Name: using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions
Uploaded: 2020-06-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

We danken het Caenorhabditis Genetics Center, gefinancierd door het NIH National Center for Research Resources (NCRR), voor enkele van de nematodenstammen. Monoklonale antilichamen ontwikkeld door H.F. Epstein werden verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de afdeling Biologie, Universiteit van Iowa. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de Israel Science Foundation (subsidie nr. 278/18) en door een subsidie van het Israëlische ministerie van Wetenschap en Technologie, en het ministerie van Buitenlandse Zaken en Internationale Samenwerking, directoraat-generaal voor landenbevordering, Italiaanse Republiek (subsidie nr. 3-14337). We bedanken leden van het Ben-Zvi laboratorium voor hulp bij het voorbereiden van dit manuscript.

1. Bereiding van nematodengroeimediaplaten voor RNAi
<ol><li>Voeg aan een fles van 1 L 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Pepton, 17 g agar en gedestilleerd water tot 1 L en autoclaaf toe.</li>
	<li>Koel fles tot 55 °C.</li>
	<li>Voeg 25 ml 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 ml 1 m CaCl2,1 ml 1 m MgSO4en 1 ml cholesteroloplossing(tabel 1)toe om nematodengroeimedia (NGM) te maken.</li>
	<li>Voeg 1 ml ampicilline (100 mg/ml) en 0,5 ml 1 m IPTG(tabel 1)toe om NGM-RNAi-op...

Een geïntegreerd beeld van het proteostasenetwerk dat weerspiegelt hoe het is georganiseerd en functioneert in verschillende metazoïsche cellen en weefsels ontbreekt nog steeds. Om deze tekortkoming aan te pakken, is specifieke informatie nodig over de interacties van verschillende componenten van dit netwerk, zoals moleculaire chaperones, in specifieke weefsels in de loop van ontwikkeling en veroudering. Hier lieten we zien hoe het gebruik van weefselspecifieke verstoringen ons in staat stelde om het chaperonnenetwerk...

Cellen gaan om met eiwitschade door gebruik te maken van kwaliteitscontrolemachines die beschadigde eiwitten repareren, opsnijven of verwijderen1,2. Vouwen en assembleren van eiwitcomplexen worden ondersteund door moleculaire chaperonnes, een diverse groep van sterk geconserveerde eiwitten die beschadigde eiwitten kunnen herstellen of afslinden3,4,5,6,7. De verwijdering van beschadigde eiwitten wordt gemedieerd door het ubiquitine-proteasoomsysteem (UPS)8 of door de autofagiemachines9 in samenwerking met chaperones10,11,12. Eiwithomeostase (proteostase) wordt daarom in stand gehouden door kwaliteitscontrolenetwerken die bestaan uit vouw- en afbraakmachines3,13. Het begrijpen van de interacties tussen de verschillende componenten van het proteostasenetwerk in vivo is echter een grote uitdaging. Hoewel eiwit-eiwitinteractieschermen belangrijke informatie bijdragen over fysieke interacties en chaperonnecomplexen14,15, ontbreekt het aan inzicht in de organisatie en compensatiemechanismen binnen weefselspecifieke chaperonnenetwerken in vivo.
Genetische interacties worden vaak gebruikt als een krachtig hulpmiddel om de relatie te onderzoeken tussen paren van genen die betrokken zijn bij gemeenschappelijke of compenserende biologische routes16,17,18. Dergelijke relaties kunnen worden gemeten door paren van mutaties te combineren en de impact van een mutatie in één gen op de fenotypische ernst veroorzaakt door een mutatie in het tweede gen te kwantificeren16. Hoewel de meeste van dergelijke combinaties geen effect hebben in termen van fenotype, kunnen sommige genetische interacties de ernst van het gemeten fenotype verergeren of verlichten. Verergerende mutaties worden waargenomen wanneer het fenotype van de dubbele deletiemutant ernstiger is dan het verwachte fenotype dat wordt gezien bij het combineren van de mutanten met enkele deletie, wat impliceert dat de twee genen in parallelle routes functioneren, samen een bepaalde functie beïnvloeden. Daarentegen worden verlichtende mutaties waargenomen wanneer het fenotype van de dubbele deletiemutant minder ernstig is dan het fenotype dat wordt gezien met de mutanten met enkele deletie, wat impliceert dat de twee genen samen als een complex werken of deelnemen aan dezelfde route16,18. Dienovereenkomstig zijn diverse fenotypen die kunnen worden gekwantificeerd, waaronder brede fenotypen, zoals letaliteit, groeisnelheden en broedgrootte, evenals specifieke fenotypen, zoals transcriptionele verslaggevers, gebruikt om genetische interacties te identificeren. Jonikas et al. vertrouwden bijvoorbeeld op een ER-stressverslaggever om interacties van het Saccharomyces cerevisiae ER ontvouwde eiwitresponsproteostase-netwerk te onderzoeken met behulp van paarsgewijze gendeletieanalyses19.
Genetische interactieschermen omvatten het systematisch kruisen van paarsgewijze deletiemutaties om een uitgebreide set dubbele mutanten te genereren20. In diermodellen, en specifiek in C. elegans, is deze grootschalige aanpak echter niet haalbaar. In plaats daarvan kunnen gemuteerde stammen worden getest op hun genetische interactiepatronen door genexpressie te downreguleren met behulp van RNA-interferentie (RNAi)21. C. elegans is een krachtig systeem voor schermen op basis van RNAi22,23. In C. eleganswordt dubbelstrengs RNA (dsRNA) levering bereikt door bacteriële voeding, wat leidt tot de verspreiding van dsRNA-moleculen naar talrijke weefsels. Op deze manier beïnvloeden de geïntroduceerde dsRNA-moleculen het dier via een snelle en eenvoudige procedure21. Een genetische interactiescreening met behulp van RNAi kan daarom de impact onthullen van het downreguleren van een set genen of de meeste C. elegans-coderende genen met behulp van RNAi-bibliotheken24. In zo'n scherm zijn hits die van invloed zijn op het gedrag van de mutant van belang, maar niet de wildtype stam potentiële modifiers van het fenotype die worden gecontroleerd25. Hier passen we een combinatie van mutaties en RNAi-screening toe om systematisch weefselspecifieke chaperonne-interacties in C. elegansin kaart te brengen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

Correcte vouwing en assemblage van eiwitten en eiwitcomplexen zijn essentieel voor de cellulaire functie. Cellen maken gebruik van kwaliteitscontroleroutes die beschadigde eiwitten corrigeren, sequesteren of elimineren om een gezond proteoom te behouden, waardoor cellulaire proteostase wordt gewaarborgd en verdere eiwitschade wordt voorkomen. Vanwege redundante functies binnen het proteostasenetwerk resulteert screening op detecteerbare fenotypes met behulp van knockdown of mutaties in chaperonne-coderende genen in het meercellige organisme Caenorhabditis elegans in de meeste gevallen in de detectie van kleine of geen fenotypen. We hebben een gerichte screeningsstrategie ontwikkeld om chaperones te identificeren die nodig zijn voor een specifieke functie en zo de kloof tussen fenotype en functie te overbruggen. In het bijzonder monitoren we nieuwe chaperonne-interacties met behulp van synthetische interactieschermen van RNAi, knock-down chaperone-expressie, één chaperone tegelijk, bij dieren die een mutatie dragen in een chaperonne-coderend gen of een chaperonne van belang overexpressie. Door twee chaperones te verstoren die individueel geen grof fenotype vertonen, kunnen we chaperones identificeren die een specifiek fenotype verergeren of blootleggen wanneer beide verstoord zijn. We tonen aan dat deze benadering specifieke sets chaperones kan identificeren die samen functioneren om de vouwing van een eiwit of eiwitcomplexen geassocieerd met een bepaald fenotype te moduleren.

Gebruik van temperatuurgevoelige mutaties in UNC-45 om te screenen op verergerende of verlichtende interacties onder respectievelijk tolerante of beperkende omstandigheden Spierassemblage en -onderhoud bieden een effectief systeem om weefselspecifieke chaperonne-interacties te bestuderen. De functionele eenheid van contractiele spieren, het sarcomeer, presenteert een kristallijne opstelling van structurele en regulerende eiwitten. De stabiliteit van het motoreiwit myosine en de opname ervan in de dikk...

Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Om chaperonne-chaperonne- en chaperonne-substraatinteracties te bestuderen, voeren we synthetische interactiescreenings uit in Caenorhabditis elegans met behulp van RNA-interferentie in combinatie met milde mutaties of overexpressie van chaperonnes en monitoren we weefselspecifieke eiwitdisfunctie op organismaal niveau.

Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

The overall goal of the following experiment in genetically trackable design Caenorhabditis elegans is to identify tissue-specific chaperone interactions. The main advantage of this technique is that it combines easy to use assays such as fitting Golan AI and behavioral readouts to expose novel tissue specific interactions. For a non-stressful embryo synchronization, use a worm pick to move about 100 eggs from an unsynchronized worm plate to a newly seated NGM plate and cultivate the animals according to the appropriate experimental schedule.When the animals reach the first day of egg-laying, slowly add one milliliter of M9 buffer to the plate, distant to the bacterial lawn, and rotate the plate so that the buffer completely covers the plate. Tilt the plate to one side to remove the liquid and wash the animals from the plate. When all of the worms have been washed from the plate, use a standard plastic pipette tip to cut a square of Agar around where the eggs are concentrated and place the piece of Agar onto a newly seated NGM plate.Cultivate the eggs under the same culture conditions. At the end of the incubation, the plate should be covered with synchronized eggs. After washing all of the animals from the plate as just demonstrated, add one milliliter of fresh M9 buffer and use a cell scraper to release the eggs from the plate.When all of the eggs have been detached, transfer the entire volume of buffer from the plate into a conical tube for centrifugation. Centrifuge the tube and discard the supernatant. After removing the supernatant, add up to one milliliter of fresh M9 buffer to the plate and pipette to resuspend the eggs.Wash the eggs five more times as just demonstrated. After the last wash, the egg pellet should appear white and all but the last 200 microliters of supernatant can be removed. To cultivate synchronized nematodes for an experiment, place a drop of about 30 eggs close to the bacterial lawn and each interference RNA seated plate and about 30 eggs onto a plate seated with empty vector containing bacteria.Then cultivate the animals under the appropriate culture conditions according to the experimental protocol. To assess the embryonic lethality of the synchronized animals, when the animals begin to lay eggs, transfer about 100 eggs to an empty plate and spread the eggs into rows to simplify the counting. After 24 to 48 hours, score the percent of unhatched eggs.For reference, compare the experimental animal eggs to the eggs of animals treated with empty vector control bacteria. To set up a paralysis assay, cultivate age-synchronized animals on empty vector control bacteria, until the animals reach adulthood, but before egg-laying starts. Use a fine marker to draw a line on the back of a regular NGM Agar plate, and place five to ten animals on the marked line.Set a timer for 10 minutes and score the percentage of animals remaining on the line as paralyzed worms. For reference, compare this data to the percentage of mutant animals grown on empty vector control bacteria. For Protein Knockdown Validation, place 250 to 300 synchronized eggs onto a 60 millimeter NGM interference RNA plate seated with the relevant double stranded RNA expressing or empty vector containing bacteria, and cultivate the eggs for the appropriate experimental period.At the end of the incubation, transfer a total of 200 young adult animals into the cap of a 1.5 milliliter tube containing 200 microliters of PBST maintained at the animals cultivation temperature. Close the cap carefully, and centrifuge the animals at 1000 times G for 1 minute. At the end of the centrifugation, add 800 microliters of fresh PBST to the tube and centrifuge the worms again.Carefully remove the top 900 microliters of the supernatant, and wash the nematodes in fresh PBST 3 more times as just demonstrated. After the last wash, remove all but the last 100 microliters of the supernatant and add 25 microliters of 5X sample buffer to the animals. Heat the samples for 10 minutes at 92 degrees Celsius and 1000 revolutions per minute, before loading 20 microliters of each sample onto an SDS page gel.Then perform Western blot analysis using the appropriate antibodies to determine the relative stability of the protein of interest, and use densitometric software to determine the intensity of the bans. HSP6 knocked down during development results in a strong developmental arrest in wild type animals. At the same time, HSP6 knocked down in a muscle specific interference RNA strain expressing wild-type RDE1 in muscle tissue does not cause developmental arrest.Whereas HSP6 knocked down an intestine specific RNAI strain expressing wild type RDE1 in intestinal cells, results in a strong developmental arrest and phenotype. A mutation in HSP6 MG585 that causes a mild growth delay, can, therefore, be used to screen for aggravating or alleviating chaperone interactions by crossing a strain carrying that mutated gene into an intestinal specific interference RNA strain, and screening the chaperone interference RNA library. Myosin organization and UNC45 mutant animals treated with STI1 AHSA1 or DAF41 interference RNA, is similar to that of wild type worms at the fourth larval stage.Although the mutants exhibit disrupted sarcomeres after reaching adulthood. In contrast, both UNC45 mutant animals treated with an empty vector control and wild type animals remain unaffected. Genetic interactions are not indicative of physical interaction.Thus, follow-up experiments using genetic interaction screen must be performed to validate and directly examine the nature of the identified interactions.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Gebruik<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Een Screenbare<em&gt; In Vivo</em&gt; Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modellering van leeftijdsgegende neurodegeneratieve ziekten bij Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Aggregaatkwantificering automatiseren bij Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Gegevens met één worm gebruiken om heterogeniteit in caenorhabditis elegans-bacteriële interacties te kwantificeren

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...