Name: a gnotobiotic system for studying microbiome assembly in the phyllosphere and in vegetable fermentation
Uploaded: 2020-06-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av USDA-NIFA-stipendet: 2017-67013-26520. Tracy Debenport og Claire Fogan ga teknisk støtte og Ruby Ye og Casey Cosetta gi nyttige kommentarer om tidlige versjoner av dette manuskriptet.

1. Voksende bakteriefrie kåler
<ol><li>Forbereder utstyr for dyrking av bakteriefrie kåler<ol>
<li>Rengjøring av den kalserte leire for å fjerne fine støvpartikler<ol>
<li>Skyll kalsinert leire (Tabell av materialer) minst 3x med vann fra springen; avløp av vann. FORSIKTIG: Kalsinert leire produserer veldig fint støv, og det anbefales å bruke en beskyttende maske (Tabell over materialer) ved vask.</li>
			<li>Spre kalsinert leire ut som et tynt lag (~ 4 cm) i et autoklavbret...

<ol>
	<li>Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+seasonality+of+core+phyllosphere+microbiota+on+perennial+biofuel+crops.">Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops.</a> Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).</li><li>Pii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+interactions+in+the+rhizosphere:+beneficial+influences+of+plant+growth-promoting+rhizobacteria+on+nutrient+acquisition+process.+A+review.">Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review.</a> Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).</li><li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health.">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota.">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Dinu, L. D., Bach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157:H7+in+the+phyllosphere+of+lettuce:+a+food+safety+risk+factor.">Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).</li><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere:+a+review.">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).</li><li>Bringel, F., Cou&#233;e, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+roles+of+phyllosphere+microorganisms+at+the+interface+between+plant+functioning+and+atmospheric+trace+gas+dynamics.">Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).</li><li>Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+succession+and+stochastic+variation+in+the+assembly+of+Arabidopsis+thaliana+phyllosphere+communities.">Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities.</a> mBio. 5 (1), e00682 (2014).</li><li>Carlstr&#246;m, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbiota+reveal+priority+effects+and+keystone+strains+in+the+Arabidopsis+phyllosphere.">Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).</li><li>Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiology+of+the+phyllosphere:+a+playground+for+testing+ecological+concepts.">Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts.</a> Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).</li><li>Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+abundance+of+phyllosphere+bacteria+are+linked+to+insect+herbivory.">Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory.</a> Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).</li><li>Williams, T. R., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phyllosphere+microbiota+composition+and+microbial+community+transplantation+on+lettuce+plants+grown+indoors.">Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors.</a> mBio. 5 (4), e01564 (2014).</li><li>Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+vegetables+and+fruits+through+lactic+acid+fermentation.">Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation.</a> Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).</li><li>K&#246;berl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+microbiome+shift+during+fermentation+of+medicinal+plants.">Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).</li><li>Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance,+diversity+and+plant-specific+adaptations+of+plant-associated+lactic+acid+bacteria.">Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria.</a> Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).</li><li>Miller, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+limitation+constrains+the+abundance+of+lactic+acid+bacteria+in+the+Napa+cabbage+phyllosphere.">Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).</li><li>Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+and+fermentation+patterns+of+lactic+acid+bacteria+associated+with+sauerkraut+fermentation.">Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation.</a> Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).</li><li>Yildiz, F., Westhoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+growth+of+lactic+acid+bacteria+in+cabbage+juice.">Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice.</a> Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).</li><li>Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+analysis+of+sauerkraut+fermentation+reveals+a+stable+and+rapidly+established+community.">Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community.</a> Foods. 7 (5), 77 (2018).</li><li>Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+tracking+and+succession+of+kimchi+lactic+acid+bacteria+during+fermentation.">Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation.</a> Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).</li><li>Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+Microbes,+Big+Yields:+enhancing+food+crop+production+with+biological+solutions.">Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions.</a> Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).</li><li>Knief, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaproteogenomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+phyllosphere+and+rhizosphere+of+rice.">Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice.</a> The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).</li><li>Wuyts, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrot+Juice+Fermentations+as+Man-Made+Microbial+Ecosystems+Dominated+by+Lactic+Acid+Bacteria.">Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).</li><li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Steinkraus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactic+acid+fermentation+in+the+production+of+foods+from+vegetables,+cereals+and+legumes.">Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).</li></ol>

Bakteriefrie Napa kålplanter har blitt brukt til å studere spredningsbegrensning av melkesyrebakterier i Napa kål phyllosphere17. Bakteriefrie Napa kål kan også brukes til å teste individuell eller parvis vekst i phyllosphere (Figur 1). Metoder for å lage sterilt vegetabilsk ekstrakt har blitt testet for tre forskjellige varianter av kål: rød, grønn og Napa. Hver av disse SVE fungerer som en pålitelig vekst media; inokulerte mikrober vokser konsekvent på t...

Mikrobiell mangfold av phyllosphere spiller en viktig rolle i å opprettholde plantehelse og kan også påvirke plantens evne til å tåle miljøstress1,2,3,4,5. I sin tur påvirker helsen til avlinger direkte matsikkerhet og kvalitet6,,7. Planter spiller en rolle i økosystemfunksjonen, og deres tilknyttede mikrobiomer påvirker begge plantenes evne til å utføre disse aktivitetene, samt direkte påvirke miljøet selv8. Mens forskere har begynt å tyde funksjonen og sammensetningen av phyllosphere, de økologiske prosesser som påvirker phyllosphere mikrobiell samfunnet montering er ikke fullt ut forstått9,10. Phyllosphere mikrobiome er et utmerket eksperimentelt system for å studere økologi av mikrobiomer11. Disse samfunnene er relativt enkle, og mange av fellesskapsmedlemmene kan dyrkes på standard lab media10,12,13.
Fermenterte grønnsaker er ett system der phyllosphereens samfunnsstruktur har viktige konsekvenser. I både surkål og kimchi fungerer mikrobene som naturlig forekommer på vegetabilske blader (phyllosphere av Brassica arter) som inoculum for gjæring14,15. Melkesyrebakterier (LAB) regnes som allestedsnærværende medlemmer av vegetabilske mikrobiomer, men de kan være i lav overflod i phyllosphere16. Sterk abiotisk utvalg under gjæring driver et skifte i mikrobiell fellesskapssammensetning slik at melkesyrebakterier kan øke i overflod. Etter hvert som LAB vokser, produserer de melkesyre som skaper det sure miljøet til fermenterte vegetabilske produkter17. Koblingen mellom phyllosphere og gjæringen gir en mulighet til å bruke grønnsaker som modell for å forstå hvordan mikrobiomer er strukturert.
Vi har utviklet metoder for å vokse bakteriefrie Napa kål og å inokulere dem med spesifikke mikrobielle samfunn ved hjelp av sprayflasker. Dette er en billig og pålitelig metode for å inokulere kålen jevnt med enten individuelle mikrober eller blandede samfunn. Et sterilt vegetabilsk ekstrakt (SVE) er også utviklet fra tre forskjellige kåltyper/varianter: rød og grønn kål (Brassica oleracea) og Napa kål (B. rapa). Tilsetning av salt til disse SVEene replikerer gjæringsmiljøet og gir mulighet for småskala og relativt høygjennomstrømning eksperimentelle studier av gjæring mikrobiome montering. Disse metodene kan brukes til å studere mikrobiell samfunnsmontering i phyllosphere og hvordan mikrobiell samfunnsdynamikk i phyllosphere kan knyttes til suksessen til vegetabilsk gjæring.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-way tray tray</td>
			<td>Sigma Magenta</td>
			<td>T8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Round Boston Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td>GPS 712OZSPPK12BR</td>
			<td>Ordered on Amazon.com from various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basket coffee filters</td>
			<td>If you care</td>
			<td></td>
			<td>(unbleached paper) Purchased from Wholefoods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (mercury-free)</td>
			<td>Austin&#39;s</td>
			<td>50-010-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcined clay</td>
			<td>Turface</td>
			<td>MVP</td>
			<td>Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuisinart blender</td>
			<td>Cuisinart</td>
			<td></td>
			<td>Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>7-389-A</td>
			<td>American Educational Products</td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Aven</td>
			<td>18434</td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KleenGuard M10</td>
			<td>Kimberley-Clark</td>
			<td>64240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large plastic container</td>
			<td>Rubbermaid</td>
			<td></td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light racks</td>
			<td>Gardner&#39;s Supply</td>
			<td>39-357</td>
			<td>full-spectrum T5 fluorescent bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta tm 2-way caps</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Man, Rogosa, and Sharpe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0881-17-5</td>
			<td>This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pH probe</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8220BNWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropestle</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215828</td>
			<td>Also called Pellet Pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS nutrient broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td>Murashige and Skoog Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napa cabbage seeds</td>
			<td>Johnny&#39;s Select Seeds</td>
			<td>2814G</td>
			<td>B. rapa var pekinensis (Bilko)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Used to make agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-842-941</td>
			<td>Teknova</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant tissue culture box</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Magenta GA-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologial pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dowel</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>10805-018</td>
			<td>Autoclave before use to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizing 0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>974103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0370-17-3</td>
			<td>This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide orifice pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17007102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast, peptone and dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0428-17-5</td>
			<td>This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gnotobiotic system for studying microbiome assembly in the phyllosphere and in vegetable fermentation

Phyllosphere, den ovennevnte bakken delen av anlegget som kan koloniseres av mikrober, er et nyttig modellsystem for å identifisere prosesser av mikrobiell fellesskap montering. Denne protokollen skisserer et system for å studere mikrobiell samfunnsdynamikk i phyllosphere av Napa kål planter. Den beskriver hvordan å vokse bakteriefrie planter i reagensrør med en kalsinert leire og næringsbuljong substrat. Inokulasjon av bakteriefrie planter med spesifikke mikrobielle kulturer gir muligheter til å måle mikrobiell vekst og samfunnsdynamikk i phyllosphere. Gjennom bruk av sterilt vegetabilsk ekstrakt produsert fra kålskift i mikrobielle samfunn som oppstår under gjæring kan også vurderes. Dette systemet er relativt enkelt og billig å sette opp i laboratoriet og kan brukes til å løse viktige økologiske spørsmål i mikrobiell fellesskapsforsamling. Det gir også muligheter til å forstå hvordan phyllosphere samfunnet sammensetning kan påvirke mikrobiell mangfold og kvalitet på vegetabilske gjæringer. Denne tilnærmingen for å utvikle gnotobiotiske kål phyllosphere samfunn kan brukes på andre ville og landbruksplantearter.

Vekstrater for Napa kål Frø sterilisering metoden ble testet med flere forskjellige Napa kål (B. rapa var pekinese; Supplerende figur 1) fra en rekke ulike leverandører og alle vokste konsekvent med lignende vekstrater. Men testing av metoder med forskjellige arter av Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid; B. junc...

Watch this Scientific Journal Video about A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation at JoVE.com

A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

En metode for voksende bakteriefrie Napa kål er utviklet som gjør det mulig for forskere å vurdere hvordan enkelt mikrobielle arter eller multispecies mikrobielle samfunn samhandler på kålbladoverflater. Et sterilt vegetabilsk ekstrakt presenteres også som kan brukes til å måle endringer i fellesskapssammensetning under vegetabilsk gjæring.

Et gnotobiotisk system for å studere mikrobiomemontering i phyllosphere og i vegetabilsk gjæring

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial ...

Ved hjelp av denne protokollen kan vi ta opp viktige spørsmål om hvordan mikrober samles og samhandler i fyllosfæren. Den har den ekstra fordelen at ved å bruke det sterile grønnsaksekstraktet, kan vi knytte strukturen til phyllo sfæresamfunn til deres funksjon under vegetabilsk gjæring. Disse teknikkene gjør det mulig for forskere å teste hvordan mikrober samhandler i phyllo-sfæren og deretter spore hvordan disse phyllo sfæresamfunnene kan påvirke gjæring.For å overflate sterilisere kålfrøene, start med å plassere 100 frø i et 1,5 milliliter mikro sentrifugerør. Tilsett en milliliter 70% etanol til røret og vortex det i fem minutter. Bruk deretter en pipette til å kaste etanol.Tilsett en milliliter med 50% blekemiddel og vortex røret i fem minutter, og kast deretter blekemiddelet. Skyll frøene fire ganger, ved å legge til en milliliter autoklavet deionisert vann som virvler røret, og kast deretter vannet. Etter siste skylling, suge frøene i sterilisert deionisert vann i to til åtte timer for å myke frøfrakken før planting.Vei 10 gram ren kalsiumleire i et 15 med 2,5 centimeter glassrør. Tilsett omtrent ni milliliter forberedt MS Bulth til hvert rør for å dekke kalsiumleire. Het glassrørene løst med 22 millimeter toveis testrørcaps.Autoklav rørene ved 121 grader Celsius i 60 minutter. Når du fjerner rørene fra autoklaven, skyv hettene på glassrørene for å forsegle dem, og avkjøl deretter rørene til romtemperatur før bruk. Når rørene er avkjølt, brukte ekstra lange tang for å forsiktig plassere ett sterilt kålfrø i midten av hvert rør.Snøre rørene i et syvveis brett og legg brettet under lysstativer med en 16 timers lyssyklus ved 24 grader Celsius. Frøene vil utvikle sitt første sanne blad etter fem dager, som er det første vaskulære bladet etter at cotyledons har dannet seg. Den har en rynkete kant og er dekket av tricombs.For å teste bakteriefri kål for sterilitet, ta forsiktig tak i plantens base med steriliserte tang og trekk den ut. Før du fjerner kålen helt fra røret, kutt forsiktig av røttene med sterilisert disseksjonsaks. Deretter komprimerer kålbladene til et 1,5 milliliter mikro sentrifugerør.Tilsett 400 mikroliter PBS til hvert mikrosentridrifugerør og bruk en steril mikropesempel for å homogenisere kålen. Blad 100 mikroliter av kål homogenate på agar plater, sørg for å bruke en bred åpning pipette tips. For å lage glyserollagre av inokuleringsstammer, fjern forsiktig ut individuelle kolonier på to eller tre nye plater av samme media.Ro koloniene i to til fem dager, og skrap dem deretter fra platene til et 15 milliliter konisk rør med 15 milliliter 15% glyserol. Vortex røret grundig for å blande. Aliquot en milliliter av blandet glyserol lager i en mikro sentrifuge rør og lagre den 80 grader Celsius til klar til bruk sammen med de resterende 14 milliliter av glyserol lager.En uke før bruk tiner du den ene milliliter aliquot på is og plasserer den på flere forskjellige fortynninger for å bestemme konsentrasjonen av inokulasjonsbestanden. Når du er klar til å inokulere kålen, tin glyserolbestanden på is og fortynne den til ønsket konsentrasjon. Tilsett 10 milliliter av den fortynnede bestanden til den sterile pumpeflasken og pump fem sprayer i et stort avfallsoppsamlingsbeger.Fjern lokket fra kålrøret og vipp kålen mot sprayflasken. Spray hver kål med tre pumper av inokulasjonsløsningen, og høst deretter en undergruppe av kålene for å vurdere den faktiske inngangs inokulasjonskonsentrasjonen. For å høste kålen, fjern den fra røret med steriliserte tang.Klipp av røttene med steril disseksjon saks og legg den forsiktig i en pre veid steril mikro sentrifuge rør. Registrer vekten av kålen for fremtidige beregninger. Tilsett 400 mikroliter PBS til hvert rør med kål og slip den 30 ganger med en mikro pestle, og legg deretter kålhomogenatet ved hjelp av brede åpningpipettespisser.Fjern og kast kålens ytterste blader og hakk all gjenværende kål for å passe inn i en blender. Bland den til en fin masse og vei kålhomogenatet. Tilsett to milliliter destillert vann per gram kål.Deretter filtrerer kålslamen gjennom to lag med kurvkaffefiltre. Dispenser slammet i sentrifugerør og sentrifuger den ved 20 000 ganger G i 20 minutter eller til store partikler legger seg ut av oppløsning. Fjern det overnaturlige, og ta vare på å ikke forstyrre pelleted kålrester.For å gjenskape gjæringsforholdene med standard saltkonsentrasjoner, tilsett 2% vekt til volumnatriumklorid til ekstraktet. Bilder grønnsaksekstraktet med et 0,2 mikrometerfilter festet til et vakuum, dispenser det i sterile rør og frys det på minus 80 grader Celsius. Frøsteriliseringsmetoden ble testet med flere Napa kåler, og de viste alle lignende vekstrater.Men andre arter av brassica ga begrenset suksess fordi plantene enten hadde lave spiring priser etter sterilisering eller stammen langstrakt raskt for å lage en spindly usunn plante. Mikrobielle isolater ble vaksinert enten som enkeltbelastningisolerer eller i kombinasjon med en annen isolat. Totalt 15 bakteriefrie kåler ble testet for hver behandling og høstet enten umiddelbart, på fire dager eller ved 10 dager etter inokulasjon.Isolatene viste rask vekst i Napa kål Phyllosphere. To gjær og tre bakterier ble inokulert i tre forskjellige typer sterile vegetabilske ekstrakt eller SVE laget av rød, grønn og Napa kål. Veksten av inokulene ble registrert over 14 dager ved å oppdage fem mikroliter av hver behandling på enten MRS eller YPD agar plater.Målinger av pH gjennom gjæringen viste at melkesyrebakteriene var i stand til å forsure SVE til nivåer under pH fire, noe som indikerer en gjæring som er trygg for forbruk. Disse metodene har spesielt brukt på kålmikrobiomet, men kan være nyttig i andre plantesystemer. Det kan være utfordrende å holde systemet sterilt, våre disposisjonsprotokoller er detaljerte, men vi fant hvert trinn for å være viktig.

Research

JoVE Journal

Environment

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Metoder for Performing Kors i<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Et nytt modellsystem for de Gress

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

Teknikk for å studere Arthropod og mikrobielle samfunn innen Tre Vev

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms.  Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Forbigående Gene Expression i Tobacco bruker Gibson forsamling og Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

LC-MS analyse av humane blodplater som en plattform for å studere mitokondrie Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Empirisk, Metagenomic og beregningsorientert teknikker belyse mekanismer av hvilke soppmidler kompromiss Bee helse

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Måle og kartlegge jorderosjon og deponering relatert til jord Carbonate konsentrasjoner Under landbruks forvaltningen

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Metodikk for å utvikle livet tabeller for fastsittende insekter i feltet ved hjelp av Whitefly, Bemisia tabaci, i bomull som et modellsystem

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

Teknikker for å undersøke anatomi av maur visuelle systemet

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

En fleksibel lavpris Hydroponic System for å vurdere anlegget Svar å små molekyler i Sterile forhold

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

In Vitro Stell av enslig bier: et verktøy for å vurdere larver risikofaktorer

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...