use a cell scraper to release the eggs from the plate.When all of the eggs have been detached, transfer the entire volume of buffer from the plate into a conical tube for centrifugation. Centrifuge the tube and discard the supernatant. After removing the supernatant, add up to one milliliter of fresh M9 buffer to the plate and pipette to resuspend the eggs.Wash the eggs five more times as just demonstrated. After the last wash, the egg pellet should appear white and all but the last 200 microliters of supernatant can be removed. To cultivate synchronized nematodes for an experiment, place a drop of about 30 eggs close to the bacterial lawn and each interference RNA seated plate and about 30 eggs onto a plate seated with empty vector containing bacteria.Then cultivate the animals under the appropriate culture conditions according to the experimental protocol. To assess the embryonic lethality of the synchronized animals, when the animals begin to lay eggs, transfer about 100 eggs to an empty plate and spread the eggs into rows to simplify the counting. After 24 to 48 hours, score the percent of unhatched eggs.For reference, compare the experimental animal eggs to the eggs of animals treated with empty vector control bacteria. To set up a paralysis assay, cultivate age-synchronized animals on empty vector control bacteria, until the animals reach adulthood, but before egg-laying starts. Use a fine marker to draw a line on the back of a regular NGM Agar plate, and place five to ten animals on the marked line.Set a timer for 10 minutes and score the percentage of animals remaining on the line as paralyzed worms. For reference, compare this data to the percentage of mutant animals grown on empty vector control bacteria. For Protein Knockdown Validation, place 250 to 300 synchronized eggs onto a 60 millimeter NGM interference RNA plate seated with the relevant double stranded RNA expressing or empty vector containing bacteria, and cultivate the eggs for the appropriate experimental period.At the end of the incubation, transfer a total of 200 young adult animals into the cap of a 1.5 milliliter tube containing 200 microliters of PBST maintained at the animals cultivation temperature. Close the cap carefully, and centrifuge the animals at 1000 times G for 1 minute. At the end of the centrifugation, add 800 microliters of fresh PBST to the tube and centrifuge the worms again.Carefully remove the top 900 microliters of the supernatant, and wash the nematodes in fresh PBST 3 more times as just demonstrated. After the last wash, remove all but the last 100 microliters of the supernatant and add 25 microliters of 5X sample buffer to the animals. Heat the samples for 10 minutes at 92 degrees Celsius and 1000 revolutions per minute, before loading 20 microliters of each sample onto an SDS page gel.Then perform Western blot analysis using the appropriate antibodies to determine the relative stability of the protein of interest, and use densitometric software to determine the intensity of the bans. HSP6 knocked down during development results in a strong developmental arrest in wild type animals. At the same time, HSP6 knocked down in a muscle specific interference RNA strain expressing wild-type RDE1 in muscle tissue does not cause developmental arrest.Whereas HSP6 knocked down an intestine specific RNAI strain expressing wild type RDE1 in intestinal cells, results in a strong developmental arrest and phenotype. A mutation in HSP6 MG585 that causes a mild growth delay, can, therefore, be used to screen for aggravating or alleviating chaperone interactions by crossing a strain carrying that mutated gene into an intestinal specific interference RNA strain, and screening the chaperone interference RNA library. Myosin organization and UNC45 mutant animals treated with STI1 AHSA1 or DAF41 interference RNA, is similar to that of wild type worms at the fourth larval stage.Although the mutants exhibit disrupted sarcomeres after reaching adulthood. In contrast, both UNC45 mutant animals treated with an empty vector control and wild type animals remain unaffected. Genetic interactions are not indicative of physical interaction.Thus, follow-up experiments using genetic interaction screen must be performed to validate and directly examine the nature of the identified interactions.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

باستخدام الحمض النووي الريبي التي تتوسط استراتيجية التغذية التدخل للكشف عن الجينات المسؤولة عن تنظيم حجم الجسم في نيماتودا<em&gt; C. ايليجانس</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

مكملات غذائية من الأحماض الدهنية غير المشبعة في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A للمسح<em&gt; في فيفو</em&gt; الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

قياس الانخفاض البروتيني البروتيوستيكي الخاص بالأنسجة في إليجانات Caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

النمذجة العمر المرتبطة الأمراض العصبية في Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

استخدام بيانات الدودة المفردة لقياس عدم التجانس في التفاعلات البكتيرية Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...