Name: using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions
Uploaded: 2020-06-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

NIH Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi (NCRR) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi'ne bazı nematod suşları için teşekkür ederiz. H.F. Epstein tarafından geliştirilen monoklonal antikorlar, NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi Biyoloji Bölümü tarafından sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bankası'ndan elde edildi. Bu araştırma İsrail Bilim Vakfı'nın (278/18 sayılı hibesi) ve İsrail Bilim ve Teknoloji Bakanlığı ile Dışişleri ve Uluslararası İşbirliği Bakanlığı, Ülke Tanıtım Genel Müdürlüğü, İtalya Cumhuriyeti'nin (3-14337 sayılı hibe) hibesi ile desteklendi. Ben-Zvi laboratuvarı üyelerine bu makalenin hazırlanmasında yardımcı olanlara teşekkür ederiz.

1. RNAi için nematod büyüme medya plakalarının hazırlanması
<ol><li>1 L şişeye 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar ve 1 L'ye kadar damıtılmış su ekleyin ve otoklavlayın.</li>
	<li>55 °C'ye kadar soğuk şişe.</li>
	<li>Nematod büyüme ortamı (NGM) yapmak için25mL 1 M KH 2 PO4, pH 6.0, 1 mL 1 M CaCl2,1 mL 1 M MgSO4ve 1 mL kolesterol çözeltisi (Tablo 1) ekleyin.</li>
	<li>NGM-RNAi çözeltisi yapmak için 1 mL ampisilin (100 mg/mL) ve ...

Proteostaz ağının nasıl düzenlendiğini ve farklı metazoan hücre ve dokularda nasıl çalıştığını yansıtan entegre bir resmi eksik kalır. Bu eksikliği gidermek için, gelişim ve yaşlanma sırasında belirli dokularda moleküler refakatçiler gibi bu ağın çeşitli bileşenlerinin etkileşimleri hakkında özel bilgiler gereklidir. Burada, dokuya özgü pertürbasyonların kullanımının belirli bir dokudaki refakatçi ağını incelememizi nasıl sağladığını gösterdik. Dokuya özgü refakatçi ...

Hücreler, hasarlı proteinleri onaran, inzdiye alan veya uzaklaştıran kalite kontrol makineleri kullanarak protein hasarı ile başa çıkar1,2. Protein komplekslerinin katlanır ve montajı moleküler refakatçiler tarafından desteklenir, hasarlı proteinleri onarabilen veya inzal ettirebilen çok korunmuş proteinlerden oluşan çeşitli bir grup 3 ,4,5,6,7. Hasarlı proteinlerin uzaklaştırılması, ubiquitin-proteazom sistemi (UPS)8 veya10, 11, 12refakatçileri ile işbirliği içinde otofaji makineleri9 tarafındanaracılıkedilir. Protein homeostaz (proteostaz) bu nedenle, katlama ve bozulma makinelerinden oluşan kalite kontrol ağları tarafından sürdürülmektedir3,13. Bununla birlikte, proteostaz ağının çeşitli bileşenleri arasındaki etkileşimleri anlamak büyük bir zorluktur. Protein-protein etkileşim ekranları fiziksel etkileşimler ve refakat kompleksleri hakkında önemli bilgilere katkıda bulunurken14,15, organizasyonu anlamak ve dokuya özgü refakatçi ağları içindeki telafi edici mekanizmalar in vivo eksiktir.
Genetik etkileşimler genellikle ortak veya telafi edici biyolojik yollarda yer alan gen çiftleri arasındaki ilişkiyi incelemek için güçlü bir araç olarak kullanılır16,17,18. Bu tür ilişkiler, mutasyon çiftlerinin birleştirilmesi ve bir gendeki bir mutasyonun ikinci gendeki bir mutasyonun neden olduğu fenotipik şiddet üzerindeki etkisinin ölçülmesi ile ölçülebilir16. Bu kombinasyonların çoğu fenotip açısından herhangi bir etki göstermese de, bazı genetik etkileşimler ölçülen fenotipin şiddetini ağırlaştırabilir veya hafifletebilir. Çift silme mutantının fenotipi, tek silme mutantlarının birleştirilmesiyle görülen beklenen fenotipten daha şiddetli olduğunda, iki genin paralel yollarda işlev gördüğünü ve belirli bir işlevi birlikte etkilediğini ima eden ağırlaştırıcı mutasyonlar gözlenir. Buna karşılık, çift silme mutantının fenotipi, tek silme mutantlarında görülen fenotipten daha az şiddetli olduğunda hafifletici mutasyonlar gözlenir, bu da iki genin bir kompleks olarak birlikte hareket ettiğini veya aynı yola katıldığını imaeder 16,18. Buna göre, genetik etkileşimleri tanımlamak için ölümcüllük, büyüme oranları ve kuluçka büyüklüğü gibi geniş fenotipler ve transkripsiyon muhabirleri gibi spesifik fenotipler de dahil olmak üzere ölçülebilen çeşitli fenotipler kullanılmıştır. Örneğin, Jonikas ve arkadaşları, çift yönlü gen silme analizleri kullanarak Saccharomyces cerevisiae ER açılmamış protein yanıtı proteostaz ağının etkileşimlerini incelemek için bir ER stres muhabirine güvendi19.
Genetik etkileşim ekranları, kapsamlı bir çift mutant kümesi oluşturmak için çift yönlü silme mutasyonlarını sistematik olarak geçmeyi içerir20. Bununla birlikte, hayvan modellerinde ve özellikle C. elegans'ta, bu büyük ölçekli yaklaşım mümkün değildir. Bunun yerine, mutant suşları, RNA paraziti (RNAi)21kullanılarak gen ekspresyonunu aşağı düzenleyerek genetik etkileşim kalıpları için test edilebilir. C. elegans RNAi22,23tabanlı ekranlar için güçlü bir sistemdir. C. elegans'ta,çift iplikli RNA (dsRNA) doğumu bakteriyel beslenme ile elde edilir ve dsRNA moleküllerinin çok sayıda dokuya yayılmasına yol açmaktadır. Bu şekilde, tanıtılan dsRNA molekülleri hayvanı hızlı ve basit bir prosedürle etkiler21. Bu nedenle, RNAi kullanan bir genetik etkileşim ekranı, RNAi kütüphanelerini kullanarak genleri kodlayan bir dizi geni veya çoğu C. elegans'ı aşağı düzenlemenin etkisini ortaya getirebilir24. Böyle bir ekranda, ilgi mutantının davranışını etkileyen ancak vahşi tip suşunu etkilemeyen isabetler, izlenen fenotipin potansiyel değiştiricileridir25. Burada, C. elegansdokuya özgü refakatçi etkileşimlerini sistematik olarak haritalamak için mutasyonların ve RNAi taramasının bir kombinasyonunu uyguluyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

Hücresel fonksiyon için proteinlerin ve protein komplekslerinin doğru katlanır ve montajı esastır. Hücreler, sağlıklı bir proteom sağlamak için hasarlı proteinleri düzelten, inzup tutan veya ortadan kaldıran kalite kontrol yollarını kullanır, böylece hücresel proteostaz sağlar ve daha fazla protein hasarını önler. Proteostaz ağı içindeki gereksiz işlevler nedeniyle, çok hücreli organizma Caenorhabditis elegans'ta refakatçi kodlayıcı genlerde nakavt veya mutasyonlar kullanılarak tespit edilebilir fenotiplerin taranması, çoğu durumda küçük veya hiç fenotip tespit edilmesiyle sonuçlanır. Belirli bir işlev için gerekli olan refakatçileri belirlemek ve böylece fenotip ile işlev arasındaki boşluğu kapatmak için hedefli bir tarama stratejisi geliştirdik. Özellikle, refakatçi kodlayan gende mutasyon taşıyan veya bir ilgi refakatçisini aşırı ifade eden hayvanlarda RNAi sentetik etkileşim ekranlarını, yıkıcı refakatçi ifadesini, her seferinde bir refakatçiyi kullanarak yeni refakatçi etkileşimlerini izliyoruz. Bireysel olarak brüt fenotip sunmayan iki refakatçiyi bozarak, her ikisi de rahatsız edildiğinde belirli bir fenotipi ağırleştiren veya açığa çıkaran refakatçileri tanımlayabiliriz. Bu yaklaşımın, belirli bir fenotiple ilişkili bir protein veya protein komplekslerinin katlamasını modüle etmek için birlikte çalışan belirli refakatçi kümelerini tanımlayabileceğini gösteriyoruz.

UNC-45'te sıcaklığa duyarlı mutasyonların kullanılması, izin verilen veya kısıtlayıcı koşullar altında etkileşimlerin ağırlaştırılması veya hafifletilmesini taramak için Kas montajı ve bakımı, dokuya özgü refakatçi etkileşimlerini incelemek için etkili bir sistem sunar. Kasıt kaslarının fonksiyonel birimi olan sarkom, yapısal ve düzenleyici proteinlerin kristal benzeri bir düzenlemesini sunar. Motor protein miyozinin stabilitesi ve kas kas sarkomlarının kalın fila...

Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

The overall goal of the following experiment in genetically trackable design Caenorhabditis elegans is to identify tissue-specific chaperone interactions. The main advantage of this technique is that it combines easy to use assays such as fitting Golan AI and behavioral readouts to expose novel tissue specific interactions. For a non-stressful embryo synchronization, use a worm pick to move about 100 eggs from an unsynchronized worm plate to a newly seated NGM plate and cultivate the animals according to the appropriate experimental schedule.When the animals reach the first day of egg-laying, slowly add one milliliter of M9 buffer to the plate, distant to the bacterial lawn, and rotate the plate so that the buffer completely covers the plate. Tilt the plate to one side to remove the liquid and wash the animals from the plate. When all of the worms have been washed from the plate, use a standard plastic pipette tip to cut a square of Agar around where the eggs are concentrated and place the piece of Agar onto a newly seated NGM plate.Cultivate the eggs under the same culture conditions. At the end of the incubation, the plate should be covered with synchronized eggs. After washing all of the animals from the plate as just demonstrated, add one milliliter of fresh M9 buffer and use a cell scraper to release the eggs from the plate.When all of the eggs have been detached, transfer the entire volume of buffer from the plate into a conical tube for centrifugation. Centrifuge the tube and discard the supernatant. After removing the supernatant, add up to one milliliter of fresh M9 buffer to the plate and pipette to resuspend the eggs.Wash the eggs five more times as just demonstrated. After the last wash, the egg pellet should appear white and all but the last 200 microliters of supernatant can be removed. To cultivate synchronized nematodes for an experiment, place a drop of about 30 eggs close to the bacterial lawn and each interference RNA seated plate and about 30 eggs onto a plate seated with empty vector containing bacteria.Then cultivate the animals under the appropriate culture conditions according to the experimental protocol. To assess the embryonic lethality of the synchronized animals, when the animals begin to lay eggs, transfer about 100 eggs to an empty plate and spread the eggs into rows to simplify the counting. After 24 to 48 hours, score the percent of unhatched eggs.For reference, compare the experimental animal eggs to the eggs of animals treated with empty vector control bacteria. To set up a paralysis assay, cultivate age-synchronized animals on empty vector control bacteria, until the animals reach adulthood, but before egg-laying starts. Use a fine marker to draw a line on the back of a regular NGM Agar plate, and place five to ten animals on the marked line.Set a timer for 10 minutes and score the percentage of animals remaining on the line as paralyzed worms. For reference, compare this data to the percentage of mutant animals grown on empty vector control bacteria. For Protein Knockdown Validation, place 250 to 300 synchronized eggs onto a 60 millimeter NGM interference RNA plate seated with the relevant double stranded RNA expressing or empty vector containing bacteria, and cultivate the eggs for the appropriate experimental period.At the end of the incubation, transfer a total of 200 young adult animals into the cap of a 1.5 milliliter tube containing 200 microliters of PBST maintained at the animals cultivation temperature. Close the cap carefully, and centrifuge the animals at 1000 times G for 1 minute. At the end of the centrifugation, add 800 microliters of fresh PBST to the tube and centrifuge the worms again.Carefully remove the top 900 microliters of the supernatant, and wash the nematodes in fresh PBST 3 more times as just demonstrated. After the last wash, remove all but the last 100 microliters of the supernatant and add 25 microliters of 5X sample buffer to the animals. Heat the samples for 10 minutes at 92 degrees Celsius and 1000 revolutions per minute, before loading 20 microliters of each sample onto an SDS page gel.Then perform Western blot analysis using the appropriate antibodies to determine the relative stability of the protein of interest, and use densitometric software to determine the intensity of the bans. HSP6 knocked down during development results in a strong developmental arrest in wild type animals. At the same time, HSP6 knocked down in a muscle specific interference RNA strain expressing wild-type RDE1 in muscle tissue does not cause developmental arrest.Whereas HSP6 knocked down an intestine specific RNAI strain expressing wild type RDE1 in intestinal cells, results in a strong developmental arrest and phenotype. A mutation in HSP6 MG585 that causes a mild growth delay, can, therefore, be used to screen for aggravating or alleviating chaperone interactions by crossing a strain carrying that mutated gene into an intestinal specific interference RNA strain, and screening the chaperone interference RNA library. Myosin organization and UNC45 mutant animals treated with STI1 AHSA1 or DAF41 interference RNA, is similar to that of wild type worms at the fourth larval stage.Although the mutants exhibit disrupted sarcomeres after reaching adulthood. In contrast, both UNC45 mutant animals treated with an empty vector control and wild type animals remain unaffected. Genetic interactions are not indicative of physical interaction.Thus, follow-up experiments using genetic interaction screen must be performed to validate and directly examine the nature of the identified interactions.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...