Name: a gnotobiotic system for studying microbiome assembly in the phyllosphere and in vegetable fermentation
Uploaded: 2020-06-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la subvención USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Tracy Debenport y Claire Fogan proporcionaron soporte técnico y Ruby Ye y Casey Cosetta proporcionan comentarios útiles sobre las primeras versiones de este manuscrito.

1. Cultivo de coles libres de gérmenes
<ol><li>Equipos de preparación para el cultivo de coles libres de gérmenes<ol>
<li>Limpieza de la arcilla calcinada para eliminar las partículas de polvo fino<ol>
<li>Enjuagar arcilla calcinada (Tabla de Materiales) al menos 3x con agua del grifo; drenar el agua. ADVERTENCIA: La arcilla calcinada produce polvo muy fino y se recomienda llevar una máscara protectora(Tabla de materiales)al lavar.</li>
			<li>Esparce la arcilla calcinada como ...

<ol>
	<li>Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+seasonality+of+core+phyllosphere+microbiota+on+perennial+biofuel+crops.">Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops.</a> Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).</li><li>Pii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+interactions+in+the+rhizosphere:+beneficial+influences+of+plant+growth-promoting+rhizobacteria+on+nutrient+acquisition+process.+A+review.">Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review.</a> Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).</li><li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health.">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota.">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Dinu, L. D., Bach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157:H7+in+the+phyllosphere+of+lettuce:+a+food+safety+risk+factor.">Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).</li><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere:+a+review.">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).</li><li>Bringel, F., Cou&#233;e, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+roles+of+phyllosphere+microorganisms+at+the+interface+between+plant+functioning+and+atmospheric+trace+gas+dynamics.">Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).</li><li>Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+succession+and+stochastic+variation+in+the+assembly+of+Arabidopsis+thaliana+phyllosphere+communities.">Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities.</a> mBio. 5 (1), e00682 (2014).</li><li>Carlstr&#246;m, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbiota+reveal+priority+effects+and+keystone+strains+in+the+Arabidopsis+phyllosphere.">Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).</li><li>Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiology+of+the+phyllosphere:+a+playground+for+testing+ecological+concepts.">Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts.</a> Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).</li><li>Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+abundance+of+phyllosphere+bacteria+are+linked+to+insect+herbivory.">Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory.</a> Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).</li><li>Williams, T. R., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phyllosphere+microbiota+composition+and+microbial+community+transplantation+on+lettuce+plants+grown+indoors.">Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors.</a> mBio. 5 (4), e01564 (2014).</li><li>Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+vegetables+and+fruits+through+lactic+acid+fermentation.">Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation.</a> Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).</li><li>K&#246;berl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+microbiome+shift+during+fermentation+of+medicinal+plants.">Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).</li><li>Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance,+diversity+and+plant-specific+adaptations+of+plant-associated+lactic+acid+bacteria.">Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria.</a> Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).</li><li>Miller, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+limitation+constrains+the+abundance+of+lactic+acid+bacteria+in+the+Napa+cabbage+phyllosphere.">Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).</li><li>Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+and+fermentation+patterns+of+lactic+acid+bacteria+associated+with+sauerkraut+fermentation.">Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation.</a> Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).</li><li>Yildiz, F., Westhoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+growth+of+lactic+acid+bacteria+in+cabbage+juice.">Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice.</a> Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).</li><li>Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+analysis+of+sauerkraut+fermentation+reveals+a+stable+and+rapidly+established+community.">Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community.</a> Foods. 7 (5), 77 (2018).</li><li>Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+tracking+and+succession+of+kimchi+lactic+acid+bacteria+during+fermentation.">Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation.</a> Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).</li><li>Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+Microbes,+Big+Yields:+enhancing+food+crop+production+with+biological+solutions.">Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions.</a> Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).</li><li>Knief, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaproteogenomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+phyllosphere+and+rhizosphere+of+rice.">Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice.</a> The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).</li><li>Wuyts, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrot+Juice+Fermentations+as+Man-Made+Microbial+Ecosystems+Dominated+by+Lactic+Acid+Bacteria.">Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).</li><li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Steinkraus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactic+acid+fermentation+in+the+production+of+foods+from+vegetables,+cereals+and+legumes.">Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).</li></ol>

Las plantas de repollo Napa libres de gérmenes se han utilizado para estudiar la limitación de dispersión de las bacterias del ácido láctico en la filosfera de repollo Napa17. Las coles Napa libres de gérmenes también se pueden utilizar para probar el crecimiento individual o par en la filosfera (Figura 1). Los métodos para la elaboración de extracto vegetal estéril han sido probados para tres variedades diferentes de repollo: rojo, verde y Napa. Cada una de...

La diversidad microbiana de la filosfera juega un papel importante en el mantenimiento de la salud de la planta y también puede influir en la capacidad de las plantas para soportar el estrés ambiental1,2,3,4,5. A su vez, la salud de los cultivos afecta directamente a la inocuidad y calidad de los alimentos6,,7. Las plantas desempeñan un papel en el funcionamiento del ecosistema y sus microbiomas asociados afectan a la capacidad de las plantas para llevar a cabo estas actividades, así como influyen directamente en el entorno en sí8. Mientras que los científicos han comenzado a descifrar la función y composición de la filosfera, los procesos ecológicos que influyen en la asamblea comunitaria microbiana filosfera no se entienden completamente9,,10. El microbioma filosfera es un excelente sistema experimental para estudiar la ecología de los microbiomas11. Estas comunidades son relativamente simples y muchos de los miembros de la comunidad se pueden cultivar en los medios de laboratorio estándar10,,12,,13.
Las hortalizas fermentadas son un sistema en el que la estructura comunitaria de la filosfera tiene importantes consecuencias. Tanto en el chucrut como en el kimchi, los microbios que se producen naturalmente en las hojas vegetales (la filosfera de las especies de Brassica) sirve como el inóculo para la fermentación14,15. Las bacterias del ácido láctico (LAB) se consideran miembros ubicuos de los microbiomas vegetales, sin embargo pueden estar en baja abundancia en la filosfera16. Una fuerte selección abiótica durante la fermentación impulsa un cambio en la composición de la comunidad microbiana que permite que las bacterias del ácido láctico aumenten en abundancia. A medida que LAB crece, producen ácido láctico que crea el ambiente ácido de los productos vegetales fermentados17. El vínculo entre la filosfera y el fermento proporciona la oportunidad de utilizar las verduras como modelo para entender cómo se estructuran los microbiomas.
Hemos desarrollado métodos para cultivar coles Napa libres de gérmenes y para inocularlas con comunidades microbianas específicas utilizando botellas de aerosol. Este es un método barato y confiable de inocular uniformemente el repollo con microbios individuales o comunidades mixtas. También se ha desarrollado un extracto vegetal estéril (SVE) a partir de tres tipos/variedades diferentes de col: repollo rojo y verde (Brassica oleracea) y repollo Napa (B. rapa). La adición de sal a estas SVEs replica el entorno de fermentación y permite estudios experimentales a pequeña escala y relativamente de alto rendimiento del ensamblaje del microbioma de fermentación. Estos métodos se pueden utilizar para estudiar el ensamblaje de la comunidad microbiana en la filosfera y cómo la dinámica de la comunidad microbiana en la filosfera puede estar relacionada con el éxito de la fermentación vegetal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-way tray tray</td>
			<td>Sigma Magenta</td>
			<td>T8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Round Boston Glass Bottle</td>
			<td></td>
			<td>GPS 712OZSPPK12BR</td>
			<td>Ordered on Amazon.com from various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basket coffee filters</td>
			<td>If you care</td>
			<td></td>
			<td>(unbleached paper) Purchased from Wholefoods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (mercury-free)</td>
			<td>Austin&#39;s</td>
			<td>50-010-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcined clay</td>
			<td>Turface</td>
			<td>MVP</td>
			<td>Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuisinart blender</td>
			<td>Cuisinart</td>
			<td></td>
			<td>Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>7-389-A</td>
			<td>American Educational Products</td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Aven</td>
			<td>18434</td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KleenGuard M10</td>
			<td>Kimberley-Clark</td>
			<td>64240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large plastic container</td>
			<td>Rubbermaid</td>
			<td></td>
			<td>Ordered on Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light racks</td>
			<td>Gardner&#39;s Supply</td>
			<td>39-357</td>
			<td>full-spectrum T5 fluorescent bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta tm 2-way caps</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Man, Rogosa, and Sharpe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0881-17-5</td>
			<td>This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pH probe</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8220BNWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropestle</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>215828</td>
			<td>Also called Pellet Pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS nutrient broth</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td>Murashige and Skoog Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napa cabbage seeds</td>
			<td>Johnny&#39;s Select Seeds</td>
			<td>2814G</td>
			<td>B. rapa var pekinensis (Bilko)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Used to make agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-842-941</td>
			<td>Teknova</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant tissue culture box</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Magenta GA-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serologial pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dowel</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>10805-018</td>
			<td>Autoclave before use to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizing 0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>974103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0370-17-3</td>
			<td>This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide orifice pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17007102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast, peptone and dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0428-17-5</td>
			<td>This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gnotobiotic system for studying microbiome assembly in the phyllosphere and in vegetable fermentation

La filosfera, la parte sobre el suelo de la planta que puede ser colonizada por microbios, es un sistema modelo útil para identificar procesos de ensamblaje comunitario microbiano. Este protocolo describe un sistema para estudiar la dinámica de la comunidad microbiana en la filosfera de las plantas de repollo de Napa. Describe cómo cultivar plantas libres de gérmenes en tubos de ensayo con un sustrato de arcilla calcinada y caldo de nutrientes. La inoculación de plantas libres de gérmenes con cultivos microbianos específicos ofrece oportunidades para medir el crecimiento microbiano y la dinámica comunitaria en la filosfera. A través del uso de extracto vegetal estéril producido a partir de coles cambios en las comunidades microbianas que se producen durante la fermentación también se puede evaluar. Este sistema es relativamente simple y barato de configurar en el laboratorio y se puede utilizar para abordar cuestiones ecológicas clave en el ensamblaje de la comunidad microbiana. También ofrece oportunidades para entender cómo la composición de la comunidad filosfera puede afectar la diversidad microbiana y la calidad de las fermentaciones vegetales. Este enfoque para el desarrollo de comunidades filosfera de repollo gnotobiótico podría aplicarse a otras especies de plantas silvestres y agrícolas.

Tasas de crecimiento de las coles Napa El método de esterilización de semillas fue probado con varias coles Napa diferentes (B. rapa var pekinese; Figura suplementaria 1) de un número de diferentes proveedores y todos crecieron consistentemente con tasas de crecimiento similares. Sin embargo, probando los métodos con diferentes especies de Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Gi...

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A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

Se ha desarrollado un método para cultivar coles Napa libres de gérmenes que permite a los investigadores evaluar cómo interactúan las especies microbianas individuales o las comunidades microbianas multiespecie en las superficies de las hojas de repollo. También se presenta un extracto vegetal estéril que se puede utilizar para medir los cambios en la composición de la comunidad durante la fermentación vegetal.

Un sistema gnotobiótico para el estudio del ensamblaje del microbioma en la filosfera y en la fermentación vegetal

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial ...

Usando este protocolo, podemos abordar preguntas clave con respecto a cómo los microbios se ensamblan e interactúan en la filosfera. Tiene el beneficio añadido de que mediante el uso del extracto vegetal estéril, podemos vincular la estructura de las comunidades de la esfera filo a su función durante la fermentación vegetal. Estas técnicas permiten a los científicos probar cómo interactúan los microbios en la esfera del filo y luego rastrear cómo estas comunidades de esferas filosas pueden afectar la fermentación.Para esterilizar la superficie las semillas de repollo, comience colocando 100 semillas en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Añadir un mililitro de 70% de etanol al tubo y vórtice durante cinco minutos. A continuación, utilice una pipeta para desechar el etanol.Añadir un mililitro de 50% de lejía y vórtice el tubo durante cinco minutos, luego desechar la lejía. Enjuague las semillas cuatro veces, añadiendo un mililitro de agua desionizada autoclavizada que vórtice el tubo, luego desechando el agua. Después del último enjuague, remoje las semillas en agua desionizada esterilizada durante dos a ocho horas para suavizar la capa de semillas antes de plantar.Pesar 10 gramos de arcilla de calcio limpia en un tubo de vidrio de 15 por 2,5 centímetros. Agregue aproximadamente nueve mililitros de caldo de MS preparado a cada tubo para cubrir la arcilla cálcrica. Tapar con holgura los tubos de vidrio con tapas de tubo de ensayo de 22 milímetros de dos vías.Autoclave los tubos a 121 grados centígrados durante 60 minutos. Al retirar los tubos del autoclave, empuje las tapas sobre los tubos de vidrio para sellarlos y, a continuación, enfríe los tubos a temperatura ambiente antes de usarlos. Cuando los tubos se han enfriado, utilice fórceps extra largos para colocar suavemente una semilla de repollo estéril en el centro de cada tubo.Encaje los tubos en una bandeja de siete vías y coloque la bandeja debajo de los bastidores de luz con un ciclo de luz de 16 horas a 24 grados centígrados. Las semillas desarrollarán su primera hoja verdadera después de cinco días, que es la primera hoja vascular después de que se hayan formado los cotiledones. Tiene un borde arrugado y está cubierto de tricombs.Para probar la esterilidad del repollo libre de gérmenes, agarre suavemente la base de la planta con fórceps esterilizados y extráigalo. Antes de retirar completamente el repollo del tubo, corte cuidadosamente las raíces con tijeras de disección esterilizadas. A continuación, compactar las hojas de repollo en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros.Añadir 400 microlitros de PBS a cada tubo de micro centrífuga y utilizar un micro pestle estéril para homogeneizar el repollo. Cuchilla 100 microlitros de la col homogeneizan sobre placas de agar, asegurándose de utilizar una punta de pipeta de orificio ancho. Para hacer reservas de glicerol de cepas inoculantes, raya suavemente las colonias individuales en dos o tres placas nuevas del mismo medio.Remar las colonias durante dos a cinco días, luego rasparlas de las placas en un tubo cónico de 15 mililitros con 15 mililitros de 15% de glicerol. Vórtice el tubo a fondo para mezclar. Aliquot un mililitro del glicerol mezclado en un tubo de micro centrífuga y almacenarlo 80 grados Celsius hasta que esté listo para usar junto con los 14 mililitros restantes de stock de glicerol.Una semana antes de su uso, descongelar la alícuota de un mililitro sobre hielo y colóquela en varias diluciones diferentes para determinar la concentración del stock de inoculación. Cuando esté listo para inocular el repollo, descongele el caldo de glicerol sobre hielo y diluya hasta la concentración deseada. Agregue 10 mililitros del stock diluido a la botella de la bomba estéril y bombee cinco pulverizaciones en un vaso de precipitados de recolección de residuos grande.Retire la tapa del tubo de repollo e incline el repollo hacia la botella de pulverización. Rocíe cada repollo con tres bombas de la solución de inoculación y, a continuación, cosecha un subconjunto de las coles para evaluar la concentración real de inoculación de entrada. Para cosechar el repollo, retírelo del tubo con fórceps esterilizados.Corte las raíces con tijeras de disección estériles y colóquela cuidadosamente en un tubo de micro centrífuga estéril prepesado. Registre el peso del repollo para futuros cálculos. Añadir 400 microlitros de PBS a cada tubo con el repollo y molerlo 30 veces con un micro peste, a continuación, placar el repollo homogeneizar utilizando puntas de pipeta de orificio ancho.Retire y deseche las hojas más externas del repollo y corte todo el repollo restante para caber en una licuadora. Licúe con una pulpa fina y pese la homogeneidad del repollo. Añadir dos mililitros de agua destilada por gramo de repollo.A continuación, filtre la suspensión de repollo a través de dos capas de filtros de café de cesta. Dispensar la suspensión en tubos centrífugos y centrifugarlo a 20.000 veces G durante 20 minutos o hasta que las partículas grandes se asienten fuera de la solución. Retire el sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar a los restos de repollo peletados.Para recrear las condiciones de fermentación con concentraciones de sal estándar, añada un 2% de peso al volumen de cloruro de sodio al extracto. Bilder el extracto vegetal con un filtro de 0,2 micrómetros unido a un vacío, dispensarlo en tubos estériles y congelarlo a menos 80 grados Centígrados. El método de esterilización de semillas fue probado con varias coles Napa y todos demostraron tasas de crecimiento similares.Sin embargo, otras especies de brassica dieron un éxito limitado porque las plantas tenían bajas tasas de germinación después de la esterilización o el tallo se alarga rápidamente para hacer una planta espinosamente insalubre. Los aislados microbianos se inocularon como aislados de una sola cepa o en combinación con otro aislado. Se analizaron un total de 15 coles libres de gérmenes para cada tratamiento y se cosecharon inmediatamente, a los cuatro días o a los 10 días después de la inoculación.Los aislados demostraron un rápido crecimiento en la repollo napa Phyllosphere. Dos levaduras y tres bacterias fueron inoculadas en tres tipos diferentes de extracto vegetal estéril o SVE hecho de repollo rojo, verde y napa. El crecimiento de las inoculadas se registró durante 14 días mediante el enchapado puntual de cinco microlitros de cada tratamiento en placas de agar MRS o YPD.Las mediciones del pH a lo largo de la fermentación mostraron que las bacterias del ácido láctico eran capaces de acidificar el SVE a niveles por debajo del pH cuatro, lo que indica un fermento que es seguro para el consumo. Estos métodos se han aplicado específicamente al microbioma de repollo, pero podrían ser útiles en otros sistemas vegetales. Puede ser difícil mantener el sistema estéril, nuestros protocolos de esquema son detallados, pero encontramos que cada paso es importante.

Research

JoVE Journal

Environment

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Investigación

Medio ambiente

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