Name: using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions
Uploaded: 2020-06-07T14:00:00
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私たちは、線虫株の一部のために、NIH国立研究資源センター(NCRR)が資金を提供するカエネルハブディティス遺伝学センターに感謝します。H.F. エプスタインによって開発されたモノクローナル抗体は、NICHDの後援の下で開発され、アイオワ大学生物学部によって維持された開発研究ハイブリドーマ銀行から得られました。本研究は、イスラエル科学財団(278/18)、イスラエル科学技術省、外務省、イタリア共和国国振興総局(助成金第3-14337)からの助成金によって支援されました。この原稿の作成に協力を寄せられるよう、Ben-Zvi研究室のメンバーに感謝します。

1. RNAi用線虫増殖培地プレートの製造
<ol><li>1 Lボトルに、NaClの3g、バクトペプトンの2.5g、寒天17g、蒸留水1Lとオートクレーブを加えます。</li>
	<li>55°Cに冷却ボトル。</li>
	<li>25 mLの1 M KH2PO4、pH6.0、1 M CaCl2の1 mL、1 M MgSO4の1 mL、コレステロール溶液1 mL(表1)を加え、線虫増殖培地(NGM)を作る。</li>
	<li>1 mL のアンピシリン (100 mg/mL) と 0.5 mL の 1 M IPTG (<stro...

プロテオスタシスネットワークの統合画像は、それがどのように組織化され、異なるメタゾアン細胞および組織で機能するかを反映しています。この欠点に対処するためには、開発や老化の過程で、分子シャペロンなどのこのネットワークの様々な構成要素の相互作用に関する具体的な情報が必要です。ここでは、組織特異的摂動を使用して、特定の組織におけるシャペロンネットワークを?...

細胞は、損傷したタンパク質1,2を修復、隔離、除去する品質管理機械を採用することで、タンパク質の損傷に対処する。タンパク質複合体の折りたたみおよび組立は、分子シャペロンによって支持され、損傷したタンパク質3、4、5、6、7を修復または隔離することができる高度に保存されたタンパク質の多様なグループである。損傷したタンパク質の除去は、ユビキチンプロテアソーム系(UPS)8またはオートファジー機械9によってシャペロン10、11、12との協調で媒介される。タンパク質ホメオスタシス(プロテオスタシス)は、従って、折りたたみおよび分解機3,13からなる品質管理ネットワークによって維持される。しかし、生体内のプロテオスタシスネットワークの様々な成分間の相互作用を理解することは大きな課題です。タンパク質とタンパク質の相互作用スクリーンは、物理的相互作用とシャペロン複合体14,15に関する重要な情報を提供する一方で、生体内の組織特異的シャペロンネットワーク内の組織および補償機構を理解することは欠けている。
遺伝的相互作用は、一般的なまたは代償的な生物学的経路16、17、18に関与する遺伝子のペア間の関係を調べるための強力なツールとしてしばしば使用される。このような関係は、2番目の遺伝子16の突然変異によって引き起こされる表向きの重症度に対する1つの遺伝子における突然変異の一対を組み合わせることによって測定することができる。そのような組み合わせのほとんどは表現型の面で効果を示さないが、いくつかの遺伝的相互作用は、測定された表現型の重症度を悪化させるか、または緩和することができる。二重欠失変異体の表現型が単一欠失変異体を組み合わせた際に見られる予想より重篤な場合に、悪化する変異が観察され、2つの遺伝子が並列経路で機能し、一緒に特定の機能に影響を与える。これに対し、二重欠失変異体の表現型が単一欠失変異体に見られる表現型よりも重症でない場合に緩和突然変異が観察され、2つの遺伝子が複合体として作用するか、あるいは同じ経路16,18に関与することを示唆する。したがって、致死性、増殖速度およびブロードサイズなどの広範な表現型、ならびに転写レポーターなどの特定の表現型を含む、定量化できる多様な表現型が、遺伝的相互作用を同定するために使用されてきた。例えば、Jonikasらの研究は、ペアワイズ遺伝子欠失解析を用いて、サッカロマイセスCErevisiae ER展開タンパク質応答プロテオスタシスネットワークの相互作用を調べるためにERストレスレポーターに依存していた19。
遺伝的相互作用画面は、二重変異体20の包括的なセットを生成するために体系的にペアワイズ欠失突然変異を交差することを含む。しかし、動物モデル、特にC.エレガンスでは、この大規模なアプローチは実現不可能です。代わりに、変異株は、RNA干渉(RNAi)21を用いて遺伝子発現を下方調節することによって、それらの遺伝的相互作用パターンについて試験することができる。C. エレガンスは RNAi22、23に基づくスクリーンのための強力なシステムです。C.エレガンスでは、二本鎖RNA(dsRNA)の送達は細菌の供給によって達成され、dsRNA分子が多数の組織に広がった。このようにして、導入されたdsRNA分子は、迅速かつ簡単な手順21を介して動物に影響を与える。したがって、RNAiを用いた遺伝的相互作用スクリーンは、RNAiライブラリ24を用いて遺伝子またはほとんどのC.エレガンスコード遺伝子の一組をダウンレギュリングすることの影響を明らかにすることができる。このような画面では、対象の変異体の挙動に影響を与えるが、野生型株は影響しないヒットは、監視されている表現型の潜在的な修飾子である25.ここでは、変異とRNAiスクリーニングの組み合わせを適用して、C.エレガンスにおける組織特異的シャペロン相互作用を体系的にマッピングする。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

細胞機能には、タンパク質およびタンパク質複合体の正しい折り畳みと組み立てが不可欠です。細胞は、損傷したタンパク質を正し、隔離し、または排除する品質管理経路を採用して、健康なプロテオームを維持し、細胞プロテオスタシスを確保し、さらなるタンパク質損傷を防ぎます。プロテオスタシスネットワーク内の冗長な機能のため、多細胞生物 カエノルハブディティス・エレガン スにおけるノックダウンまたはシャペロンコード遺伝子の変異を用いて検出可能な表現型のスクリーニングは、ほとんどの場合、マイナーまたは全く表現型の検出をもたらす。特定の機能に必要なシャペロンを同定し、表現型と機能のギャップを埋める目的でスクリーニング戦略を策定しました。具体的には、RNAi合成相互作用スクリーンを用いた新規シャペロン相互作用、ノックダウンシャペロン発現、一度に1つのシャペロン発現、シャペロンコード遺伝子の変異を運ぶ動物、または目的のシャペロンを過剰発現する動物を監視する。個々にグロス表現型を呈しない2つのシャペロンを破壊することによって、我々は両方が摂動したときに特定の表現型を悪化させるか、または暴露するシャペロンを同定することができる。我々は、このアプローチが、特定の表現型に関連するタンパク質またはタンパク質複合体の折り畳みを調節するために一緒に機能するシャペロンの特定のセットを同定できることを実証する。

UNC-45の温度感受性変異を使用して、許容的または制限的な条件下での相互作用を悪化または緩和するためのスクリーニング 筋肉のアセンブリとメンテナンスは、組織特異的なシャペロン相互作用を研究する効果的なシステムを提供します。収縮性筋肉の機能的単位であるサルコメアは、構造タンパク質と調節タンパク質の結晶状の配置を示す。運動タンパク質ミオシンの安定?...

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Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス の合成相互作用スクリーンを行い、組織レベルで組織特異的タンパク質機能不全を監視する。

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

The overall goal of the following experiment in genetically trackable design Caenorhabditis elegans is to identify tissue-specific chaperone interactions. The main advantage of this technique is that it combines easy to use assays such as fitting Golan AI and behavioral readouts to expose novel tissue specific interactions. For a non-stressful embryo synchronization, use a worm pick to move about 100 eggs from an unsynchronized worm plate to a newly seated NGM plate and cultivate the animals according to the appropriate experimental schedule.When the animals reach the first day of egg-laying, slowly add one milliliter of M9 buffer to the plate, distant to the bacterial lawn, and rotate the plate so that the buffer completely covers the plate. Tilt the plate to one side to remove the liquid and wash the animals from the plate. When all of the worms have been washed from the plate, use a standard plastic pipette tip to cut a square of Agar around where the eggs are concentrated and place the piece of Agar onto a newly seated NGM plate.Cultivate the eggs under the same culture conditions. At the end of the incubation, the plate should be covered with synchronized eggs. After washing all of the animals from the plate as just demonstrated, add one milliliter of fresh M9 buffer and use a cell scraper to release the eggs from the plate.When all of the eggs have been detached, transfer the entire volume of buffer from the plate into a conical tube for centrifugation. Centrifuge the tube and discard the supernatant. After removing the supernatant, add up to one milliliter of fresh M9 buffer to the plate and pipette to resuspend the eggs.Wash the eggs five more times as just demonstrated. After the last wash, the egg pellet should appear white and all but the last 200 microliters of supernatant can be removed. To cultivate synchronized nematodes for an experiment, place a drop of about 30 eggs close to the bacterial lawn and each interference RNA seated plate and about 30 eggs onto a plate seated with empty vector containing bacteria.Then cultivate the animals under the appropriate culture conditions according to the experimental protocol. To assess the embryonic lethality of the synchronized animals, when the animals begin to lay eggs, transfer about 100 eggs to an empty plate and spread the eggs into rows to simplify the counting. After 24 to 48 hours, score the percent of unhatched eggs.For reference, compare the experimental animal eggs to the eggs of animals treated with empty vector control bacteria. To set up a paralysis assay, cultivate age-synchronized animals on empty vector control bacteria, until the animals reach adulthood, but before egg-laying starts. Use a fine marker to draw a line on the back of a regular NGM Agar plate, and place five to ten animals on the marked line.Set a timer for 10 minutes and score the percentage of animals remaining on the line as paralyzed worms. For reference, compare this data to the percentage of mutant animals grown on empty vector control bacteria. For Protein Knockdown Validation, place 250 to 300 synchronized eggs onto a 60 millimeter NGM interference RNA plate seated with the relevant double stranded RNA expressing or empty vector containing bacteria, and cultivate the eggs for the appropriate experimental period.At the end of the incubation, transfer a total of 200 young adult animals into the cap of a 1.5 milliliter tube containing 200 microliters of PBST maintained at the animals cultivation temperature. Close the cap carefully, and centrifuge the animals at 1000 times G for 1 minute. At the end of the centrifugation, add 800 microliters of fresh PBST to the tube and centrifuge the worms again.Carefully remove the top 900 microliters of the supernatant, and wash the nematodes in fresh PBST 3 more times as just demonstrated. After the last wash, remove all but the last 100 microliters of the supernatant and add 25 microliters of 5X sample buffer to the animals. Heat the samples for 10 minutes at 92 degrees Celsius and 1000 revolutions per minute, before loading 20 microliters of each sample onto an SDS page gel.Then perform Western blot analysis using the appropriate antibodies to determine the relative stability of the protein of interest, and use densitometric software to determine the intensity of the bans. HSP6 knocked down during development results in a strong developmental arrest in wild type animals. At the same time, HSP6 knocked down in a muscle specific interference RNA strain expressing wild-type RDE1 in muscle tissue does not cause developmental arrest.Whereas HSP6 knocked down an intestine specific RNAI strain expressing wild type RDE1 in intestinal cells, results in a strong developmental arrest and phenotype. A mutation in HSP6 MG585 that causes a mild growth delay, can, therefore, be used to screen for aggravating or alleviating chaperone interactions by crossing a strain carrying that mutated gene into an intestinal specific interference RNA strain, and screening the chaperone interference RNA library. Myosin organization and UNC45 mutant animals treated with STI1 AHSA1 or DAF41 interference RNA, is similar to that of wild type worms at the fourth larval stage.Although the mutants exhibit disrupted sarcomeres after reaching adulthood. In contrast, both UNC45 mutant animals treated with an empty vector control and wild type animals remain unaffected. Genetic interactions are not indicative of physical interaction.Thus, follow-up experiments using genetic interaction screen must be performed to validate and directly examine the nature of the identified interactions.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

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基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

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線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

多価不飽和脂肪酸の食事補給<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

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スクリーニング可能<em&gt;インビボ</em&gt;トランスジェニック生物発光を使用したミトコンドリアモジュレーターについてのアッセイ<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

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線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

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カエノハブディティス・エレガンスにおける組織特異的プロテオスタティック低下の定量化

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

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Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

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A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

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単一ワームデータを使用して 、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...