Name: simple detection of primary cilia by immunofluorescence
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Forsvarsministeriet i Tjekkiet - Langsigtet organisation udviklingsplan Medicinske aspekter af masseødelæggelsesvåben af Fakultetet for MilitærSundhedsvidenskab, University of Defence; Ministeriet for Uddannelse, Ungdom og Sport, Tjekkiet (Specifikt forskningsprojekt Nr.: SV/ FVZ201703) og PROGRES Q40/06. Også tak til Daniel Diaz for hans venlige hjælp i engelsk revision.

1. Forberedelse af kultur medier, løsninger og retter
<ol><li>Autoklave dækslerne (22 x 22 mm). Forbered 6 brøndplader. Optø fosterets serum (FBS) og antibiotisk penicillin/streptomycin, og varm dyringsmediet til stuetemperatur (RT). Brug trypsin-EDTA (0.25%) og 1x PBS (fosfat buffered saltvand med calcium og magnesium) til passage af cellerne.</li>
	<li>Der tilberedes frisk 4% paraformaldehyd (PFA) i dH2O (800 mg PFA i 20 ml dH2O). PFA skal være frisklavet til hvert forsøg. Opløsningen omr...

<ol>
	<li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+primary+cilia:+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells,+but+a+"sleeping+beauty"+in+cultured+cells.">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li><li>Sloboda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primary cilia. , (2009).</li><li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control.">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts.">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation.">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li><li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length.">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li><li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys.">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).</li><li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism.">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li><li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neurons+show+a+primary+cilium.">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li><li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium.">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption,+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors.">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li><li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase,+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1.">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li><li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cilium:+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit.">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li><li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autophagy-Cilia+Axis:+An+Intricate+Relationship.">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905 (2019).</li><li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+primary+cilia+dynamics+using+fluorescence+microscopy.">Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2012).</li><li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia.">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li><li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+(ACDC).">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1 (2019).</li><li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis.">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+novel+machineries+required+for+both+ciliogenesis+and+cell+cycle+arrest+upon+serum+starvation.">Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).</li><li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer:+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues.">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li><li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li><li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding.">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).</li><li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling.">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5 (2017).</li><li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models.">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11 (2015).</li><li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy.">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li></ol>

Flere forfattere har beskrevet forskellige metoder til påvisning af primære cilier, undertiden også beskriver forskellige fiksering metoder, der kan påvirke derespåvisning6,20,,21,22. Uanset hvad, er det svært at finde en komplet og ligetil protokol til registrering. Den disponibile metode vil uden tvivl være til stor hjælp for undersøgelsen af den primære cilierundersøgelse, især i...

Primære cilier er sensoriske, ensomme, membran-bundet, ikke-tåtil strukturer forbundet med cellens mor centriole. Primære cilier findes på de fleste hvirveldyr celler med undtagelse af røde blodlegemer, adipocytter1, og hepatocytes2. Primær cilier dannes som en aflang axonme sammensat af mikrotubuli, hvis hovedkomponent er α-tubulin. Axonemet vokser fra den basale krop, som er struktureret fra γ-tubulin. Længden af den primære cilier varierer mellem 2-10 μm; dimensionerne kan dog ændre sig under glycylation, sult, hypoxi, cytotoksisk stress eller efter udsættelse for iioniserendestråling 3,4,,5,6,7. Normalt har celler kun ét primært cilium, som er involveret i morfogenese og cellesignalveje, der er vigtige for celleproliferedning og differentiering8,9.
Primære cilier reguleres dynamisk under cellecyklusprogression, specielt i G0/G1-faserne, og resorberes, før de indtastes i mitose i en proces forbundet med tubulindeacetylation medieret af HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Det nøjagtige øjeblik for primær cilia resorption afhænger af celletype og udtryk for gener direkte involveret i denne proces, såsom Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. Afhængigt af celletypen udtrykker den primære cilier forskellige typer receptorer, ionkanaler og aktive signalveje. Disse omfatter de vigtigste signalreceptorer, der påvirker spredning og overlevelse, EGFR, PDGFR og FGFR. Også inkluderet er nogle af de signalveje, der kan påvirke funktionen af et eller flere organer, herunder pindsvin, Notch, og Wnt. Takket være disse receptorer og signalveje, den primære cilier også udføre en kemosensorisk funktion. Denne funktion gør det muligt for primære cilier at opdage specifikke ligander for Notch, hormoner, og biologisk aktive stoffer såsom serotonin eller somatostatin. Andre specifikke funktioner udstillet af primære cilier af forskellige længder omfatter reaktion på ændringer i temperatur, tyngdekraft, og osmolalitet14.
Primær cilier kan visualiseres ved hjælp af forskellige metoder, såsom levende visualisering, transmission elektron mikroskopi, 3D-billedbehandling, eller ved software til automatisk påvisning af primære cilier5,15,16,17. Men disse metoder er højt specialiserede og igangværende forskning behov grundlæggende, hurtig og nem metoder til farvning primære cilier i alle faser af forskningen. Beskrevet er en nem og nyttig metode til påvisning af primære cilier i dyrkede celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1301px;" width="1301">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">6-well plate</td>
			<td style="width:217px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92406</td>
			<td style="width:581px;">Dimensions 128x86x22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">111-546-047</td>
			<td>AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Goat Anti-Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Anti-Tubulin &#947;</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T5192</td>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">C2C12</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1772</td>
			<td>Myoblast (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Cy3</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2181</td>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab&#8242;)2 fragment&#8211;Cy3 antibody produced in sheep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dapi (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s medium</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td>High glucose, No glutamine, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:384px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td>With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">MEF</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">SCRC-1039</td>
			<td>Mouse embryonic fibroblast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7451</td>
			<td>Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">NHLF</td>
			<td style="width:217px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2512</td>
			<td>Primary lung fibroblasts (human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127-500G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:384px;">Skin fibroblasts</td>
			<td style="width:217px;">Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Kr&#225;lov&#233;.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Square Cover Slips</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22X22-1.5</td>
			<td>Borosilicate glass, 22x22mm, Square</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple detection of primary cilia by immunofluorescence

Primære cilier reguleres dynamisk under cellecyklusprogression, specielt i G0/G1-faserne af cellecyklussen, og som resorberes før mitose. Primær cilier kan visualiseres med meget avancerede metoder, herunder transmission elektron mikroskopi, 3D-billeddannelse, eller ved hjælp af software til automatisk påvisning af primære cilier. Men, immunfluorescerende farvning af primære cilier er nødvendig for at udføre disse metoder. Denne publikation beskriver en protokol til nem påvisning af primær cilier in vitro ved farvning acetylerede alpha tubulin (axoneme) og gamma tubulin (basal krop). Denne immunfluorescerende farvning protokol er relativt enkel og resulterer i billeder i høj kvalitet. Denne protokol beskriver, hvordan fire cellelinjer (C2C12, MEF, NHLF og hudfibroblaster), der udtrykker primær cilier, blev fikseret, immunstained og afbildet med et fluorescerende eller konfokal mikroskop.

Den immunfluorescerende farvning af primære cilier er en forholdsvis enkel procedure, der resulterer i billeder af høj kvalitet. I disse forsøg blev fibroblaster, der udtrykte primær cilier, fikseret, immunstained og afbildet i et fluorescerende eller konfokal mikroskop efter den protokol, der er beskrevet ovenfor. Det primære cilium blev påvist ved hjælp af acetyleret α-tubulin og γ-tubulin. Evalueringen af primær cilier kan udføres på forskellige niveauer, og enhver ændring i denne henseende kan kædes sam...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primære cilier er ekstracellulære strukturer forbundet med centriole. Primær cilia detektion ved immunfluorescerende farvning er en forholdsvis enkel procedure, der resulterer i ekstremt høj kvalitet billeder. I denne protokol, fibroblaster udtrykke primære cilier blev fastsat, immunstained, og afbildet i en fluorescerende eller konfokal mikroskop.

Simpel påvisning af primær cilier ved immunofluorescens

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Denne protokol giver mulighed for hurtig og nem påvisning af primære cilier i dyrkede celler, inden for en række forskellige forskning bestræbelser. Metoden kan anvendes i lidelse, der påvirker de basale organer af primære cilier. Denne procedure kan også anvendes til farvning primær cilier i paraffin indlejret væv eller til andre forsøg, hvor fluorescens er nødvendig.Begynd med autoclaving 22 med 22 millimeter dække glider, og forberede materialer til forsøget. Tø FBS og penicillin streptomycin, og varm kulturmediet til stuetemperatur. Passage cellerne med trypsin EDTA og PBS.Forbered frisk 4% paraformaldehyd, kultur medium, og 1% gelatine opløsning, i henhold til manuskript retninger. Rengør derefter laminar flow hætte med 70% ethanol, og læg alle nødvendige materialer inde. Paraformaldehyd er yderst farligt.Korrekt PV skal bæres på alle tidspunkter, og det bør kun håndteres i en kemisk hætte. Efter dyrkning de ønskede celler til 70% sammenløb fjerne dem fra inkubatoren, og læg dem i laminar flow hætte. Fjern kulturmediet, og skyl cellerne to gange med PBS.Tilsæt omkring to milliliter på 0,25% trypsin EDTA til kulturkolben, og inkuber det ved 37 grader Celsius i fem minutter. Kontroller cellerne med jævne mellemrum på det omvendte mikroskop for at overvåge løsrivelse. Når cellerne har afmonteret forsigtigt resuspend dem i 10 milliliter kultur medium, pipettering omhyggeligt at skabe en enkelt celle suspension.Cellesuspension overføres til et konisk rør på 50 milliliter, og det centrifugeres ved 200 gange G'i fem minutter. Dekanter supernatanten derefter tilføje 10 milliliter kultur medium, og forsigtigt resuspend pellet. Tag 20 mikroliter af cellesuspensionen og bland den med trypanblå ved et en-til-en volumenforhold.Derefter tælle cellerne ved hjælp af standard hæmocytometri. Placer en dæksel inde i hver brønd af en seks brøndplade, og pels dækslet slip med to milliliter af gelatine opløsning, som vil hjælpe cellerne knyttet til dækslet slip. Fjern gelatine og lad pladen lufttørre i et par minutter.Seed 100, 000 fibroblaster i hver brønd og tilsæt to milliliter kultur medium. Derefter inkubere cellerne i 24 timer ved 37 grader Celsius, fem procent kuldioxid, og 90% relativ luftfugtighed. Efter inkubationen behandle cellerne til at fremkalde ciliaation.Varm 4% paraformaldehyd til stuetemperatur, og forberede en græs pipetter, ABS, en affaldsbeholder, 15 milliliter koniske rør, mikro pipetter, og tips. Tag cellerne fra kuvøsen, og læg dem på laboratoriebænken. Fjern medier fra hver brønd, så dækslet glider.Vask forsigtigt cellerne tre gange med to milliliter PBS. Derefter tilsættes to milliliter af 4% PFA i hver brønd for at fastsætte cellerne. Pladen inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur, fjern derefter PFA, og gentag vaskerne med PBS.Tilsæt to milliliter 0,5% Triton X-100 til hver brønd, og inkuber pladen i 15 minutter. Vask derefter brøndene fire gange med PBS. For at gøre blokeringsopløsningen skal du optø et gedeserum i fem minutter og fortynde det i PBS i et forhold på 1-20.Tilsæt 150 mikroliter af denne opløsning til hver dækselseddel, og inkuber pladen i 20 minutter. Optø de primære antistoffer i fem minutter, og fortynd dem separat i PBS, som beskrevet i tekstmanuskriptet. Fjern blokeringsopløsningen fra dækslet, og tilsæt 150 mikroliter af begge antistofopløsninger.Derefter inkuberes pladen i 60 minutter ved stuetemperatur. Fjern de primære antistoffer, og vask forsigtigt dækslet tre gange med to milliliter PBS. Fortynd Cy3 Sheep Anti-Mouse og Alexa fluor 488 Goat anti-Rabbit i PBS, ved et 1 til 300 forhold, og tilsæt 150 mikroliter af begge sekundære antistofopløsninger til dækslet.Der tilberede en fungerende DAPI-opløsning ved at fortynde 10 mikroliter af bestanden i 50 milliliter PBS, og der tilsættes to milliliter af denne fortynding til dækslerne. Inkuber pladen i fem minutter i mørke ved stuetemperatur. Før du placerer dækslet glider på dias, forberede to nåle, pincet, og montering medier, og mærke alle dias.Fjern DAPI-opløsningen fra brøndene, og vask dem tre gange med PBS. Sæt en dråbe monteringsmedie på hvert dias. Brug nålen til forsigtigt at løfte dækslet fra brøndens bund.Vend den derefter forsigtigt over dråbe monteringsmedier ved hjælp af pincet. Fjern forsigtigt eventuelle bobler. Beskyt dias fra lys og gemme dem natten over på fire grader Celsius.På den næste dag bruge en fluorescerende eller konfokal mikroskop med en høj forstørrelse til at visualisere den primære cilier. Denne protokol blev brugt til at fastsætte immunostain, og billede forskellige cellelinjer udtrykke primære cilier. Når mus myoblaster blev udsat for iioniserende stråling ved forskellige doser, blev det konstateret, at højere doser fremkalde udseendet af flere primære cilier.Mens lave doser resulterede i fremkomsten af enkelt primære cilier. Tilsvarende, når menneskelige lunge fibroblaster blev udstrålet ved en lav dosis, enkelt primære cilier blev påvist ved immunfluorescens. En stigning i primær cilier blev observeret i mus embryonale fibroblaster, der blev udsultet, viser, at metabolisk stress påvirker hændelser af primære cilier.Når hud fibroblaster blev behandlet med 120 nanomolar doxorubicin, udtrykte de en enkelt primær cilium. Højere doser fremkalde udseendet af flere primære cilier. Fibroblaster behandlet med 1,25 nanomolar Taxol udtrykte også en enkelt primær cilium.Men flere cilier blev ikke påvist efter behandling med højere doser. Når du åbner denne protokol, skal du sørge for at følge alle PPE-regler. Husk kultur behov i din celle linje valg og valgte dine antistoffer omhyggeligt.Denne procedure kan ikke følges direkte af andre procedurer, da cellerne er uigenkaldelige. I stedet bør der programmeres parallelle eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Påvisning af viralt RNA ved fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Analyse af genfunktioner og Visualisering af Cilia er genereret Fluid Flow i Kupffer s vesikel

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Analyse af apoptose i zebrafisk embryoner Whole-mount Immunofluorescens Detect Aktiveret Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fækal Glukokortikoid Analyse: Non-invasive Adrenal Overvågning i dyr fra hestefamilien

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Påvisning af ligand-aktiverede G-protein-koblede receptorer Internalisering af konfokal mikroskopi

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...