Name: a gnotobiotic system for studying microbiome assembly in the phyllosphere and in vegetable fermentation
Uploaded: 2020-06-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation at JoVE.com

עבודה זו תמכה במענק משרד החקלאות-NIFA: 2017-67013-26520. טרייסי דבנפורט וקלייר פוגן סיפקו תמיכה טכנית ורובי יה וקייסי Cosetta לספק הערות מועילות על גרסאות מוקדמות של כתב יד זה.

1. גידול כרובים ללא חיידקים
<ol><li>הכנת ציוד לגידול כרובים ללא חיידקים<ol>
<li>ניקוי החימר המכונה להסרת חלקיקי אבק משובחים<ol>
<li>לשטוף חימר המכונה (טבלת חומרים) לפחות 3x עם מים ברז; רוקן את המים. התראה: פלסטלינה מייצרת אבק משובח מאוד ומומלץ לחבוש מסכת הגנה (שולחן חומרים) בעת הכבי...

<ol>
	<li>Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+seasonality+of+core+phyllosphere+microbiota+on+perennial+biofuel+crops.">Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops.</a> Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).</li><li>Pii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+interactions+in+the+rhizosphere:+beneficial+influences+of+plant+growth-promoting+rhizobacteria+on+nutrient+acquisition+process.+A+review.">Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review.</a> Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).</li><li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health.">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota.">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Dinu, L. D., Bach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157:H7+in+the+phyllosphere+of+lettuce:+a+food+safety+risk+factor.">Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).</li><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere:+a+review.">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).</li><li>Bringel, F., Cou&#233;e, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+roles+of+phyllosphere+microorganisms+at+the+interface+between+plant+functioning+and+atmospheric+trace+gas+dynamics.">Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).</li><li>Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+succession+and+stochastic+variation+in+the+assembly+of+Arabidopsis+thaliana+phyllosphere+communities.">Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities.</a> mBio. 5 (1), e00682 (2014).</li><li>Carlstr&#246;m, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbiota+reveal+priority+effects+and+keystone+strains+in+the+Arabidopsis+phyllosphere.">Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).</li><li>Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiology+of+the+phyllosphere:+a+playground+for+testing+ecological+concepts.">Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts.</a> Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).</li><li>Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+abundance+of+phyllosphere+bacteria+are+linked+to+insect+herbivory.">Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory.</a> Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).</li><li>Williams, T. R., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phyllosphere+microbiota+composition+and+microbial+community+transplantation+on+lettuce+plants+grown+indoors.">Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors.</a> mBio. 5 (4), e01564 (2014).</li><li>Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+vegetables+and+fruits+through+lactic+acid+fermentation.">Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation.</a> Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).</li><li>K&#246;berl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+microbiome+shift+during+fermentation+of+medicinal+plants.">Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).</li><li>Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance,+diversity+and+plant-specific+adaptations+of+plant-associated+lactic+acid+bacteria.">Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria.</a> Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).</li><li>Miller, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+limitation+constrains+the+abundance+of+lactic+acid+bacteria+in+the+Napa+cabbage+phyllosphere.">Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).</li><li>Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+and+fermentation+patterns+of+lactic+acid+bacteria+associated+with+sauerkraut+fermentation.">Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation.</a> Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).</li><li>Yildiz, F., Westhoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+growth+of+lactic+acid+bacteria+in+cabbage+juice.">Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice.</a> Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).</li><li>Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+analysis+of+sauerkraut+fermentation+reveals+a+stable+and+rapidly+established+community.">Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community.</a> Foods. 7 (5), 77 (2018).</li><li>Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+tracking+and+succession+of+kimchi+lactic+acid+bacteria+during+fermentation.">Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation.</a> Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).</li><li>Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+Microbes,+Big+Yields:+enhancing+food+crop+production+with+biological+solutions.">Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions.</a> Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).</li><li>Knief, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaproteogenomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+phyllosphere+and+rhizosphere+of+rice.">Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice.</a> The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).</li><li>Wuyts, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrot+Juice+Fermentations+as+Man-Made+Microbial+Ecosystems+Dominated+by+Lactic+Acid+Bacteria.">Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).</li><li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Steinkraus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactic+acid+fermentation+in+the+production+of+foods+from+vegetables,+cereals+and+legumes.">Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).</li></ol>

נבט ללא חיידקים צמחים כרוב נאפה שימשו כדי ללמוד הגבלת הפיזור של חיידקים חומצה לקטית בתוך הכרוב נאפה phyיוסה17. נבט חינם נאפה כרובים יכול לשמש גם כדי לבדוק את הצמיחה בודדים או זוג ביותר ב phyיוסה (איור 1). שיטות להכנת תמצית ירקות סטרילית נבדקה עבור שלושה זנים שונים ש?...

מגוון מיקרוביאלית של ה phyיוסה ממלא תפקיד חשוב בשמירה על בריאות הצמח והוא יכול גם להשפיע על היכולת של צמחים לעמוד בלחץ סביבתי1,2,3,4,5. בתורו, בריאות היבול משפיע ישירות על בטיחות המזון ואיכות6,7. צמחים לשחק תפקיד בתפקוד המערכת האקולוגית ואת microbiomes המשויכים שלהם הן משפיעות על היכולת של צמחים לבצע פעילויות אלה, כמו גם השפעה ישירה על הסביבה עצמה8. בעוד מדענים החלו לפענח את הפונקציה ואת ההרכב של phyיוסה, התהליכים האקולוגיים המשפיעים על האסיפה הקהילתית של הפילוספירה לא מובנים לגמרי9,10. מיקרובידום phyיוסה היא מערכת ניסיונית מעולה לחקר האקולוגיה של microbiome11. קהילות אלה פשוטות יחסית ורבים מחברי הקהילה יכולים לגדול בתקשורת מעבדה סטנדרטית10,12,13.
ירקות תוססים הם מערכת אחת שבה למבנה הקהילתי של הפיללספירה יש השלכות חשובות. הן בכרוב החמוץ ובקימחי, החיידקים המתרחשים באופן טבעי על עלי הירק (מינים של כרוב כרוב ) משמש כרשת החימוץ לתסיסה14,15. חיידקים חומצה לקטית (LAB) נחשבים חברים בכל מקום של microbiomes ירקות, אולם הם יכולים להיות בשפע נמוך ב phyיוסה כדור16. בחירה מוצקה חזקה במהלך התסיסה כוננים משמרת בקומפוזיציה של הקהילה מיקרוביאלית המאפשרת לחיידקים חומצת חלב להגדיל בשפע. כמו המעבדה לצמוח, הם מייצרים חומצה לקטית אשר יוצר את הסביבה חומצי של מוצרי ירקות תוססים17. הקשר בין phyיוסה ואת התסיסה מספק הזדמנות להשתמש בירקות כמודל כדי להבין כיצד microbiomes בנויים.
פיתחנו שיטות לגדל חיידקים בעלי כרוב נאפה ולאפשר להם לחסן אותם עם קהילות מחיידקים ספציפיים באמצעות בקבוקי ריסוס. זוהי שיטה זולה ואמינה של שווה לדבר על כרוב עם חיידקים בודדים או קהילות מעורבות. תמצית ירקות סטרילית (SVE) פותחה גם משלושה סוגים שונים של כרוב/זנים: כרוב אדום וירוק(כרוב)וכרוב נאפה (ב. ראפא). תוספת המלח לאלה משכפל את סביבת התסיסה ומאפשרת מחקרים ניסיוניים בהיקפים קטנים ובקצב גבוה יחסית של הרכבה מיקרוביזום תסיסה. ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי ללמוד הרכבה קהילתית מיקרוביאלית בתחום הפילולספירה, וכיצד ניתן לקשר בין הדינמיקה הקהילתית של מיקרוביאלית להצלחת התסיסה הצמחית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-way tray tray</td>
			<td>Sigma Magenta</td>
			<td>T8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Round Boston Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td>GPS 712OZSPPK12BR</td>
			<td>Ordered on Amazon.com from various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basket coffee filters</td>
			<td>If you care</td>
			<td></td>
			<td>(unbleached paper) Purchased from Wholefoods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (mercury-free)</td>
			<td>Austin&#39;s</td>
			<td>50-010-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcined clay</td>
			<td>Turface</td>
			<td>MVP</td>
			<td>Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuisinart blender</td>
			<td>Cuisinart</td>
			<td></td>
			<td>Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>7-389-A</td>
			<td>American Educational Products</td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Aven</td>
			<td>18434</td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KleenGuard M10</td>
			<td>Kimberley-Clark</td>
			<td>64240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large plastic container</td>
			<td>Rubbermaid</td>
			<td></td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light racks</td>
			<td>Gardner&#39;s Supply</td>
			<td>39-357</td>
			<td>full-spectrum T5 fluorescent bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta tm 2-way caps</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Man, Rogosa, and Sharpe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0881-17-5</td>
			<td>This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pH probe</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8220BNWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropestle</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215828</td>
			<td>Also called Pellet Pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS nutrient broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td>Murashige and Skoog Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napa cabbage seeds</td>
			<td>Johnny&#39;s Select Seeds</td>
			<td>2814G</td>
			<td>B. rapa var pekinensis (Bilko)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Used to make agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-842-941</td>
			<td>Teknova</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant tissue culture box</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Magenta GA-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologial pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dowel</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>10805-018</td>
			<td>Autoclave before use to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizing 0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>974103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0370-17-3</td>
			<td>This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide orifice pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17007102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast, peptone and dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0428-17-5</td>
			<td>This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gnotobiotic system for studying microbiome assembly in the phyllosphere and in vegetable fermentation

The phyיוסה, החלק הקרקע מעל הצמח שיכול להיות הקולוניה על ידי חיידקים, היא מערכת מודל שימושי כדי לזהות תהליכים של האסיפה הקהילה חיידקים. פרוטוקול זה מתאר מערכת לחקר הדינמיקה הקהילתית מיקרוביאלית של צמחי כרוב נאפה. הוא מתאר כיצד לצמוח צמחים ללא חיידקים בצינורות הבדיקה עם חימר calcined המצע הציר התזונתי. החיסונים של צמחים ללא חיידקים עם תרבויות מסוימות של חיידקים מספקים הזדמנויות למדוד צמיחה חיידקים ודינמיקה קהילתית ב phyיוסה. באמצעות תמצית ירקות סטרילית המיוצרים ממשמרות כרובים בקהילות מיקרוביאלית המתרחשות במהלך החימוץ ניתן גם להעריך. מערכת זו פשוטה יחסית וזולה להקים במעבדה וניתן להשתמש בה לטיפול בשאלות אקולוגיות מרכזיות בהרכבה קהילתית מיקרוביאלית. הוא גם מספק הזדמנויות כדי להבין כיצד הרכב הקהילה phyיוסה יכול להשפיע על מגוון חיידקים ואיכות של fermentations ירקות. גישה זו לפיתוח קהילות הגנוטוביוטיקה כרוב יכול להיות מיושם על מינים אחרים הצמח פראי וחקלאי.

שיעורי צמיחה של כרובים נאפה שיטת סירוס הזרעים נבדקה עם מספר כרוב של נאפה (ב. ראפא בר פקינז; משלימה איור 1) ממספר ספקים שונים וכולם גדלו בעקביות עם קצבי צמיחה דומים. עם זאת, בדיקת השיטות עם מינים שונים של הכרוב (ב. ראפא: העליון הסגול לפת; B. ol...

Watch this Scientific Journal Video about A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation at JoVE.com

A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

שיטה של גידול כרוב הנבט ללא חיידקים פותחה המאפשרת לחוקרים להעריך כיצד מינים בודדים או קהילות מיקרוביאלית מינים אינטראקציה על משטחים עלה כרוב. תמצית ירקות סטרילית מוצגת גם אשר ניתן להשתמש כדי למדוד משמרות בקומפוזיציה קהילתית במהלך תסיסה הירקות.

מערכת גנוטוביוטית לחקר מכלול המיקרוביאום בפילולספירה ובתסיסה הצמחית

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial ...

באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים להתייחס לשאלות מפתח לגבי האופן שבו מיקרואורגניזמים מתאספים ומקיימים אינטראקציה בפילוספירה. יש לו יתרון נוסף כי באמצעות תמצית ירקות סטריליים, אנחנו יכולים לקשר את המבנה של קהילות כדור phyllo לתפקוד שלהם במהלך תסיסה צמחית. טכניקות אלה מאפשרות למדענים לבדוק כיצד מיקרואורגניזמים מתקשרים בתחום פילו ולאחר מכן לעקוב אחר האופן שבו קהילות כדור פילו אלה יכולות להשפיע על התסיסה.כדי לחשוף את זרעי הכרוב, להתחיל על ידי הצבת 100 זרעים בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של 70% אתנול לצינור ומערבולת אותו במשך חמש דקות. ואז להשתמש פיפטה כדי להשליך את האתנול.מוסיפים מיליליטר אחד של 50% אקונומיקה ומערבולת הצינור במשך חמש דקות, ואז להשליך את האקונומיקה. לשטוף את הזרעים ארבע פעמים, על ידי הוספת מיליליטר אחד של מים deionized autoclaved מערבולת הצינור, ולאחר מכן להשליך את המים. לאחר שטיפה האחרונה, להשרות את הזרעים במים מעוקרים deionized במשך שעתיים עד שמונה שעות כדי לרכך את מעיל הזרע לפני השתיל.לשקול 10 גרם של חימר סידן נקי לתוך צינור זכוכית 15 על ידי 2.5 ס"מ. מוסיפים כתשעה מיליליטר של מרק MS מוכן לכל צינור כדי לכסות את החימר סידן. מכסים באופן רופף את צינורות הזכוכית עם 22 מילימטר דו-כיוון כובעי מבחנה.אוטוקלאב הצינורות ב 121 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. בעת הסרת הצינורות מן autoclave, לדחוף את הכובעים על צינורות הזכוכית כדי לאטום אותם, ולאחר מכן לקרר את הצינורות לטמפרטורת החדר לפני השימוש. כאשר הצינורות התקררו, השתמשו במטחים ארוכים במיוחד כדי למקם בעדינות זרע כרוב סטרילי אחד במרכז כל צינור.תחרה את הצינורות במגש שבעה כיוון והמקום את המגש תחת מתלים אור עם מחזור אור 16 שעות ב 24 מעלות צלזיוס. הזרעים יפתחו את העלה האמיתי הראשון שלהם לאחר חמישה ימים, שהוא עלה כלי הדם הראשון לאחר הקוטילדונים נוצרו. יש לו קצה מקומט והוא מכוסה טריקומבות.כדי לבדוק את הכרוב ללא חיידקים לסטריליות, אוחזים בעדינות בבסיס הצמח במטחים מעוקרים ושולף אותו החוצה. לפני הסרת הכרוב באופן מלא מהצינור, בזהירות לחתוך את השורשים עם מספריים ניתוח מעוקר. לאחר מכן, לדחוס את עלי הכרוב לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.הוסיפו 400 מיקרוליטרים של PBS לכל צינור מיקרו צנטריפוגה ולהשתמש עלה מיקרו סטרילי כדי הומוגניזציה של הכרוב. להב 100 מיקרוליטרים של הכרוב הומוגניים על צלחות אגר, ומוודאים להשתמש בקצה פיפטה פתח רחב. כדי להפוך את מניות גליצרול של זנים מאמץ, בעדינות פסים מושבות בודדות על שתיים או שלוש צלחות חדשות של אותה מדיה.משורים את המושבות במשך יומיים עד חמישה ימים, ואז מגרדים אותן מהצלחות לצינור חרוט 15 מיליליטר עם 15 מיליליטר של 15% גליצרול. מערבולת הצינור ביסודיות לערבב. Aliquot מיליליטר אחד של מלאי גליצרול מעורב לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה ולאחסן אותו 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש יחד עם הנותרים 14 מיליליטר של מלאי גליצרול.שבוע לפני השימוש, להפשיר את aliquot מיליליטר אחד על קרח ומ מניחים אותו בכמה דילולים שונים כדי לקבוע את הריכוז של מלאי החיסון. כאשר מוכן לחסן את הכרוב, להפשיר את מלאי גליצרול על קרח לדלל אותו לריכוז הרצוי. הוסיפו 10 מיליליטר מהמלאי המדולל לבקבוק המשאבה הסטרילית והזרימה חמישה תרסיסים לתוך מקור איסוף פסולת גדול.מוציאים את המכסה מצינור הכרוב ומטה את הכרוב לכיוון בקבוק הריסוס. לרסס כל כרוב עם שלוש משאבות של פתרון החיסון, ולאחר מכן לקצור תת קבוצה של כרוב כדי להעריך את ריכוז חיסון קלט בפועל. כדי לקצור את הכרוב, הסר אותו מהצינור עם מדפים מעוקרים.חותכים את השורשים עם מספריים ניתוח סטריליים בזהירות למקם אותו צינור מיקרו סטרילי שקל מראש צנטריפוגה. רשום את משקל הכרוב לחישובים עתידיים. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של PBS לכל צינור עם הכרוב וטוחנים אותו 30 פעמים עם עלה מיקרו, ואז צלחת הומוגנט כרוב באמצעות טיפים רחבים פיפט פתח.מוציאים ומשליכים את העלים החיצוניים ביותר של הכרוב וקוצצים את כל הכרוב שנותר כדי להתאים לבלנדר. מערבבים אותו לעיסה עדין ומשקללים את הכרוב הומוגני. מוסיפים שני מיליליטר של מים מזוקקים לגרם כרוב.לאחר מכן לסנן את תרחיף הכרוב דרך שתי שכבות של מסנני קפה סל. מחלקים את תרחיף לתוך צינורות צנטריפוגה צנטריפוגה אותו ב 20, 000 פעמים G במשך 20 דקות או עד חלקיקים גדולים להתיישב מחוץ לפתרון. הסר את supernatant, דואג לא להפריע פסולת כרוב גלולה.כדי לשחזר את תנאי התסיסה עם ריכוזי מלח סטנדרטיים, להוסיף 2% משקל לנפח נתרן כלורי לתמצית. Bilder תמצית הירקות עם מסנן מיקרומטר 0.2 מחובר ואקום, לחלק אותו לתוך צינורות סטריליים להקפיא אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. שיטת עיקור הזרעים נבדקה עם כמה כרוב נאפה וכולנו הפגינו שיעורי צמיחה דומים.עם זאת, מינים אחרים של brassica נתן הצלחה מוגבלת כי הצמחים היו גם שיעורי נביטה נמוכים לאחר עיקור או הגבעול התארך במהירות כדי להפוך צמח לא בריא. מבודדים מיקרוביאליים היו מחוסנים או כמו זן יחיד מבודד או בשילוב עם בידוד אחר. בסך הכל נבדקו 15 כרובים ללא נבטים לכל טיפול ונקצרו באופן מיידי, בארבעה ימים או ב-10 ימים לאחר החיסון.המבודדים הדגימו צמיחה מהירה בפילוספירה של כרוב נאפה. שני שמרים ושלושה חיידקים היו מחוסנים לשלושה סוגים שונים של תמצית ירקות סטריליים או SVE עשוי כרוב אדום, ירוק נאפה. הצמיחה של החיסון נרשמה במשך 14 ימים על ידי ציפוי נקודת חמישה microliters של כל טיפול על צלחות אגר MRS או YPD.מדידות של pH לאורך כל התסיסה הראו כי חיידקי חומצה לקטית היו מסוגלים חומציות SVE לרמות מתחת pH ארבע, המציין תסיסה כי הוא בטוח לצריכה. שיטות אלה יישמו במיוחד על מיקרוביום הכרוב אבל יכול להיות שימושי במערכות צמחיות אחרות. זה יכול להיות מאתגר לשמור על המערכת סטרילית, פרוטוקולי המתאר שלנו מפורטים, אבל מצאנו שכל צעד חשוב.

Research

JoVE Journal

Environment

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

שיטות לביצוע צלבים ב<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, מערכת דגם חדש לעשבים

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

טכניקת לימוד של פרוקים-רגליים וקהילות חיידקים בתוך רקמות עץ

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms.  Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

ניתוח LC-MS של טסיות האדם כפלטפורמה ללימוד מטבוליזם מיטוכונדריאלי

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

אמפירית, Metagenomic, שיטות חישוביות להאיר את מנגנוני הבריאות דבורה איזה פשרה קוטלי פטריות

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

מדידה ומיפוי דפוסים של סחף אדמה ומשקעים הקשורים אדמה ריכוזים קרבונט תחת ניהול חקלאיים

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

מתודולוגיית פיתוח טבלאות החיים עבור חרקים Sessile בשימוש השדה כנימת עש הטבק, כנימת עש הטבק, כותנה כמו מערכת מודל

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

טכניקות חוקר האנטומיה של מערכת הראייה נמלה

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

עלות נמוכה גמיש מערכת הידרופונית להערכת תגובות צמח מולקולות קטנות בתנאים סטריליים

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

במבחנה גידול דבורים בודד: כלי להערכת גורמי סיכון זחל

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...