Name: a gnotobiotic system for studying microbiome assembly in the phyllosphere and in vegetable fermentation
Uploaded: 2020-06-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af USDA-NIFA-tilskuddet: 2017-67013-26520. Tracy Debenport og Claire Fogan ydede teknisk support, og Ruby Ye og Casey Cosetta giver nyttige kommentarer til tidlige versioner af dette manuskript.

1. Dyrkning af kønscellerfri kål
<ol><li>Forberedelse af udstyr til dyrkning af kønsfri kål<ol>
<li>Rengøring af kalcineret ler for at fjerne fine støvpartikler<ol>
<li>Skyl kalcineret ler (Materialetabel) mindst 3x med postevand; dræne vand. FORSIGTIG: Kalcineret ler producerer meget fint støv, og det anbefales at bære en beskyttende maske (Tabel over Materialer) ved vask.</li>
			<li>Spred kalcineret ler ud som et tyndt lag (~ 4 cm) i en autoklave bakke og autoklave på e...

<ol>
	<li>Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+seasonality+of+core+phyllosphere+microbiota+on+perennial+biofuel+crops.">Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops.</a> Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).</li><li>Pii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+interactions+in+the+rhizosphere:+beneficial+influences+of+plant+growth-promoting+rhizobacteria+on+nutrient+acquisition+process.+A+review.">Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review.</a> Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).</li><li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health.">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota.">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Dinu, L. D., Bach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157:H7+in+the+phyllosphere+of+lettuce:+a+food+safety+risk+factor.">Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).</li><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere:+a+review.">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).</li><li>Bringel, F., Cou&#233;e, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+roles+of+phyllosphere+microorganisms+at+the+interface+between+plant+functioning+and+atmospheric+trace+gas+dynamics.">Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).</li><li>Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+succession+and+stochastic+variation+in+the+assembly+of+Arabidopsis+thaliana+phyllosphere+communities.">Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities.</a> mBio. 5 (1), e00682 (2014).</li><li>Carlstr&#246;m, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbiota+reveal+priority+effects+and+keystone+strains+in+the+Arabidopsis+phyllosphere.">Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).</li><li>Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiology+of+the+phyllosphere:+a+playground+for+testing+ecological+concepts.">Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts.</a> Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).</li><li>Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+abundance+of+phyllosphere+bacteria+are+linked+to+insect+herbivory.">Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory.</a> Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).</li><li>Williams, T. R., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phyllosphere+microbiota+composition+and+microbial+community+transplantation+on+lettuce+plants+grown+indoors.">Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors.</a> mBio. 5 (4), e01564 (2014).</li><li>Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+vegetables+and+fruits+through+lactic+acid+fermentation.">Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation.</a> Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).</li><li>K&#246;berl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+microbiome+shift+during+fermentation+of+medicinal+plants.">Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).</li><li>Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance,+diversity+and+plant-specific+adaptations+of+plant-associated+lactic+acid+bacteria.">Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria.</a> Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).</li><li>Miller, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+limitation+constrains+the+abundance+of+lactic+acid+bacteria+in+the+Napa+cabbage+phyllosphere.">Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).</li><li>Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+and+fermentation+patterns+of+lactic+acid+bacteria+associated+with+sauerkraut+fermentation.">Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation.</a> Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).</li><li>Yildiz, F., Westhoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+growth+of+lactic+acid+bacteria+in+cabbage+juice.">Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice.</a> Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).</li><li>Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+analysis+of+sauerkraut+fermentation+reveals+a+stable+and+rapidly+established+community.">Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community.</a> Foods. 7 (5), 77 (2018).</li><li>Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+tracking+and+succession+of+kimchi+lactic+acid+bacteria+during+fermentation.">Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation.</a> Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).</li><li>Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+Microbes,+Big+Yields:+enhancing+food+crop+production+with+biological+solutions.">Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions.</a> Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).</li><li>Knief, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaproteogenomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+phyllosphere+and+rhizosphere+of+rice.">Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice.</a> The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).</li><li>Wuyts, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrot+Juice+Fermentations+as+Man-Made+Microbial+Ecosystems+Dominated+by+Lactic+Acid+Bacteria.">Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).</li><li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Steinkraus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactic+acid+fermentation+in+the+production+of+foods+from+vegetables,+cereals+and+legumes.">Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).</li></ol>

Kimfri Napa kål planter er blevet brugt til at studere spredning begrænsning af mælkesyrebakterier i Napa kål phyllosphere17. Kimfri Napa kål kan også bruges til at teste individuelle eller par-wise vækst i phyllosfæren (Figur 1). Metoder til fremstilling af sterilt vegetabilsk ekstrakt er blevet testet for tre forskellige sorter af kål: rød, grøn og Napa. Hver af disse SV'er fungerer som et pålideligt vækstmedie. podede mikrober vokser konsekvent på tv?...

Mikrobiel mangfoldighed i phyllosfæren spiller en vigtig rolle for opretholdelsen af plantesundhed og kan også påvirke planternes evne til at modstå miljøstress1,2,3,4,5. Til gengæld påvirker afgrøders sundhed direkte fødevaresikkerheden og kvaliteten6,7. Planter spiller en rolle i økosystemets funktion , og deres tilknyttede mikrobiomer påvirker både planternes evne til at udføre disse aktiviteter og påvirker selv miljøet direkte8. Mens forskerne er begyndt at dechifrere phyllosfærens funktion og sammensætning, er de økologiske processer, der påvirker phyllosfærens mikrobielle samfundssamling, ikke fuldtud forstået 9,10. Phyllosfæren mikrobiom er et fremragende eksperimentelt system til at studere økologi mikrobiomer11. Disse samfund er relativt enkle, og mange af de medlemmer af lokalsamfundet kan dyrkes på standard lab medier10,,12,13.
Gærede grøntsager er et system, hvor fællesskabsstrukturen i phyllosfæren har vigtige konsekvenser. I både surkål og kimchi fungerer de mikrober, der naturligt forekommer på vegetabilske blade (phyllosfæren af Brassica-arter) som inokulum til gæring14,15. Mælkesyrebakterier (LAB) betragtes som allestedsnærværende medlemmer af vegetabilske mikrobiomer, men de kan være i lav overflod i phyllosfæren16. Stærk abiotisk udvælgelse under gæring driver et skift i mikrobielle samfund sammensætning gør det muligt mælkesyrebakterier til at stige i overflod. Som LAB vokser, de producerer mælkesyre, som skaber det sure miljø af fermenterede vegetabilske produkter17. Forbindelsen mellem phyllosfæren og gæringen giver mulighed for at bruge grøntsager som model til at forstå, hvordan mikrobiomer er struktureret.
Vi har udviklet metoder til at dyrke kønsceller-fri Napa kål og til at vaccinere dem med specifikke mikrobielle samfund ved hjælp af sprayflasker. Dette er en billig og pålidelig metode til jævnt podning kål med enten individuelle mikrober eller blandede samfund. En steril grøntsag ekstrakt (SVE) er også blevet udviklet fra tre forskellige kål typer / sorter: rød og grøn kål (Brassica oleracea) og Napa kål (B. rapa). Tilsætning af salt til disse SVEs replikerer fermenteringsmiljøet og giver mulighed for små og relativt højt gennemløb eksperimentelle undersøgelser af fermentering mikrobiom samling. Disse metoder kan bruges til at studere mikrobiel samfund samling i phyllosfæren og hvordan mikrobielle samfund dynamik i phyllosfæren kan være knyttet til succes vegetabilsk gæring.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-way tray tray</td>
			<td>Sigma Magenta</td>
			<td>T8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Round Boston Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td>GPS 712OZSPPK12BR</td>
			<td>Ordered on Amazon.com from various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basket coffee filters</td>
			<td>If you care</td>
			<td></td>
			<td>(unbleached paper) Purchased from Wholefoods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (mercury-free)</td>
			<td>Austin&#39;s</td>
			<td>50-010-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcined clay</td>
			<td>Turface</td>
			<td>MVP</td>
			<td>Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuisinart blender</td>
			<td>Cuisinart</td>
			<td></td>
			<td>Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>7-389-A</td>
			<td>American Educational Products</td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Aven</td>
			<td>18434</td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KleenGuard M10</td>
			<td>Kimberley-Clark</td>
			<td>64240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large plastic container</td>
			<td>Rubbermaid</td>
			<td></td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light racks</td>
			<td>Gardner&#39;s Supply</td>
			<td>39-357</td>
			<td>full-spectrum T5 fluorescent bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta tm 2-way caps</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Man, Rogosa, and Sharpe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0881-17-5</td>
			<td>This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pH probe</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8220BNWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropestle</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215828</td>
			<td>Also called Pellet Pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS nutrient broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td>Murashige and Skoog Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napa cabbage seeds</td>
			<td>Johnny&#39;s Select Seeds</td>
			<td>2814G</td>
			<td>B. rapa var pekinensis (Bilko)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Used to make agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-842-941</td>
			<td>Teknova</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant tissue culture box</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Magenta GA-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologial pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dowel</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>10805-018</td>
			<td>Autoclave before use to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizing 0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>974103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0370-17-3</td>
			<td>This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide orifice pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17007102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast, peptone and dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0428-17-5</td>
			<td>This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gnotobiotic system for studying microbiome assembly in the phyllosphere and in vegetable fermentation

Phyllosfæren, den ovennævnte jordede del af planten, der kan koloniseres af mikrober, er et nyttigt modelsystem til at identificere processer af mikrobielle samfund forsamling. Denne protokol skitserer et system til at studere mikrobielle samfund dynamik i phyllosfæren af Napa kål planter. Den beskriver, hvordan man dyrker kimfrie planter i reagensglas med et kalcineret ler og næringsstofbouillonsubstrat. Inokulering af kimfrie planter med specifikke mikrobielle kulturer giver mulighed for at måle mikrobiel vækst og samfundsdynamik i phyllosfæren. Ved brug af sterilt vegetabilsk ekstrakt fremstillet af kål skift i mikrobielle samfund, der opstår under gæringen kan også vurderes. Dette system er relativt enkel og billig at oprette i laboratoriet og kan bruges til at løse centrale økologiske spørgsmål i mikrobielle samfund forsamling. Det giver også mulighed for at forstå, hvordan phyllosfæren samfund sammensætning kan påvirke den mikrobielle mangfoldighed og kvaliteten af vegetabilske fermenteringer. Denne fremgangsmåde til udvikling af gnotobiotiske kål phyllosfære samfund kunne anvendes på andre vilde og landbrugsmæssige plantearter.

Vækstrater for Napa kål Frøsterilisationsmetoden blev testet med flere forskellige Napa kål (B. rapa var pekinese; Supplerende figur 1) fra en række forskellige leverandører og alle voksede konsekvent med lignende vækstrater. Men afprøvning af metoder med forskellige arter af Brassica (B. rapa: Majroe Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid;...

Watch this Scientific Journal Video about A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation at JoVE.com

A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

En metode til dyrkning af kimfri Napa kål er blevet udviklet, som gør det muligt for forskere at vurdere, hvordan enkelte mikrobielle arter eller multispecies mikrobielle samfund interagerer på kål blad overflader. En steril vegetabilsk ekstrakt præsenteres også, som kan bruges til at måle forskydninger i fællesskabets sammensætning under vegetabilsk gæring.

Et gnotobiotisk system til undersøgelse af mikrobiomsamling i Phyllosfæren og i vegetabilsk fermentering

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial ...

Ved hjælp af denne protokol kan vi behandle centrale spørgsmål om, hvordan mikrober samles og interagerer i fyllosfæren. Det har den ekstra fordel, at ved hjælp af sterile vegetabilske ekstrakt, kan vi knytte strukturen af phyllo sfære samfund til deres funktion under vegetabilsk gæring. Disse teknikker gør det muligt for forskere at teste, hvordan mikrober interagerer i phyllo-sfæren og derefter spore, hvordan disse phyllo-sfæresamfund kan påvirke gæringen.For at overflade sterilisere kålfrø, start med at placere 100 frø i en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør. Tilsæt en milliliter 70% ethanol til røret og vortex det i fem minutter. Brug derefter en pipette til at kassere ethanolen.Tilsæt en milliliter 50% blegemiddel og vortex røret i fem minutter, derefter kassere blegemiddel. Skyl frøene fire gange, ved at tilføje en milliliter autoclaved deioniseret vand vortexing røret, derefter kassere vandet. Efter den sidste skylning, lægges i blød frøene i steriliseret deioniseret vand i to til otte timer for at blødgøre frøet pels før plantning.Vej 10 gram rent calcium ler i en 15 af 2,5 centimeter glasrør. Tilsæt ca. ni milliliter forberedt MS Bouillon til hvert rør til at dække calciumed ler. Hætteglassene med 22 millimeter tovejs reagensglassen.Autoklave rørene ved 121 grader Celsius i 60 minutter. Når rørene fjernes fra autoklaven, skubbes hætterne på glasrørene for at forsegle dem, og rørerne afkøles derefter til stuetemperatur før brug. Når rørene er afkølet, anvendes ekstra lange kraftbefængte til forsigtigt at placere en steril kål frø i midten af hvert rør.Snør rørene i en syvvejsbakke og placer bakken under lette stativer med en 16 timers lyscyklus ved 24 grader Celsius. Frøene vil udvikle deres første sande blad efter fem dage, som er det første vaskulære blad efter cotyledons har dannet. Det har en rynket kant og er dækket af tricombs.For at teste kim-fri kål for sterilitet, forsigtigt greb bunden af planten med steriliserede snævk og trække det ud. Før du fjerner kålen helt fra røret, afskåret forsigtigt rødderne med steriliseret dissektionssaks. Derefter komprimere kålbladene i en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør.Tilsæt 400 mikroliter PBS til hvert mikrocentrifugerør, og brug en steril mikro støder på til at homogenisere kålen. Blade 100 mikroliter af kål homogenat på agar plader, og sørg for at bruge en bred åbning pipette spids. For at gøre glycerol bestande af podning stammer, forsigtigt streak ud enkelte kolonier på to eller tre nye plader af samme medier.Træk kolonierne i to til fem dage, og skrab dem derefter fra pladerne i et 15 milliliter konisk rør med 15 milliliter 15% glycerol. Vortex røret grundigt at blande. Aliquot en milliliter af blandet glycerol bestand i en mikro centrifuge rør og gemme det 80 grader Celsius indtil klar til brug sammen med de resterende 14 milliliter glycerol lager.En uge før brug optø den ene milliliter aliquot på is og placere den på flere forskellige fortyndinger til bestemmelse af koncentrationen af inokulering bestand. Når du er klar til at vaccinere kålen, optø glycerolbestanden på is og fortyndes den til den ønskede koncentration. Tilsæt 10 milliliter af det fortyndede lager til den sterile pumpeflaske og pump fem sprays ind i et stort affaldsbenæringsglas.Tag låget ud af kålrøret og vip kålen mod sprayflasken. Spray hver kål med tre pumper af inokuleringsopløsningen, og høst derefter en delmængde af kålene for at vurdere den faktiske inokuleringskoncentration. At høste kål, fjerne det fra røret med steriliserede stænt.Skær rødderne af med steril dissektionssaks, og placer den forsigtigt i et forvejet sterilt mikrocentrifugerør. Optag vægten af kål til fremtidige beregninger. Tilsæt 400 mikroliter af PBS til hvert rør med kål og male det 30 gange med en mikro støder, derefter plade kål homogenat ved hjælp af brede blænde pipette tips.Fjern og kassér de yderste blade af kål og hak alle resterende kål til at passe ind i en blender. Blend det til en fin pulp og vejer kål homogenat. Tilsæt to milliliter destilleret vand pr. gram kål.Filtrer derefter kålslædekammeret gennem to lag kurvekaffefiltre. Gylle i centrifugerørene afgør den og centrifugeres ved 20.000 gange G i 20 minutter, eller indtil store partikler lægger sig ud af opløsningen. Fjern supernatant, passe på ikke forstyrre pelleteret kål snavs.For at genskabe gæringsbetingelserne med standard saltkoncentrationer tilsættes 2%vægt til volumennatriumchlorid til ekstraktet. Bilder grøntsagsekstraktet med et 0,2 mikrometerfilter fastgjort til et vakuum, dispenser det i sterile rør og frys det ved minus 80 grader Celsius. Frøsteriliseringsmetoden blev testet med flere Napa kål, og de demonstrerede alle lignende vækstrater.Men andre arter af brassica gav begrænset succes, fordi planterne enten havde lave spiring satser efter sterilisering eller stilken aflange hurtigt at gøre en spindelt usund plante. Mikrobielle isolater blev podet enten som enkelt stammeisolater eller i kombination med en anden isolat. I alt 15 kimfrie kål blev testet for hver behandling og høstet enten straks, fire dage eller 10 dage efter vaccination.Isolaterne viste hurtig vækst i Napa kål fyllosphere. To gær og tre bakterier blev podet i tre forskellige typer af sterile vegetabilske ekstrakt eller SVE lavet af rød, grøn og Napa kål. Væksten af inokuler blev registreret over 14 dage ved spot plating fem mikroliter af hver behandling på enten MRS eller YPD agar plader.Målinger af pH under hele gæringen viste, at mælkesyrebakterierne var i stand til at forsure SVE til niveauer under pH fire, hvilket indikerer en gæring, der er sikker til konsum. Disse metoder har specifikt anvendt på kål mikrobiom, men kunne være nyttige i andre plantesystemer. Det kan være udfordrende at holde systemet sterilt, vores skitse protokoller er detaljerede, men vi fandt hvert skridt at være vigtigt.

Research

JoVE Journal

Environment

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Metoder for Performing Crosses i<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, En ny model for at se de Græsser

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

Teknik til at studere leddyr og mikrobielle samfund i Tree Væv

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms.  Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Forbigående genekspression i Tobacco hjælp Gibson forsamling og Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

LC-MS analyse af humane blodplader som en platform for at studere Mitokondriel Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Empiriske, Metagenomic og beregningsmæssige teknikker belyse mekanismerne af som fungicider kompromis biers sundhed

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Måling og kortlægning mønstre af jorderosion og Deposition relateret til jordbunden karbonat koncentrationer Under landbrugsdrift

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Metode til udvikling af liv tabeller for siddende insekter i den felt ved hjælp af Whitefly, Bemisia tabaci, i bomuld som et modelsystem

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

Teknikker til undersøgelse af anatomien af Ant visuelle System

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

En fleksibel lavpris hydroponiske System til vurdering af plante svar til små molekyler i Sterile forhold

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

In Vitro Opdræt af ensomme bier: et værktøj til vurdering af larve risikofaktorer

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...