Name: using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions
Uploaded: 2020-06-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

Vi takker Caenorhabditis Genetics Center, finansiert av NIH National Center for Research Resources (NCRR), for noen av nematodestammene. Monoklonale antistoffer utviklet av H.F. Epstein ble hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank utviklet i regi av NICHD og vedlikeholdt av Institutt for biologi, Universitetet i Iowa. Denne forskningen ble støttet av et stipend fra Israel Science Foundation (tilskudd nr. 278/18) og av et tilskudd fra Israels vitenskapsdepartement, og Utenriksdepartementet og internasjonalt samarbeid, Generaldirektoratet for landfremming, Den italienske republikk (tilskudd nr. 3-14337). Vi takker medlemmer av Ben-Zvi-laboratoriet for hjelp til å forberede dette manuskriptet.

1. Utarbeidelse av nematode vekstmedieplater for RNAi
<ol><li>Til en 1 L flaske, tilsett 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar og destillert vann opp til 1 L og autoklav.</li>
	<li>Avkjøl flasken til 55 °C.</li>
	<li>Tilsett 25 ml 1 M KH2PO4, pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4og 1 ml kolesteroloppløsning (tabell 1) for å lage nematodevekstmedier (NGM).</li>
	<li>Tilsett 1 ml ampicillin (100 mg/ml) og 0,5 ml 1 M IPTG (tabell 1) for ...

Et integrert bilde av proteostasenettverket som reflekterer hvordan det er organisert og fungerer i forskjellige metazoanske celler og vev, mangler fortsatt. For å løse denne mangelen er det nødvendig med spesifikk informasjon om samspillet mellom ulike komponenter i dette nettverket, for eksempel molekylære anstander, i bestemte vev i løpet av utvikling og aldring. Her viste vi hvordan bruk av vevsspesifikke perturbasjoner gjorde det mulig for oss å undersøke anstandsnettverket i et gitt vev. For å utforske vevs...

Celler takler proteinskader ved å bruke kvalitetskontrollmaskiner som reparerer, beslaglegger eller fjerner skadede proteiner1,2. Folding og montering av proteinkomplekser støttes av molekylære anstander, en mangfoldig gruppe svært konserverte proteiner som kan reparere eller sequester skadede proteiner3,4,5,6,7. Fjerning av skadede proteiner formidles av ubiquitin-proteasome systemet (UPS)8 eller av autofagi maskineri9 i samarbeid med chaperones10,11,12. Protein homeostase (proteostase) opprettholdes derfor av kvalitetskontrollnettverk som består av folde- og nedbrytningsmaskiner3,13. Det er imidlertid en stor utfordring å forstå samspillet mellom de ulike komponentene i proteostasenettverket in vivo. Mens proteinprotein interaksjonsskjermer bidrar med viktig informasjon om fysiske interaksjoner og anstandskomplekser14,15, mangler det å forstå organisasjonen og kompenserende mekanismer innen vevsspesifikke anstandsnettverk in vivo.
Genetiske interaksjoner brukes ofte som et kraftig verktøy for å undersøke forholdet mellom par gener som er involvert i vanlige eller kompenserende biologiske veier16,17,18. Slike forhold kan måles ved å kombinere par mutasjoner og kvantifisere virkningen av en mutasjon i ett gen på fenotypisk alvorlighetsgrad forårsaket av en mutasjon i det andre genet16. Mens de fleste slike kombinasjoner ikke viser noen effekt når det gjelder fenotype, kan noen genetiske interaksjoner enten forverre eller lindre alvorlighetsgraden av den målte fenotypen. Skjerpende mutasjoner observeres når fenotypen til den doble slettingsmutanten er mer alvorlig enn den forventede fenotypen sett ved å kombinere de enkle slettingsmutantene, noe som antyder at de to genene fungerer parallelt, sammen påvirker en gitt funksjon. Til sammenligning observeres lindrende mutasjoner når fenotypen til den doble slettingsmutanten er mindre alvorlig enn fenotypen sett med de enkelte slettingsmutantene, noe som antyder at de to genene fungerer sammen som et kompleks eller deltar i samme vei16,18. Følgelig har forskjellige fenotyper som kan kvantifiseres, inkludert brede fenotyper, som dødelighet, vekstrater og brødstørrelse, samt spesifikke fenotyper, som transkripsjonelle reportere, blitt brukt til å identifisere genetiske interaksjoner. For eksempel stolte Jonikas et al. på en ER stressreporter for å undersøke interaksjoner mellom Saccharomyces cerevisiae ER utfoldet proteinresponsproteostasenettverk ved hjelp av parvise genslettingsanalyser19.
Genetiske interaksjonsskjermer innebærer systematisk kryssing av parvis sletting av mutasjoner for å generere et omfattende sett med doble mutanter20. Men i dyremodeller, og spesielt i C. elegans, er denne store tilnærmingen ikke mulig. I stedet kan mutante stammer testes for deres genetiske interaksjonsmønstre ved å regulere genuttrykket ned ved hjelp av RNA-interferens (RNAi)21. C. elegans er et kraftig system for skjermer basert på RNAi22,23. I C. elegansoppnås dobbeltstrenget RNA (dsRNA) levering ved bakteriell fôring, noe som fører til spredning av dsRNA-molekyler til mange vev. På denne måten påvirker de introduserte dsRNA-molekylene dyret via en rask og enkel prosedyre21. En genetisk interaksjonsskjerm ved hjelp av RNAi kan derfor avsløre virkningen av å regulere et sett med gener eller de fleste C. elegans-kodegener ved hjelp av RNAi-biblioteker24. I en slik skjerm, treff som påvirker oppførselen til mutanten av interesse, men ikke den ville typen belastning er potensielle modifikatorer av fenotypen som overvåkes25. Her bruker vi en kombinasjon av mutasjoner og RNAi screening for systematisk å kartlegge vevsspesifikke anstandsinteraksjoner i C. elegans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

Korrekt folding og montering av proteiner og proteinkomplekser er avgjørende for cellulær funksjon. Celler bruker kvalitetskontrollveier som korrigerer, fanger eller eliminerer skadede proteiner for å opprettholde et sunt proteom, og sikrer dermed cellulær proteostase og forhindrer ytterligere proteinskade. På grunn av redundante funksjoner i proteostasenettverket, screening for påvisbare fenotyper ved hjelp av knockdown eller mutasjoner i anstandskodingsgener i den multicellulære organismen Caenorhabditis elegans resulterer i påvisning av mindre eller ingen fenotyper i de fleste tilfeller. Vi har utviklet en målrettet screeningstrategi for å identifisere anstander som kreves for en bestemt funksjon og dermed bygge bro mellom fenotype og funksjon. Spesielt overvåker vi nye anstandsinteraksjoner ved hjelp av RNAi syntetiske interaksjonsskjermer, knocking-down chaperone uttrykk, en anstand om gangen, hos dyr som bærer en mutasjon i et anstandskodingsgen eller over-uttrykker en anstand av interesse. Ved å forstyrre to anstander som individuelt ikke presenterer noen grov fenotype, kan vi identifisere anstander som forverrer eller eksponerer en bestemt fenotype når begge er forstyrret. Vi viser at denne tilnærmingen kan identifisere spesifikke sett med anstander som fungerer sammen for å modulere foldingen av et protein- eller proteinkomplekser forbundet med en gitt fenotype.

Bruke temperaturfølsomme mutasjoner i UNC-45 til å screene for å forverre eller lindre interaksjoner under tillatte eller restriktive forhold, henholdsvis Muskelmontering og vedlikehold tilbyr et effektivt system for å studere vevsspesifikke anstandsinteraksjoner. Den funksjonelle enheten av kontraktil muskler, sarcomere, presenterer et krystallinsk-lignende arrangement av strukturelle og regulatoriske proteiner. Stabiliteten til motorproteinet myosin og dets inkorporering i de tykke filamentene a...

Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

For å studere chaperone-chaperone og chaperone-substrat interaksjoner, utfører vi syntetiske interaksjonsskjermer i Caenorhabditis elegans ved hjelp av RNA-interferens i kombinasjon med milde mutasjoner eller overuttrykk av anstander og overvåker vevsspesifikk proteindysfunksjon på organismenivå.

Bruke Caenorhabditis elegans til å screene for vevsspesifikke chaperone interaksjoner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

The overall goal of the following experiment in genetically trackable design Caenorhabditis elegans is to identify tissue-specific chaperone interactions. The main advantage of this technique is that it combines easy to use assays such as fitting Golan AI and behavioral readouts to expose novel tissue specific interactions. For a non-stressful embryo synchronization, use a worm pick to move about 100 eggs from an unsynchronized worm plate to a newly seated NGM plate and cultivate the animals according to the appropriate experimental schedule.When the animals reach the first day of egg-laying, slowly add one milliliter of M9 buffer to the plate, distant to the bacterial lawn, and rotate the plate so that the buffer completely covers the plate. Tilt the plate to one side to remove the liquid and wash the animals from the plate. When all of the worms have been washed from the plate, use a standard plastic pipette tip to cut a square of Agar around where the eggs are concentrated and place the piece of Agar onto a newly seated NGM plate.Cultivate the eggs under the same culture conditions. At the end of the incubation, the plate should be covered with synchronized eggs. After washing all of the animals from the plate as just demonstrated, add one milliliter of fresh M9 buffer and use a cell scraper to release the eggs from the plate.When all of the eggs have been detached, transfer the entire volume of buffer from the plate into a conical tube for centrifugation. Centrifuge the tube and discard the supernatant. After removing the supernatant, add up to one milliliter of fresh M9 buffer to the plate and pipette to resuspend the eggs.Wash the eggs five more times as just demonstrated. After the last wash, the egg pellet should appear white and all but the last 200 microliters of supernatant can be removed. To cultivate synchronized nematodes for an experiment, place a drop of about 30 eggs close to the bacterial lawn and each interference RNA seated plate and about 30 eggs onto a plate seated with empty vector containing bacteria.Then cultivate the animals under the appropriate culture conditions according to the experimental protocol. To assess the embryonic lethality of the synchronized animals, when the animals begin to lay eggs, transfer about 100 eggs to an empty plate and spread the eggs into rows to simplify the counting. After 24 to 48 hours, score the percent of unhatched eggs.For reference, compare the experimental animal eggs to the eggs of animals treated with empty vector control bacteria. To set up a paralysis assay, cultivate age-synchronized animals on empty vector control bacteria, until the animals reach adulthood, but before egg-laying starts. Use a fine marker to draw a line on the back of a regular NGM Agar plate, and place five to ten animals on the marked line.Set a timer for 10 minutes and score the percentage of animals remaining on the line as paralyzed worms. For reference, compare this data to the percentage of mutant animals grown on empty vector control bacteria. For Protein Knockdown Validation, place 250 to 300 synchronized eggs onto a 60 millimeter NGM interference RNA plate seated with the relevant double stranded RNA expressing or empty vector containing bacteria, and cultivate the eggs for the appropriate experimental period.At the end of the incubation, transfer a total of 200 young adult animals into the cap of a 1.5 milliliter tube containing 200 microliters of PBST maintained at the animals cultivation temperature. Close the cap carefully, and centrifuge the animals at 1000 times G for 1 minute. At the end of the centrifugation, add 800 microliters of fresh PBST to the tube and centrifuge the worms again.Carefully remove the top 900 microliters of the supernatant, and wash the nematodes in fresh PBST 3 more times as just demonstrated. After the last wash, remove all but the last 100 microliters of the supernatant and add 25 microliters of 5X sample buffer to the animals. Heat the samples for 10 minutes at 92 degrees Celsius and 1000 revolutions per minute, before loading 20 microliters of each sample onto an SDS page gel.Then perform Western blot analysis using the appropriate antibodies to determine the relative stability of the protein of interest, and use densitometric software to determine the intensity of the bans. HSP6 knocked down during development results in a strong developmental arrest in wild type animals. At the same time, HSP6 knocked down in a muscle specific interference RNA strain expressing wild-type RDE1 in muscle tissue does not cause developmental arrest.Whereas HSP6 knocked down an intestine specific RNAI strain expressing wild type RDE1 in intestinal cells, results in a strong developmental arrest and phenotype. A mutation in HSP6 MG585 that causes a mild growth delay, can, therefore, be used to screen for aggravating or alleviating chaperone interactions by crossing a strain carrying that mutated gene into an intestinal specific interference RNA strain, and screening the chaperone interference RNA library. Myosin organization and UNC45 mutant animals treated with STI1 AHSA1 or DAF41 interference RNA, is similar to that of wild type worms at the fourth larval stage.Although the mutants exhibit disrupted sarcomeres after reaching adulthood. In contrast, both UNC45 mutant animals treated with an empty vector control and wild type animals remain unaffected. Genetic interactions are not indicative of physical interaction.Thus, follow-up experiments using genetic interaction screen must be performed to validate and directly examine the nature of the identified interactions.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grunnleggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og observasjon

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Bruke RNA-mediert interferens fôringsstrategi til skjerm for gener involvert i Body Size forordning i nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Tilskudd av flerumettede fettsyrer i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

En silbart<em&gt; I Vivo</em&gt; Analyse for mitokondrie modulatorer Bruke Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Metoder for å studere endringer i iboende Protein samling med alder i Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Kvantifiserende vevsspesifikk proteostatisk nedgang i caenorhabditt elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modellering Alder-Assosiert Neurodegenerative Sykdommer i Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisere aggregert kvantifisering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Bruke single-worm data for å kvantifisere heterogenitet i Caenorhabditis elegans-bakterielle interaksjoner

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...