Name: using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions
Uploaded: 2020-06-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis, финансируемый Национальным центром исследовательских ресурсов NIH (NCRR), за некоторые штаммы нематод. Моноклональные антитела, разработанные Х.Ф. Эпштейном, были получены из Банка исследований развития Hybridoma, разработанного под эгидой NICHD и поддерживаемого кафедрой биологии Университета Айовы. Это исследование было поддержано грантом Израильского научного фонда (грант No 278/18) и грантом Министерства науки и технологий Израиля и Министерства иностранных дел и международного сотрудничества, Главного управления по продвижению стран, Итальянская Республика (грант No 3-14337). Благодарим сотрудников лаборатории Бен-Цви за помощь в подготовке этой рукописи.

1. Подготовка пластин среды роста нематод для РНКи
<ol><li>К флакону объемом 1 л добавить 3 г NaCl, 2,5 г бакто-пептона, 17 г агара и дистиллированную воду до 1 л и автоклав.</li>
	<li>Охладите бутылку до 55 °C.</li>
	<li>Добавьте 25 мл 1 М КХ2ПО4,рН 6,0, 1 мл 1 М CaCl2, 1 мл 1 М МгСО4и 1 мл раствора холесте?...

Интегрированная картина сети протеостаза, отражающая, как она организована и функционирует в различных метазойных клетках и тканях, по-прежнему отсутствует. Для устранения этого недостатка требуется конкретная информация о взаимодействиях различных компонентов этой сети, таких как ?...

Клетки справляются с повреждением белка, используя механизмы контроля качества, которые восстанавливают, изолируют или удаляют любые поврежденные белки1,2. Сворачивание и сборка белковых комплексов поддерживаются молекулярными шаперонами, разнообразной группой высокосохраняемых белков, которые могут восстанавливать или секвестрировать поврежденные белки3,4,5,6,7. Удаление поврежденных белков опосредовано убиквитин-протеасомной системой (UPS)8 или механизмом аутофагии9 в сотрудничестве с шаперонами10,11,12. Таким образом, белковый гомеостаз (протеостаз) поддерживается сетями контроля качества, состоящими из механизмов сворачивания и деградации3,13. Однако понимание взаимодействия между различными компонентами сети протеостаза in vivo является серьезной проблемой. В то время как экраны белково-белкового взаимодействия вносят важную информацию о физических взаимодействиях и шапероновых комплексах14,15,понимание организации и компенсаторных механизмов в тканеспецифических шапероновых сетях in vivo отсутствует.
Генетические взаимодействия часто используются в качестве мощного инструмента для изучения отношений между парами генов, которые участвуют в общих или компенсаторных биологических путях16,17,18. Такие отношения могут быть измерены путем объединения пар мутаций и количественной оценки влияния мутации в одном гене на фенотипическую тяжесть, вызванную мутацией во втором гене16. Хотя большинство таких комбинаций не показывают никакого эффекта с точки зрения фенотипа, некоторые генетические взаимодействия могут либо усугубить, либо облегчить тяжесть измеренного фенотипа. Усугубляющие мутации наблюдаются, когда фенотип мутанта с двойной делецией более серьезен, чем ожидаемый фенотип, наблюдаемый при объединении мутантов с одинаровой делецией, подразумевая, что два гена функционируют параллельными путями, вместе влияя на данную функцию. Напротив, смягчающие мутации наблюдаются, когда фенотип мутанта с двойной делецией менее серьезен, чем фенотип, наблюдаемый с мутантами с одинаровой делецией, подразумевая, что два гена действуют вместе как комплекс или участвуют в одном и том же пути16,18. Соответственно, для идентификации генетических взаимодействий использовались различные фенотипы, которые могут быть количественно определены, включая широкие фенотипы, такие как летальность, скорость роста и размер расплода, а также конкретные фенотипы, такие как транскрипционные репортеры. Например, Jonikas et al. полагались на репортера стресса ER для изучения взаимодействий Saccharomyces cerevisiae ER развернутой сети протеостаза белкового ответа с использованием парного анализа делеции генов19.
Скрининг генетического взаимодействия включает в себя систематическое скрещивание парных мутаций делеции для создания всеобъемлющего набора двойных мутантов20. Однако на животных моделях, и особенно у C. elegans,такой крупномасштабный подход неосуществим. Вместо этого мутантные штаммы могут быть проверены на их генетические паттерны взаимодействия путем снижения экспрессии генов с использованием РНК-интерференции (РНКи)21. C. elegans представляет собой мощную систему для экранов на основе РНКи22,23. У C. elegansдоставка двухцепочечной РНК (дцРНК) достигается путем бактериального питания, что приводит к распространению молекул дцРНК на многочисленные ткани. Таким образом, введенные молекулы дцРНК воздействовляют на животное с помощью быстрой и простой процедуры21. Таким образом, скрининг генетического взаимодействия с использованием РНК Может выявить влияние понижения регуляции набора генов или большинства генов C. elegans, кодирующих с использованием библиотек РНКи24. На таком экране удары, которые влияют на поведение интересующего мутанта, но не на штамм дикого типа, являются потенциальными модификаторами фенотипа, за которым ведется наблюдение25. Здесь мы применяем комбинацию мутаций и скрининга РНКи для систематического картирования тканеспецифических взаимодействий шаперонов у C. elegans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

Правильное сворачивание и сборка белков и белковых комплексов необходимы для клеточной функции. Клетки используют пути контроля качества, которые корректируют, изолируют или устраняют поврежденные белки для поддержания здорового протеома, тем самым обеспечивая клеточный протеостаз и предотвращая дальнейшее повреждение белка. Из-за избыточных функций в сети протеостаза скрининг на обнаруживаемые фенотипы с использованием нокдауна или мутаций в генах, кодирующих шапероны, в многоклеточном организме Caenorhabditis elegans приводит к обнаружению незначительных фенотипов или их отсутствия в большинстве случаев. Мы разработали стратегию целевого скрининга для выявления шаперонов, необходимых для конкретной функции, и, таким образом, преодоления разрыва между фенотипом и функцией. В частности, мы отслеживаем новые взаимодействия шаперонов с использованием экранов синтетического взаимодействия RNAi, сбивая экспрессию шаперона, по одному шаперону за раз, у животных, несущих мутацию в гене, кодируемом шапероном, или чрезмерно экспрессирующих интересующий шаперон. Разрушая два шаперона, которые по отдельности не представляют грубого фенотипа, мы можем идентифицировать шапероны, которые усугубляют или подвергают воздействию определенный фенотип, когда оба возмущены. Мы демонстрируем, что этот подход может идентифицировать конкретные наборы шаперонов, которые функционируют вместе, модулируя сворачивание белка или белковых комплексов, связанных с данным фенотипом.

Использование чувствительных к температуре мутаций в UNC-45 для скрининга на обострение или облегчение взаимодействий в разрешительных или ограничительных условиях, соответственно Сборка и поддержание мышц предлагают эффективную систему для изучения тканеспецифических вз?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Для изучения взаимодействия шаперон-шаперон и шаперон-субстрат мы проводим синтетические экраны взаимодействия у Caenorhabditis elegans с использованием РНК-интерференции в сочетании с легкими мутациями или чрезмерной экспрессией шаперонов и контролируем тканеспецифическую белковую дисфункцию на уровне организма.

Использование Caenorhabditis elegans для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

The overall goal of the following experiment in genetically trackable design Caenorhabditis elegans is to identify tissue-specific chaperone interactions. The main advantage of this technique is that it combines easy to use assays such as fitting Golan AI and behavioral readouts to expose novel tissue specific interactions. For a non-stressful embryo synchronization, use a worm pick to move about 100 eggs from an unsynchronized worm plate to a newly seated NGM plate and cultivate the animals according to the appropriate experimental schedule.When the animals reach the first day of egg-laying, slowly add one milliliter of M9 buffer to the plate, distant to the bacterial lawn, and rotate the plate so that the buffer completely covers the plate. Tilt the plate to one side to remove the liquid and wash the animals from the plate. When all of the worms have been washed from the plate, use a standard plastic pipette tip to cut a square of Agar around where the eggs are concentrated and place the piece of Agar onto a newly seated NGM plate.Cultivate the eggs under the same culture conditions. At the end of the incubation, the plate should be covered with synchronized eggs. After washing all of the animals from the plate as just demonstrated, add one milliliter of fresh M9 buffer and use a cell scraper to release the eggs from the plate.When all of the eggs have been detached, transfer the entire volume of buffer from the plate into a conical tube for centrifugation. Centrifuge the tube and discard the supernatant. After removing the supernatant, add up to one milliliter of fresh M9 buffer to the plate and pipette to resuspend the eggs.Wash the eggs five more times as just demonstrated. After the last wash, the egg pellet should appear white and all but the last 200 microliters of supernatant can be removed. To cultivate synchronized nematodes for an experiment, place a drop of about 30 eggs close to the bacterial lawn and each interference RNA seated plate and about 30 eggs onto a plate seated with empty vector containing bacteria.Then cultivate the animals under the appropriate culture conditions according to the experimental protocol. To assess the embryonic lethality of the synchronized animals, when the animals begin to lay eggs, transfer about 100 eggs to an empty plate and spread the eggs into rows to simplify the counting. After 24 to 48 hours, score the percent of unhatched eggs.For reference, compare the experimental animal eggs to the eggs of animals treated with empty vector control bacteria. To set up a paralysis assay, cultivate age-synchronized animals on empty vector control bacteria, until the animals reach adulthood, but before egg-laying starts. Use a fine marker to draw a line on the back of a regular NGM Agar plate, and place five to ten animals on the marked line.Set a timer for 10 minutes and score the percentage of animals remaining on the line as paralyzed worms. For reference, compare this data to the percentage of mutant animals grown on empty vector control bacteria. For Protein Knockdown Validation, place 250 to 300 synchronized eggs onto a 60 millimeter NGM interference RNA plate seated with the relevant double stranded RNA expressing or empty vector containing bacteria, and cultivate the eggs for the appropriate experimental period.At the end of the incubation, transfer a total of 200 young adult animals into the cap of a 1.5 milliliter tube containing 200 microliters of PBST maintained at the animals cultivation temperature. Close the cap carefully, and centrifuge the animals at 1000 times G for 1 minute. At the end of the centrifugation, add 800 microliters of fresh PBST to the tube and centrifuge the worms again.Carefully remove the top 900 microliters of the supernatant, and wash the nematodes in fresh PBST 3 more times as just demonstrated. After the last wash, remove all but the last 100 microliters of the supernatant and add 25 microliters of 5X sample buffer to the animals. Heat the samples for 10 minutes at 92 degrees Celsius and 1000 revolutions per minute, before loading 20 microliters of each sample onto an SDS page gel.Then perform Western blot analysis using the appropriate antibodies to determine the relative stability of the protein of interest, and use densitometric software to determine the intensity of the bans. HSP6 knocked down during development results in a strong developmental arrest in wild type animals. At the same time, HSP6 knocked down in a muscle specific interference RNA strain expressing wild-type RDE1 in muscle tissue does not cause developmental arrest.Whereas HSP6 knocked down an intestine specific RNAI strain expressing wild type RDE1 in intestinal cells, results in a strong developmental arrest and phenotype. A mutation in HSP6 MG585 that causes a mild growth delay, can, therefore, be used to screen for aggravating or alleviating chaperone interactions by crossing a strain carrying that mutated gene into an intestinal specific interference RNA strain, and screening the chaperone interference RNA library. Myosin organization and UNC45 mutant animals treated with STI1 AHSA1 or DAF41 interference RNA, is similar to that of wild type worms at the fourth larval stage.Although the mutants exhibit disrupted sarcomeres after reaching adulthood. In contrast, both UNC45 mutant animals treated with an empty vector control and wild type animals remain unaffected. Genetic interactions are not indicative of physical interaction.Thus, follow-up experiments using genetic interaction screen must be performed to validate and directly examine the nature of the identified interactions.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Использование РНК-опосредованного вмешательства стратегии кормления для выявления генов, участвующих в размерах тела регулированию в Нематода<em&gt; C. Элеганс</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Диетических добавок полиненасыщенных жирных кислот в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Скринируемый<em&gt; В Vivo</em&gt; Анализ митохондриальных Модуляторы с использованием трансгенных БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Методы для изучения изменений в присущих агрегации белков с возрастом у нематоды Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Количественная оценка тканеспецифического снижения протеостатического снижения caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Моделирование Возраст-ассоциированных нейродегенеративных заболеваний в Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Автоматизация количественной оценки агрегатов в Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Использование данных об одном черве для количественной оценки гетерогенности в caenorhabditis elegans-бактериальных взаимодействиях

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...