Name: a gnotobiotic system for studying microbiome assembly in the phyllosphere and in vegetable fermentation
Uploaded: 2020-06-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation at JoVE.com

この作業は、USDA-NIFA助成金(2017-67013-26520)によって支えられていました。トレイシー・デベンポートとクレア・フォガンはテクニカルサポートを提供し、ルビー・イェとケイシー・コセッタはこの原稿の初期バージョンについて役立つコメントを提供しました。

1. 無菌キャベツの栽培
<ol><li>無菌キャベツの栽培に備える装置<ol>
<li>微細な粉塵を除去するために焼成粘土を洗浄<ol>
<li>水道水で少なくとも3倍の焼成粘土(材料表)をすすい。水を排出します。 注意:焼成粘土は非常に微細なほこりを生成し、洗浄時に保護マスク(材料表)を着用することをお勧めします。</li>
			<li>焼成粘土を薄い層(〜4cm)としてオートクレーブトレ...

<ol>
	<li>Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+seasonality+of+core+phyllosphere+microbiota+on+perennial+biofuel+crops.">Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops.</a> Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).</li><li>Pii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+interactions+in+the+rhizosphere:+beneficial+influences+of+plant+growth-promoting+rhizobacteria+on+nutrient+acquisition+process.+A+review.">Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review.</a> Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).</li><li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health.">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota.">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Dinu, L. D., Bach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157:H7+in+the+phyllosphere+of+lettuce:+a+food+safety+risk+factor.">Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).</li><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere:+a+review.">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).</li><li>Bringel, F., Cou&#233;e, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+roles+of+phyllosphere+microorganisms+at+the+interface+between+plant+functioning+and+atmospheric+trace+gas+dynamics.">Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).</li><li>Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+succession+and+stochastic+variation+in+the+assembly+of+Arabidopsis+thaliana+phyllosphere+communities.">Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities.</a> mBio. 5 (1), e00682 (2014).</li><li>Carlstr&#246;m, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbiota+reveal+priority+effects+and+keystone+strains+in+the+Arabidopsis+phyllosphere.">Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).</li><li>Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiology+of+the+phyllosphere:+a+playground+for+testing+ecological+concepts.">Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts.</a> Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).</li><li>Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+abundance+of+phyllosphere+bacteria+are+linked+to+insect+herbivory.">Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory.</a> Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).</li><li>Williams, T. R., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phyllosphere+microbiota+composition+and+microbial+community+transplantation+on+lettuce+plants+grown+indoors.">Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors.</a> mBio. 5 (4), e01564 (2014).</li><li>Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+vegetables+and+fruits+through+lactic+acid+fermentation.">Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation.</a> Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).</li><li>K&#246;berl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+microbiome+shift+during+fermentation+of+medicinal+plants.">Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).</li><li>Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance,+diversity+and+plant-specific+adaptations+of+plant-associated+lactic+acid+bacteria.">Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria.</a> Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).</li><li>Miller, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+limitation+constrains+the+abundance+of+lactic+acid+bacteria+in+the+Napa+cabbage+phyllosphere.">Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).</li><li>Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+and+fermentation+patterns+of+lactic+acid+bacteria+associated+with+sauerkraut+fermentation.">Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation.</a> Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).</li><li>Yildiz, F., Westhoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+growth+of+lactic+acid+bacteria+in+cabbage+juice.">Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice.</a> Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).</li><li>Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+analysis+of+sauerkraut+fermentation+reveals+a+stable+and+rapidly+established+community.">Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community.</a> Foods. 7 (5), 77 (2018).</li><li>Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+tracking+and+succession+of+kimchi+lactic+acid+bacteria+during+fermentation.">Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation.</a> Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).</li><li>Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+Microbes,+Big+Yields:+enhancing+food+crop+production+with+biological+solutions.">Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions.</a> Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).</li><li>Knief, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaproteogenomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+phyllosphere+and+rhizosphere+of+rice.">Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice.</a> The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).</li><li>Wuyts, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrot+Juice+Fermentations+as+Man-Made+Microbial+Ecosystems+Dominated+by+Lactic+Acid+Bacteria.">Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).</li><li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Steinkraus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactic+acid+fermentation+in+the+production+of+foods+from+vegetables,+cereals+and+legumes.">Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).</li></ol>

無菌ナパキャベツ植物は、ナパキャベツフィロスフィア17における乳酸菌の分散制限を研究するために使用されてきた。無菌ナパキャベツは、フィロスフィアの個々または対方向の成長をテストするためにも使用できます(図1)。無菌野菜抽出物の製造方法は、3種類のキャベツ(赤、緑、ナパ)でテストされています。これらの各 SVI は、信頼性の高い成長...

フィロスフィアの微生物多様性は植物の健康を維持する上で重要な役割を果たし、また、植物が環境ストレス11、2、3、4、52,3,4,5に耐える能力に影響を与える可能性があります。ひいては、作物の健康は食品の安全と品質に直接影響を与える6,,7 .植物は生態系機能の役割を果たし、関連するマイクロバイオームは、植物がこれらの活動を行う能力に影響を与えるだけでなく、環境自体に直接影響を与える8.科学者たちはフィロスフィアの機能と組成を解読し始めているが、フィロスフィア微生物群集に影響を与える生態学的プロセスは99,1010を完全には理解していない。フィロスフィアマイクロバイオームは、マイクロバイオーム11の生態を研究するための優れた実験システムである。これらのコミュニティは比較的単純で、コミュニティメンバーの多くは標準のラボ メディア10、12,、13で成長できます。
発酵野菜は、フィロスフィアのコミュニティ構造が重要な結果をもたらす1つのシステムです。ザワークラウトとキムチの両方において、植物の葉(ブラッシカ種のフィロスフィア)に自然に発生する微生物は、発酵14、15,15の接種として機能する。乳酸菌(LAB)は、植物性微生物叢のユビキタスメンバーと考えられているが、フィロスフィア16では豊富に存在し得る。発酵中の強力なアバイオティクス選択は、乳酸菌が豊富に増加することを可能にする微生物群集組成の変化を駆動します。LABが成長するにつれて、彼らは発酵野菜製品17の酸性環境を作り出す乳酸を生産する。フィロスフィアと発酵の間のリンクは、マイクロバイオームがどのように構造化されているかを理解するためのモデルとして野菜を使用する機会を提供します。
私たちは、無菌ナパキャベツを栽培し、スプレーボトルを使用して特定の微生物群集でそれらを接種する方法を開発しました。これは、個々の微生物または混合コミュニティのいずれかでキャベツを均等に接種する安価で信頼性の高い方法です。無菌野菜エキス(SVE)は、赤と緑のキャベツ(ブラッシカオレラセア)とナパキャベツ(B.ラパ)の3種類のキャベツタイプ/品種から開発されています。これらのSVEsに塩を添加すると、発酵環境が再現され、発酵マイクロバイオームアセンブリの小規模かつ比較的高スループットの実験研究が可能になります。これらの方法は、フィロスフィアにおける微生物群集と、フィロスフィアにおける微生物群集のダイナミクスを植物発酵の成功にどのように結び付けることができるかを研究するために使用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-way tray tray</td>
			<td>Sigma Magenta</td>
			<td>T8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Round Boston Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td>GPS 712OZSPPK12BR</td>
			<td>Ordered on Amazon.com from various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basket coffee filters</td>
			<td>If you care</td>
			<td></td>
			<td>(unbleached paper) Purchased from Wholefoods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (mercury-free)</td>
			<td>Austin&#39;s</td>
			<td>50-010-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcined clay</td>
			<td>Turface</td>
			<td>MVP</td>
			<td>Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuisinart blender</td>
			<td>Cuisinart</td>
			<td></td>
			<td>Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>7-389-A</td>
			<td>American Educational Products</td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Aven</td>
			<td>18434</td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KleenGuard M10</td>
			<td>Kimberley-Clark</td>
			<td>64240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large plastic container</td>
			<td>Rubbermaid</td>
			<td></td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light racks</td>
			<td>Gardner&#39;s Supply</td>
			<td>39-357</td>
			<td>full-spectrum T5 fluorescent bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta tm 2-way caps</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Man, Rogosa, and Sharpe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0881-17-5</td>
			<td>This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pH probe</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8220BNWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropestle</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215828</td>
			<td>Also called Pellet Pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS nutrient broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td>Murashige and Skoog Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napa cabbage seeds</td>
			<td>Johnny&#39;s Select Seeds</td>
			<td>2814G</td>
			<td>B. rapa var pekinensis (Bilko)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Used to make agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-842-941</td>
			<td>Teknova</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant tissue culture box</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Magenta GA-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologial pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dowel</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>10805-018</td>
			<td>Autoclave before use to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizing 0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>974103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0370-17-3</td>
			<td>This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide orifice pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17007102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast, peptone and dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0428-17-5</td>
			<td>This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gnotobiotic system for studying microbiome assembly in the phyllosphere and in vegetable fermentation

フィロスフィアは、微生物によってコロニー形成され得る植物の地上部分であり、微生物群集のプロセスを同定するのに有用なモデルシステムである。このプロトコルは、ナパキャベツ植物のフィロスフィアにおける微生物群集ダイナミクスを研究するためのシステムを概説する。これは、焼成粘土と栄養ブロス基板を有する試験管で無菌植物を成長させる方法を説明しています。特定の微生物培養物を含む無菌植物の接種は、フィロスフィアにおける微生物の成長とコミュニティダイナミクスを測定する機会を提供する。発酵中に発生する微生物群集におけるキャベツのシフトから生成される無菌野菜抽出物の使用を通じても評価することができる。このシステムは、実験室で設定するには比較的簡単で安価であり、微生物群集の主要な生態学的な質問に対処するために使用することができます。また、フィロスフィアコミュニティの組成が植物発酵の微生物の多様性と品質にどのような影響を与えるかを理解する機会を提供します。グノトビオティックキャベツフィロスフィアコミュニティを開発するためのこのアプローチは、他の野生および農業植物種に適用することができます。

ナパキャベツの成長率 種子滅菌法は、いくつかの異なるナパキャベツ(B.ラパ・ヴァル・ペキネーゼ)で試験した。 補足図 1)多くの異なるサプライヤーから、すべてが同様の成長率で一貫して成長しました。しかし、 ブラシカ の異なる種でメソッドをテストする(B. ラパ: カブパープルトップ; B. オレラセア: カイロ...

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A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

単一の微生物種または多種微生物群集がキャベツの葉表面でどのように相互作用するかを評価することを可能にする無菌ナパキャベツの栽培方法が開発されました。滅菌野菜抽出物も提示され、植物発酵中のコミュニティ組成の変化を測定するために使用できます。

フィロスフィアおよび植物発酵における微生物叢の組立を研究するためのグノトバイオティクスシステム

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial ...

このプロトコルを使用して、フィロスフィア内で微生物がどのように組み立てられ、相互作用するかに関する重要な質問に対処することができます。滅菌野菜抽出物を使用することで、植物発酵中の機能にフィロ球群の構造をリンクすることができるという付加的な利点があります。これらの技術により、科学者は微生物がフィロ球体でどのように相互作用するかをテストし、これらのフィロ球群が発酵にどのような影響を与えるかを追跡することができます。キャベツの種子を表面化するには、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに100種を入れることから始めます。70%エタノールの1ミリリットルをチューブに加え、5分間渦を出します。その後、ピペットを使用してエタノールを廃棄します。50%漂白剤の1ミリリットルを追加し、5分間チューブを渦に入れ、漂白剤を捨てます。種子を4回リンスし、チューブを渦出させるオートクレーブ脱イオン水を1ミリリットル加えて、水を捨てる。最後のすすめの後、殺菌した脱イオン水に種子を2〜8時間浸し、植える前に種子コートを柔らかくします。10グラムのきれいなカルシウム粘土を15%2.5センチメートルのガラス管に計量する。カルシウム粘土を覆うために、各チューブに調製したMS Brothの約9ミリリットルを追加します。ガラス管を22ミリメートルの双方向試験管キャップでゆるやかにキャップします。チューブを摂氏121度で60分間オートクレーブします。オートクレーブからチューブを取り外すときは、キャップをガラス管に押し込んで密閉し、使用前にチューブを室温まで冷却します。チューブが冷却されたら、余分な長い鉗子を使用して、各チューブの中央に1つの無菌キャベツの種を穏やかに配置します。7ウェイトレイでチューブをレースし、24°Cで16時間のライトサイクルを備えたライトラックの下にトレイを置きます。種子は、コチルドンが形成された後の最初の血管葉である5日後に最初の真の葉を開発します。それはしわの端を有し、トリコームで覆われている。無菌キャベツの無菌性をテストするには、植物の基部を滅菌鉗子で軽く握り、引き出します。チューブからキャベツを完全に取り除く前に、滅菌解剖はさみで根を慎重に切り落としてください。次にキャベツの葉を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに圧縮します。各マイクロ遠心分離管にPBSの400マイクロリットルを追加し、キャベツを均質化するために無菌マイクロ害虫を使用しています。キャベツのブレード100マイクロリットルは寒天プレートにホモジュネイトし、広いオリフィスピペットチップを使用することを確認します。接種株のグリセロールストックを作るには、個々のコロニーを同じ培地の2つまたは3つの新しいプレートにそっと引き出す。コロニーを2〜5日間行き、プレートから15%グリセロールの15ミリリットルの円錐管に削ります。チューブを完全に混ぜ合わせます。混合グリセロールストックの1ミリリットルをマイクロ遠心管にアリコートし、残りの14ミリリットルのグリセロールストックと一緒に使用する準備ができるまで摂氏80度を貯蔵する。使用の1週間前に、氷の上に1ミリリットルのアリコートを解凍し、接種ストックの濃度を決定するためにいくつかの異なる希釈液にそれを置きます。キャベツを接種する準備ができたら、グリセロールストックを氷上で解凍し、所望の濃度に希釈します。希釈ストックの10ミリリットルを無菌ポンプボトルに加え、5つのスプレーを大きな廃棄物回収ビーカーに送り込みます。キャベツチューブから蓋を取り出し、キャベツをスプレーボトルに向かって傾けます。各キャベツに3つのポンプを接種液でスプレーし、キャベツのサブセットを収穫して実際のインプット接種濃度を評価する。キャベツを収穫するには、殺菌された鉗子でチューブから取り出します。無菌解剖はさみで根を切り落とし、慎重に事前に計量された無菌マイクロ遠心分離チューブに入れなさい。今後の計算のためにキャベツの重量を記録します。キャベツで各チューブに400マイクロリットルのPBSを加え、マイクロペスルで30回粉砕し、広いオリフィスピペットチップを使用してキャベツホモジュネートをプレートします。キャベツの最も外側の葉を取り除いて捨て、残りのキャベツをすべてブレンダーに収めるためにみじん切りにします。細かいパルプにブレンドし、キャベツのホモジネートの重量を量ります。キャベツ1グラムあたり2ミリリットルの蒸留水を加えます。次に、キャベツスラリーをバスケットコーヒーフィルターの2層で濾過します。スラリーを遠心管に分配し、20,000倍のGで20分間、または大きな粒子が溶液から落ち着くまで遠心分離します。上清を取り除き、ペレットキャベツの破片を邪魔しないように注意してください。標準的な塩濃度で発酵条件を再現するには、その抽出物に塩化ナトリウムの体積に2%の重量を加えます。真空に取り付けられた0.2マイクロメートルのフィルターで野菜エキスをビルダーし、滅菌チューブに分配し、マイナス80度で凍結します。種子滅菌法は、いくつかのナパキャベツで試験され、それらはすべて同様の成長率を実証した。しかし、他の種のブラッシカは、植物が殺菌後に発芽率が低いか、茎が急速に伸びてスピン異常な植物を作るために伸びていたので、限られた成功を収めました。微生物分離株は、単一株分離物として、または別の単離株と組み合わせて接種した。各治療について合計15個の無菌キャベツを試験し、接種後4日または10日後にすぐに収穫した。この分離株はナパキャベツフィロスフィアで急速な成長を示した。2つの酵母と3つの細菌を3種類の無菌野菜抽出物または赤、緑、ナパキャベツから作られたSVEに接種した。接種物の成長は、MRSまたはYPD寒天プレート上の各処理の5マイクロリットルをスポットメッキすることによって14日間にわたって記録した。発酵中のpHの測定は、乳酸菌がSVEをpH4以下のレベルまで酸性化できることを示し、消費しても安全な発酵を示した。これらの方法は、特にキャベツマイクロバイオームに適用されているが、他の植物システムで有用である可能性があります。システムを無菌に保つのは難しいかもしれませんが、私たちのアウトラインプロトコルは詳細ですが、各ステップが重要であることがわかりました。

Research

JoVE Journal

Environment

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に十字架を実行するためのメソッド<em&gt;エノコログサ</em草のために&gt;、新モデルシステム

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