Name: simple detection of primary cilia by immunofluorescence
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل وزارة الدفاع في الجمهورية التشيكية - خطة تطوير المنظمة الطويلة الأجل الجوانب الطبية لأسلحة الدمار الشامل التابعة لكلية العلوم الصحية العسكرية، جامعة الدفاع؛ وزارة التعليم والشباب والرياضة، الجمهورية التشيكية (مشروع البحث المحدد رقم SV/FVZ201703) و PROGRES Q40/06. شكرا أيضا لدانييل دياز على مساعدته الرقيقة في مراجعة اللغة الإنجليزية.

1. إعداد وسائل الإعلام الثقافية والحلول والأطباق
<ol><li>اُتّمَفّف الأغطية (22 × 22 مم). إعداد 6 لوحات جيدا. ذوبان مصل الأبقار الجنين (FBS) والمضادات الحيوية البنسلين / ستربتوميسين ودفء الثقافة المتوسطة لدرجة حرارة الغرفة (RT). استخدام التربسين-EDTA (0.25%) و 1x PBS (الفوسفات المخزنة المالحة مع الكالسيوم وا?...

<ol>
	<li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+primary+cilia:+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells,+but+a+"sleeping+beauty"+in+cultured+cells.">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li><li>Sloboda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primary cilia. , (2009).</li><li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control.">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts.">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation.">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li><li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length.">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li><li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys.">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).</li><li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism.">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li><li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neurons+show+a+primary+cilium.">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li><li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium.">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption,+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors.">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li><li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase,+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1.">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li><li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cilium:+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit.">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li><li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autophagy-Cilia+Axis:+An+Intricate+Relationship.">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905 (2019).</li><li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+primary+cilia+dynamics+using+fluorescence+microscopy.">Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2012).</li><li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia.">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li><li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+(ACDC).">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1 (2019).</li><li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis.">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+novel+machineries+required+for+both+ciliogenesis+and+cell+cycle+arrest+upon+serum+starvation.">Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).</li><li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer:+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues.">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li><li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li><li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding.">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).</li><li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling.">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5 (2017).</li><li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models.">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11 (2015).</li><li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy.">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li></ol>

وقد وصف العديد من المؤلفين أساليب متنوعة للكشف عن أهداب الأولية، وأحيانا أيضا وصف مختلف طرق التثبيت التي يمكن أن تؤثر على الكشف6،20،21،22. بغض النظر عن ذلك، من الصعب العثور على بروتوكول كامل ومباشر للكشف. ومما لا شك فيه أن ...

الإهداب الأولية هي الحسية، الانفرادي، الغشاء ملزمة، الهياكل غير المبتدئ المرتبطة بالهيكل المركزي الأم للخلية. تم العثور على أهداب الأولية في معظم الخلايا الفقارية باستثناء خلايا الدم الحمراء، adipocytes1، وخلايا2. تتشكل الأهداب الأولية كمحور ممدود يتكون من ميكروتومات، المكون الرئيسي لها هو α-tubulin. ينمو الفأس من الجسم القاعدي، الذي يتم تنظيمه من γ-tubulin. ويتراوح طول الأهداب الأولية بين 2-10 ميكرومتر؛ ومع ذلك، يمكن أن تتغير أبعاده أثناء الجليسيليشن، والتجويع، ونقص الأكسجة، والإجهاد السام للخلايا، أو بعد التعرض للإشعاع المؤين3،4،5،6،7. عادة, الخلايا لديها واحد فقط cilium الابتدائي, التي تشارك في morphogenesis والخلايا إشارات مسارات هامة لانتشار الخلايا والتمايز8,,9.
يتم تنظيم أهداب الابتدائية بشكل ديناميكي خلال تطور دورة الخلية ، وتحديدا خلال مراحل G0/G1 ، وإعادة ترسب قبل دخول الانقسام في عملية مرتبطة بفك الacetylation tubulin بوساطة HDAC6 (histone deacetylase 6)10. الدقيقة لحظة سيليا resorption الأساسي يعتمد على نوع الخلية والتعبير عن الجينات المشاركة مباشرة في هذه العملية، مثل أورورا A، Plk1، TcTex-11،11,12،,13. اعتمادا على نوع الخلية، والإهداب الأولية التعبير عن أنواع مختلفة من المستقبلات، والقنوات الأيونية، ومسارات الإشارات النشطة. وتشمل هذه أهم مستقبلات الإشارات التي تؤثر على الانتشار والبقاء على قيد الحياة، EGFR، PDGFR، وFGFR. وشملت أيضا بعض المسارات الإشارات التي قد تؤثر على وظيفة واحد أو أكثر من الأجهزة، بما في ذلك القنفذ، نوتش، وWNT. وبفضل هذه المستقبلات ومسارات الإشارات، والأهداب الأولية أيضا أداء وظيفة العلاج الكيميائي. هذه الوظيفة تسمح أهداب الأولية للكشف عن يغاند محددة لرقم, الهرمونات, والمواد النشطة بيولوجيا مثل السيروتونين أو سوماتوستاتين. وتشمل الوظائف المحددة الأخرى التي تظهر من قبل أهداب الابتدائية من أطوال مختلفة رد فعل للتغيرات في درجة الحرارة, الجاذبية, وosmolality14.
يمكن تصور الإهداب الأولية من خلال طرق مختلفة ، مثل التصور الحي ، والمجهر الإلكتروني انتقال ، التصوير ثلاثي الأبعاد ، أو عن طريق برنامج للكشف التلقائي عن الإهدابالابتدائية 5،15،16،17. ومع ذلك، هذه الأساليب هي متخصصة للغاية والبحث المستمر يحتاج إلى أساليب أساسية وسريعة وسهلة لتلوين أهداب الأولية في كل مرحلة من مراحل البحث. وصفها هو وسيلة سهلة ومفيدة للكشف عن أهداب الأولية في الخلايا المستزرعة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1301px;" width="1301">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">6-well plate</td>
			<td style="width:217px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92406</td>
			<td style="width:581px;">Dimensions 128x86x22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">111-546-047</td>
			<td>AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Goat Anti-Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Anti-Tubulin &#947;</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T5192</td>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">C2C12</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1772</td>
			<td>Myoblast (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Cy3</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2181</td>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab&#8242;)2 fragment&#8211;Cy3 antibody produced in sheep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dapi (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s medium</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td>High glucose, No glutamine, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:384px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td>With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">MEF</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">SCRC-1039</td>
			<td>Mouse embryonic fibroblast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7451</td>
			<td>Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">NHLF</td>
			<td style="width:217px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2512</td>
			<td>Primary lung fibroblasts (human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127-500G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:384px;">Skin fibroblasts</td>
			<td style="width:217px;">Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Kr&#225;lov&#233;.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Square Cover Slips</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22X22-1.5</td>
			<td>Borosilicate glass, 22x22mm, Square</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple detection of primary cilia by immunofluorescence

يتم تنظيم الإهداب الأولية ديناميكيًا أثناء تطور دورة الخلية ، وتحديدًا خلال مراحل G0/G1 من دورة الخلية ، ويتم إعادة ترسبها قبل الانقسام. يمكن تصور الإهداب الأولية بطرق متطورة للغاية ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني للإرسال ، والتصوير ثلاثي الأبعاد ، أو استخدام برامج للكشف التلقائي عن الأهداب الأولية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى تلطيخ من الإهداب الأولية لإجراء هذه الطرق. يصف هذا المنشور بروتوكولًا للكشف السهل عن أهداب الأولية في المختبر عن طريق تلطيخ أسيتيلات ألفا توبولين (axoneme) وa توبولين غاما (الجسم القاعدي). هذا البروتوكول الملطّف بالفلورات الملطّف بسيط نسبيًّا وينتج صورًا عالية الجودة. يصف هذا البروتوكول كيف أن أربعة خطوط خلايا (C2C12، MEF، NHLF، والخلايا الليفية الجلدية) التي تعبر عن الأهداب الأولية كانت ثابتة ومثبطة للمناعة وصورة مع مجهر فلوري أو مجهري.

إن تلطيخ الإهداب الأولية هو إجراء بسيط نسبيًا ينتج عنه صور عالية الجودة. في هذه التجارب، كانت الخلايا الليفية التي تعبر عن أهداب أولي ثابتة، ومثبطة للمناعة، ومصوّبة في مجهر فلوري أو مجهري متوازٍ باتباع البروتوكول الموصوف أعلاه. تم الكشف عن السيليوم الابتدائي باستخدام أسيتيل α-tubulin و γ-tubuli...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

الإهداب الأولية هي هياكل خارج الخلية المرتبطة بالهيكل المركزي. الكشف عن الإهداب الأولية عن طريق تلطيخ الفلوروس المناعة هو إجراء بسيط نسبيا أن النتائج في صور عالية الجودة للغاية. في هذا البروتوكول، كانت الخلايا الليفية التي تعبر عن أهداب أولية ثابتة، ومثبطة للمناعة، ومصوّبة في مجهر فلوري أو مجهري.

اكتشاف بسيط من سيليا الأولية من قبل المناعةfluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

يسمح هذا البروتوكول بالكشف السريع والسهل عن أهداب الأولية في الخلايا المستزرعة، ضمن مجموعة متنوعة من المساعي البحثية. ويمكن استخدام هذه الطريقة في اضطراب التي تؤثر على الأجسام القاعدية من أهداب الأولية. ويمكن أيضاً تطبيق هذا الإجراء على تلطيخ الأهداب الأولية في الأنسجة المدمجة البارافين أو لتجارب أخرى حيث يلزم التألق.تبدأ autoclaving 22 في 22 ملليمتر غطاء زلات ، وإعداد المواد اللازمة للتجربة. ذوبان FBS والبنسلين ستريبتوميسين، ودفء الثقافة المتوسطة لدرجة حرارة الغرفة. مرور الخلايا مع التربسين EDTA وPS.إعداد 4٪ paraformaldehyde الطازجة، والثقافة المتوسطة، و 1٪ حل الجيلاتين، وفقا لاتجاهات المخطوطات. ثم تنظيف غطاء محرك تدفق الفاتن مع 70٪ الإيثانول، ووضع جميع المواد المطلوبة داخل. ما قبل الفورمالدلديهايد هو خطير للغاية.يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة في جميع الأوقات ، ويجب التعامل معها فقط في غطاء كيميائي. بعد تزايد الخلايا المطلوبة إلى التقاء 70٪ إزالتها من الحاضنة، ووضعها في غطاء محرك التدفق الفاتنة. إزالة المتوسطة الثقافة وشطف الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.إضافة حوالي ملليلتر من 0.25٪ التربسين EDTA إلى قارورة الثقافة، واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تحقق من الخلايا بشكل دوري على المجهر المقلوب لمراقبة الانفصال. عندما تكون الخلايا قد فصلت بلطف resuspend لهم في 10 ملليلتر من ثقافة المتوسطة، pipetting بعناية لخلق تعليق خلية واحدة.نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر والطرد المركزي في 200 مرة G'لمدة خمس دقائق. decant المابير ثم إضافة 10 ملليلتر من المتوسطة الثقافة، وبلطف resuspend بيليه. خذ 20 ميكرولترات من تعليق الخلية ومزجها مع الأزرق trypan بنسبة حجم واحد إلى واحد.ثم عد الخلايا باستخدام قياس الهيموسيت القياسي. وضع زلة غطاء داخل كل بئر من ستة صحن البئر، ومعطف زلة الغطاء مع مليلترين من الحل الجيلاتين، والتي سوف تساعد الخلايا تعلق على زلة الغطاء. إزالة الجيلاتين والسماح لوحة الهواء الجاف لبضع دقائق.بذور 100،000 الخلايا الليفية في كل بئر وإضافة ملليلتر من الثقافة المتوسطة. ثم احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون، والرطوبة النسبية 90٪. بعد الحضانة علاج الخلايا للحث على ciliation.ادفأ 4٪ من الـ paraformaldehyde إلى درجة حرارة الغرفة، واحضر ماصات المراعي، وABS، وحاوية نفايات، 15 ملليلتر أنابيب مخروطية، ماصات صغيرة، ونصائح. خذ الخلايا من الحاضنة، ووضعها على مقعد المختبر. إزالة الوسائط من كل بئر، وترك زلة الغطاء.غسل الخلايا بلطف ثلاث مرات مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني. ثم أضف مليلترين من 4٪ PFA في كل بئر لإصلاح الخلايا. احتضان لوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم إزالة PFA، وتكرار يغسل مع برنامج تلفزيوني.إضافة ملليلترين من 0.5٪ تريتون X-100 إلى كل بئر، واحتضان لوحة لمدة 15 دقيقة. ثم غسل الآبار أربع مرات مع برنامج تلفزيوني. لجعل حل الحجب، ذوبان مصل الماعز لمدة خمس دقائق، وتمييع في برنامج تلفزيوني بنسبة 1-20.إضافة 150 ميكرولترات من هذا الحل إلى كل زلة الغطاء، واحتضان لوحة لمدة 20 دقيقة. اذيب الأجسام المضادة الأولية لمدة خمس دقائق، وتمييعها بشكل منفصل في PBS، كما هو موضح في المخطوطة النص. قم بإزالة حل الحظر من قسائم الغطاء وأضف 150 ميكرولترات من كلا الحلين المضادين.ثم احتضان لوحة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل بلطف زلات الغطاء ثلاث مرات مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني. تمييع Cy3 الأغنام المضادة للماوس واليكسا فلور 488 الماعز المضادة الأرنب في برنامج تلفزيوني، بنسبة واحد إلى 300، وإضافة 150 ميكرولترات من كل من الحلول المضادة الثانوية لزلة الغطاء.إعداد حل DAPI العمل عن طريق تخفيف 10 ميكرولترات من المخزون في 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، وإضافة ملليلترين من هذا التخفيف إلى زلات الغطاء. احتضان لوحة لمدة خمس دقائق في الظلام، في درجة حرارة الغرفة. قبل وضع زلات الغطاء على الشرائح، قم بإعداد إبرتين، ملاقط، ووسائط متصاعدة، وتسمية جميع الشرائح.إزالة حل DAPI من الآبار، وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. وضع قطرة واحدة من وسائط متزايدة على كل شريحة. استخدم الإبرة لرفع زلة الغطاء بلطف من أسفل البئر.ثم الوجه ووضعها بلطف على قطرة من تصاعد وسائل الإعلام باستخدام الملاقط. إزالة بعناية أي فقاعات. حماية الشرائح من الضوء وتخزينها بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.في اليوم التالي استخدام المجهر الفلورسنت أو confocal مع التكبير عالية لتصور أهداب الأولية. تم استخدام هذا البروتوكول لإصلاح مناعية، وصورة مختلف خطوط الخلية التعبير عن أهداب الأولية. عندما تعرضت الماوس myoblasts للإشعاع المؤين في جرعات مختلفة، وجد أن جرعات أعلى تحفز ظهور الإهداب الابتدائية متعددة.في حين أن الجرعات المنخفضة أسفرت عن ظهور أهداب أولي واحد. وبالمثل، عندما كانت الخلايا الليفية الرئة البشرية تشع بجرعة منخفضة، تم الكشف عن أهداب أولي واحد عن طريق الفلوروس. لوحظت زيادة في الإهداب الأولية في الخلايا الليفية الجنينية الماوس التي كانت جائعة، مما يدل على أن الإجهاد الأيضي يؤثر على حوادث أهداب الأولية.عندما تم علاج الخلايا الليفية الجلدية بـ 120 دوكسوروبيسين نانومولاري، أعربوا عن سيليوم أولي واحد. جرعات أعلى تحفز ظهور الإهداب الابتدائية المتعددة. الليفية تعامل مع 1.25 نانومولار تاكسول أعرب أيضا عن cilium الأولية واحدة.ولكن لم يتم الكشف عن العديد من الأهداب بعد العلاج بجرعات أعلى. عند فتح هذا البروتوكول تأكد من اتباع جميع لوائح PPE. نضع في اعتبارنا احتياجات الثقافة من خط الخلية الخاصة بك من اختيار واختار الأجسام المضادة بعناية.ولا يمكن اتباع هذا الإجراء مباشرة بإجراءات أخرى، لأن الخلايا لا يمكن استرجاعها. وبدلا من ذلك، ينبغي برمجة التجارب المتوازية.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

مناعي الكشف عن النظائر ثيميدين الثاني (CldU وإيدو) في الأنسجة الابتدائية

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

الكشف عن مصفوفة Metalloproteinases الوظيفية التي Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

الكشف عن مرحلة ما بعد التعديلات متعدية على Nucleosomes سليمة الأصلية بواسطة ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

تحليل وظائف الجينات والتخيل ولدت سيليا من تدفق السوائل في حويصلة كوبفر

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

الكشف عن تنشيط يجند G-إلى جانب البروتين مستقبلات التطبع التي كتبها متحد البؤر المجهري

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...