Name: using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions
Uploaded: 2020-06-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

Vi tackar Caenorhabditis Genetics Center, finansierat av NIH National Center for Research Resources (NCRR), för några av nematodstammarna. Monoklonala antikroppar utvecklade av H.F. Epstein erhölls från utvecklingsstudierna Hybridoma Bank utvecklades under beskydd av NICHD och underhålls av Institutionen för biologi, University of Iowa. Denna forskning stöddes av ett anslag från Israel Science Foundation (anslag nr 278/18) och av ett bidrag från Israels ministerium för vetenskap & teknik, och utrikesministeriet och det internationella samarbetet, GeneralDirektoratet för landbefordran, Italien (anslag nr 3-14337). Vi tackar medlemmar av Ben-Zvi-laboratoriet för hjälp med att förbereda detta manuskript.

1. Förberedelse av nematod tillväxtmedieplattor för RNAi
<ol><li>Tillsätt 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar och destillerat vatten upp till 1 L och autoklav på en 1 L-flaska.</li>
	<li>Kyl flaskan till 55 °C.</li>
	<li>Tillsätt 25 ml 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4och 1 ml kolesterollösning(tabell 1)för att göra nematodtillväxtmedia (NGM).</li>
	<li>Tillsätt 1 ml ampicillin (100 mg/ml) och 0,5 ml 1 M IPTG(tabell 1)<...

En integrerad bild av proteostasnätverket som återspeglar hur det är organiserat och fungerar i olika metazoiska celler och vävnader saknas fortfarande. För att ta itu med denna brist krävs specifik information om interaktioner mellan olika komponenter i detta nätverk, såsom molekylära förkläde, i specifika vävnader under utveckling och åldrande. Här visade vi hur användningen av vävnadsspecifika problem gjorde det möjligt för oss att undersöka förkläde nätverket i en given vävnad. För att utforsk...

Celler hanterar proteinskador genom att använda kvalitetskontrollmaskiner som reparerar, spärrar eller tar bort skadade proteiner1,2. Vikning och montering av proteinkomplex stöds av molekylära förkläde, en mångfaldig grupp mycket bevarade proteiner som kan reparera eller binda skadade proteiner3,4,5,6,7. Avlägsnandet av skadade proteiner förmedlas av ubiquitin-proteasomsystemet (UPS)8 eller av autofagimaskineriet9 i samarbete med förkläde10,11,12. Proteinhomeostas (proteostas) upprätthålls därför av kvalitetskontrollnätverk som består av viknings- och nedbrytningsmaskiner3,13. Att förstå interaktionerna mellan de olika komponenterna i proteostasisnätverket in vivo är dock en stor utmaning. Medan proteinproteininteraktionsskärmar bidrar med viktig information om fysiska interaktioner och förklädekomplex14,15, saknas förståelse för organisationen och kompensatoriska mekanismer inom vävnadsspecifika förklädenätverk in vivo.
Genetiska interaktioner används ofta som ett kraftfullt verktyg för att undersöka förhållandet mellan par av gener som är involverade i vanliga eller kompensatoriska biologiskavägar 16,17,18. Sådana relationer kan mätas genom att kombinera par mutationer och kvantifiera effekten av en mutation i en gen på den fenotypiska svårighetsgraden orsakad av en mutation i den andragenen 16. Medan de flesta sådana kombinationer inte visar någon effekt när det gäller fenotyp, vissa genetiska interaktioner kan antingen förvärra eller lindra svårighetsgraden av den uppmätta fenotypen. Försvårande mutationer observeras när fenotypen av dubbel borttagning mutant är allvarligare än den förväntade fenotyp sett vid kombinera den enda borttagning mutanter, vilket innebär att de två generna fungerar i parallella vägar, tillsammans påverkar en given funktion. Däremot observeras lindrande mutationer när fenotypen av den dubbla borttagningsmutanten är mindre allvarlig än fenotypen som ses med de enda borttagningsmutanterna, vilket innebär att de två generna fungerar tillsammans som ett komplex eller deltar i samma väg16,18. Följaktligen har olika fenotyper som kan kvantifieras, inklusive breda fenotyper, såsom dödlighet, tillväxthastigheter och kullstorlek, liksom specifika fenotyper, såsom transkriptionella reportrar, använts för att identifiera genetiska interaktioner. Till exempel förlitade sig Jonikas et al. på en ER stressreporter för att undersöka interaktioner mellan Saccharomyces cerevisiae ER utvecklat proteinsvar proteostasnätverk med hjälp av parvisa genborttagningsanalyser19.
Genetiska interaktionsskärmar innebär systematiskt korsning parvis borttagning mutationer för att generera en omfattande uppsättning dubbla mutanter20. Men i djurmodeller, och specifikt i C. elegans, är detta storskaliga tillvägagångssätt inte genomförbart. Istället kan mutanta stammar testas för sina genetiska interaktionsmönster genom att nedreglera genuttrycket med hjälp av RNA-interferens (RNAi)21. C. elegans är ett kraftfullt system för skärmar baserade på RNAi22,23. I C. elegansuppnås dubbelsträngad RNA (dsRNA) leverans genom bakteriell utfodring, vilket leder till spridning av dsRNA-molekyler till många vävnader. På detta sätt påverkar de introducerade dsRNA-molekylerna djuret via ett snabbt och enkelt förfarande21. En genetisk interaktionsskärm med RNAi kan därför avslöja effekten av att nedreglera en uppsättning gener eller de flesta C. eleganskodande gener med hjälp av RNAi-bibliotek24. I en sådan skärm, träffar som påverkar beteendet hos mutanten av intresse men inte den vilda typen stam är potentiella modifierare av fenotyp övervakas25. Här tillämpar vi en kombination av mutationer och RNAi screening för att systematiskt kartlägga vävnadsspecifika förklädesinteraktioner i C. elegans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

Korrekt vikning och montering av proteiner och proteinkomplex är avgörande för cellulär funktion. Celler använder kvalitetskontrollvägar som korrigerar, spärrar eller eliminerar skadade proteiner för att upprätthålla en hälsosam proteom, vilket säkerställer cellulär proteostas och förhindrar ytterligare proteinskador. På grund av överflödiga funktioner inom proteostasis nätverket, screening för detekterbara fenotyper med hjälp av knockdown eller mutationer i förkläde-kodning gener i multicellular organism Caenorhabditis elegans resulterar i upptäckt av mindre eller inga fenotyper i de flesta fall. Vi har utvecklat en riktad screeningstrategi för att identifiera förkläden som krävs för en specifik funktion och därmed överbrygga klyftan mellan fenotyp och funktion. Specifikt övervakar vi nya förkläde interaktioner med RNAi syntetiska interaktionsskärmar, knock-down förkläde uttryck, en förkläde i taget, hos djur som bär en mutation i en förkläde-kodning gen eller över uttrycker ett förkläde av intresse. Genom att störa två förkläden som individuellt inte presenterar någon grov fenotyp, kan vi identifiera förkläden som förvärrar eller exponerar en specifik fenotyp när båda störs. Vi visar att detta tillvägagångssätt kan identifiera specifika uppsättningar av förkläden som fungerar tillsammans för att modulera vikning av ett protein eller proteinkomplex i samband med en given fenotyp.

Använda temperaturkänsliga mutationer i UNC-45 för att screena för att förvärra eller lindra interaktioner under tillåtande eller restriktiva förhållanden Muskelmontering och underhåll erbjuder ett effektivt system för att studera vävnadsspecifika förkläde interaktioner. Den funktionella enheten av kontraktila muskler, sarkom, presenterar ett kristallint-liknande arrangemang av strukturella och reglerande proteiner. Stabiliteten hos motorproteinet myosin och dess införlivande i de tjock...

Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

För att studera interaktioner mellan förkläde och förkläde- och förkläde- och substrat utför vi syntetiska interaktionsskärmar i Caenorhabditis elegans med hjälp av RNA-interferens i kombination med milda mutationer eller överuttryck av förkläden och övervakar vävnadsspecifik proteindysfunktion på organismnivå.

Använda Caenorhabditis elegans för att screena för vävnadsspecifika förkläde interaktioner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

The overall goal of the following experiment in genetically trackable design Caenorhabditis elegans is to identify tissue-specific chaperone interactions. The main advantage of this technique is that it combines easy to use assays such as fitting Golan AI and behavioral readouts to expose novel tissue specific interactions. For a non-stressful embryo synchronization, use a worm pick to move about 100 eggs from an unsynchronized worm plate to a newly seated NGM plate and cultivate the animals according to the appropriate experimental schedule.When the animals reach the first day of egg-laying, slowly add one milliliter of M9 buffer to the plate, distant to the bacterial lawn, and rotate the plate so that the buffer completely covers the plate. Tilt the plate to one side to remove the liquid and wash the animals from the plate. When all of the worms have been washed from the plate, use a standard plastic pipette tip to cut a square of Agar around where the eggs are concentrated and place the piece of Agar onto a newly seated NGM plate.Cultivate the eggs under the same culture conditions. At the end of the incubation, the plate should be covered with synchronized eggs. After washing all of the animals from the plate as just demonstrated, add one milliliter of fresh M9 buffer and use a cell scraper to release the eggs from the plate.When all of the eggs have been detached, transfer the entire volume of buffer from the plate into a conical tube for centrifugation. Centrifuge the tube and discard the supernatant. After removing the supernatant, add up to one milliliter of fresh M9 buffer to the plate and pipette to resuspend the eggs.Wash the eggs five more times as just demonstrated. After the last wash, the egg pellet should appear white and all but the last 200 microliters of supernatant can be removed. To cultivate synchronized nematodes for an experiment, place a drop of about 30 eggs close to the bacterial lawn and each interference RNA seated plate and about 30 eggs onto a plate seated with empty vector containing bacteria.Then cultivate the animals under the appropriate culture conditions according to the experimental protocol. To assess the embryonic lethality of the synchronized animals, when the animals begin to lay eggs, transfer about 100 eggs to an empty plate and spread the eggs into rows to simplify the counting. After 24 to 48 hours, score the percent of unhatched eggs.For reference, compare the experimental animal eggs to the eggs of animals treated with empty vector control bacteria. To set up a paralysis assay, cultivate age-synchronized animals on empty vector control bacteria, until the animals reach adulthood, but before egg-laying starts. Use a fine marker to draw a line on the back of a regular NGM Agar plate, and place five to ten animals on the marked line.Set a timer for 10 minutes and score the percentage of animals remaining on the line as paralyzed worms. For reference, compare this data to the percentage of mutant animals grown on empty vector control bacteria. For Protein Knockdown Validation, place 250 to 300 synchronized eggs onto a 60 millimeter NGM interference RNA plate seated with the relevant double stranded RNA expressing or empty vector containing bacteria, and cultivate the eggs for the appropriate experimental period.At the end of the incubation, transfer a total of 200 young adult animals into the cap of a 1.5 milliliter tube containing 200 microliters of PBST maintained at the animals cultivation temperature. Close the cap carefully, and centrifuge the animals at 1000 times G for 1 minute. At the end of the centrifugation, add 800 microliters of fresh PBST to the tube and centrifuge the worms again.Carefully remove the top 900 microliters of the supernatant, and wash the nematodes in fresh PBST 3 more times as just demonstrated. After the last wash, remove all but the last 100 microliters of the supernatant and add 25 microliters of 5X sample buffer to the animals. Heat the samples for 10 minutes at 92 degrees Celsius and 1000 revolutions per minute, before loading 20 microliters of each sample onto an SDS page gel.Then perform Western blot analysis using the appropriate antibodies to determine the relative stability of the protein of interest, and use densitometric software to determine the intensity of the bans. HSP6 knocked down during development results in a strong developmental arrest in wild type animals. At the same time, HSP6 knocked down in a muscle specific interference RNA strain expressing wild-type RDE1 in muscle tissue does not cause developmental arrest.Whereas HSP6 knocked down an intestine specific RNAI strain expressing wild type RDE1 in intestinal cells, results in a strong developmental arrest and phenotype. A mutation in HSP6 MG585 that causes a mild growth delay, can, therefore, be used to screen for aggravating or alleviating chaperone interactions by crossing a strain carrying that mutated gene into an intestinal specific interference RNA strain, and screening the chaperone interference RNA library. Myosin organization and UNC45 mutant animals treated with STI1 AHSA1 or DAF41 interference RNA, is similar to that of wild type worms at the fourth larval stage.Although the mutants exhibit disrupted sarcomeres after reaching adulthood. In contrast, both UNC45 mutant animals treated with an empty vector control and wild type animals remain unaffected. Genetic interactions are not indicative of physical interaction.Thus, follow-up experiments using genetic interaction screen must be performed to validate and directly examine the nature of the identified interactions.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Använda RNA-medierad strategi Interference Matning att screena för gener involverade i kroppsstorlek förordningen i rundmasken<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Kosttillskott av fleromättade fettsyror i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

En sållningsbar<em&gt; In Vivo</em&gt; Analys för Mitochondrial Modulators Använda Transgena Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Metoder för att studera förändringar i inneboende Protein aggregering med åldern i Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Kvantifiering av vävnadsspecifik proteostatisk nedgång i caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modellering Åldersassocierade neurodegenerativa sjukdomar i Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisera aggregatkvantifiering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Använda enmaskdata för att kvantifiera heterogenitet i Caenorhabditis elegans-bakteriella interaktioner

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...