Name: simple detection of primary cilia by immunofluorescence
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Verteidigungsministerium der Tschechischen Republik unterstützt - Langfristiger Organisationsentwicklungsplan Medizinische Aspekte von Massenvernichtungswaffen der Fakultät für Militärische Gesundheitswissenschaften, Universität für Verteidigung; Ministerium für Bildung, Jugend und Sport, Tschechische Republik (Spezifisches Forschungsprojekt Nr.: SV/ FVZ201703) und PROGRES Q40/06. Danke auch an Daniel Diaz für seine freundliche Unterstützung in der englischen Sprachrevision.

1. Zubereitung von Kulturmedien, Lösungen und Gerichten
<ol><li>Autoclave die Abdeckungen (22 x 22 mm). Bereiten Sie 6 Brunnenplatten vor. Fetales Rinderserum (FBS) und Antibiotikum Penicillin/Streptomycin auftauen und das Kulturmedium auf Raumtemperatur (RT) erwärmen. Trypsin-EDTA verwenden (0,25%) und 1x PBS (Phosphat gepufferte Saline mit Kalzium und Magnesium) um die Zellen zu durchführen.</li>
	<li>Frisches 4% Paraformaldehyd (PFA) in dH2O (800 mg PFA in 20 ml dH2O) zubereiten. Die PFA mus...

<ol>
	<li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+primary+cilia:+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells,+but+a+"sleeping+beauty"+in+cultured+cells.">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li><li>Sloboda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primary cilia. , (2009).</li><li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control.">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts.">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation.">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li><li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length.">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li><li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys.">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).</li><li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism.">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li><li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neurons+show+a+primary+cilium.">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li><li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium.">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption,+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors.">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li><li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase,+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1.">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li><li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cilium:+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit.">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li><li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autophagy-Cilia+Axis:+An+Intricate+Relationship.">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905 (2019).</li><li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+primary+cilia+dynamics+using+fluorescence+microscopy.">Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2012).</li><li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia.">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li><li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+(ACDC).">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1 (2019).</li><li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis.">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+novel+machineries+required+for+both+ciliogenesis+and+cell+cycle+arrest+upon+serum+starvation.">Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).</li><li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer:+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues.">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li><li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li><li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding.">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).</li><li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling.">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5 (2017).</li><li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models.">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11 (2015).</li><li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy.">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li></ol>

Mehrere Autoren haben verschiedene Methoden für den Nachweis von primären Zilien beschrieben, manchmal auch verschiedene Fixierungsmethoden beschreiben, die ihre Erkennung beeinflussen können6,20,21,22. Unabhängig davon ist es schwierig, ein vollständiges und einfaches Protokoll für die Erkennung zu finden. Die Verfügbarkeit einer solchen Methode wäre zweifellos eine große Hilfe für d...

Primäre Zilien sind sensorische, einsame, membrangebundene, nichtmotile Strukturen, die mit dem Mutterzenriole der Zelle assoziiert sind. Primäre Zilien sind auf den meisten Wirbeltierzellen mit Ausnahme von roten Blutkörperchen, Adipozyten1und Hepatozyten2gefunden. Primäre Zilien werden als läntiges Axonem gebildet, das aus Mikrotubuli besteht, deren Hauptbestandteil das -Tubulin ist. Das Axonem wächst aus dem Basalkörper, der aus dem Tubulin strukturiert ist. Die Länge der primären Zilien variiert zwischen 2–10 m; jedoch können sich seine Abmessungen während der Glykolation, des Hungers, der Hypoxie, des zytotoxischen Stresses oder nach der Exposition gegenüber ionisierender Strahlungändern 3,4,5,6,7. In der Regel haben Zellen nur ein primäres Cilium, das an Morphogenese und Zellsignalbahnen beteiligt ist, die für die Zellproliferation und -differenzierung wichtig sind8,9.
Primäre Zilien werden während des Zellzyklusverlaufs dynamisch reguliert, insbesondere während der G0/G1-Phasen, und vor dem Eintritt in die Mitose in einem Prozess im Zusammenhang mit der Tubulin-Deacetylierung, die durch HDAC6 (Histondeacetylase 6)10vermittelt wird, resosorbiert. Das genaue Moment der primären Zilienresorption hängt vom Zelltyp und der Expression von Genen ab, die direkt an diesem Prozess beteiligt sind, wie Aurora A, Plk1, TcTex-1111,12,13. Je nach Zelltyp exprimieren die primären Zilien verschiedene Arten von Rezeptoren, Ionenkanälen und aktiven Signalsignalen. Dazu gehören die wichtigsten Signalrezeptoren, die Proliferation und Überleben beeinflussen, EGFR, PDGFR, und FGFR. Ebenfalls enthalten sind einige der Signalwege, die die Funktion eines oder mehrerer Organe beeinflussen können, einschließlich Igel, Kerb, und Wnt. Dank dieser Rezeptoren und Signalwege, die primäre Zilien führen auch eine chemosensorische Funktion. Diese Funktion ermöglicht primäre Zilien, spezifische Liganden für Kerbe, Hormone und biologisch aktive Substanzen wie Serotonin oder Somatostatin zu erkennen. Andere spezifische Funktionen, die von primären Zilien unterschiedlicher Länge gezeigt werden, sind die Reaktion auf Temperatur-, Schwerkraft- und Osmolalitätsänderungen14.
Primäre Zilien können durch verschiedene Methoden visualisiert werden, wie Live-Visualisierung, Transmissionselektronenmikroskopie, 3D-Bildgebung, oder durch Software für die automatische Detektion von primären Zilien5,15,16,17. Diese Methoden sind jedoch hochspezialisierte und laufende Forschung braucht grundlegende, schnelle und einfache Methoden für die Färbung primäre Zilien in jeder Phase der Forschung. Beschrieben ist eine einfache und nützliche Methode zum Nachweis von primären Zilien in kultivierten Zellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1301px;" width="1301">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">6-well plate</td>
			<td style="width:217px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92406</td>
			<td style="width:581px;">Dimensions 128x86x22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">111-546-047</td>
			<td>AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Goat Anti-Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Anti-Tubulin &#947;</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T5192</td>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">C2C12</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1772</td>
			<td>Myoblast (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Cy3</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2181</td>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab&#8242;)2 fragment&#8211;Cy3 antibody produced in sheep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dapi (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s medium</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td>High glucose, No glutamine, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:384px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td>With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">MEF</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">SCRC-1039</td>
			<td>Mouse embryonic fibroblast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7451</td>
			<td>Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">NHLF</td>
			<td style="width:217px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2512</td>
			<td>Primary lung fibroblasts (human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127-500G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:384px;">Skin fibroblasts</td>
			<td style="width:217px;">Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Kr&#225;lov&#233;.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Square Cover Slips</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22X22-1.5</td>
			<td>Borosilicate glass, 22x22mm, Square</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple detection of primary cilia by immunofluorescence

Primäre Zilien werden während des Zellzyklusfortschritts dynamisch reguliert, insbesondere während der G0/G1-Phasen des Zellzyklus, die vor der Mitose resoorbiert werden. Primäre Zilien können mit hochentwickelten Methoden visualisiert werden, einschließlich Transmissionselektronenmikroskopie, 3D-Bildgebung oder mit Software zur automatischen Detektion von Primärzilien. Jedoch, immunfluoreszierende Färbung der primären Zilien ist erforderlich, um diese Methoden durchzuführen. Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur einfachen Detektion von primären Zilien in vitro durch Färbung von acetyliertem Alpha-Tubulin (Axonem) und Gamma-Tubulin (Basalkörper). Dieses immunfluoreszierende Färbeprotokoll ist relativ einfach und führt zu qualitativ hochwertigen Bildern. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie vier Zelllinien (C2C12, MEF, NHLF und Hautfibroblasten), die primäre Zilien exdrücken, mit einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop fixiert, immungefärbt und abgebildet wurden.

Die immunfluoreszierende Färbung der primären Zilien ist ein relativ einfaches Verfahren, das zu qualitativ hochwertigen Bildern führt. In diesen Experimenten wurden Fibroblasten, die primäre Zilien exdrücken, fixiert, immungefärbt und in einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop nach dem oben beschriebenen Protokoll abgebildet. Das primäre Cilium wurde mit Acetylat-Tubulin und -Tubulin nachgewiesen. Die Bewertung der primären Zilien kann auf verschiedenen Ebenen durchgeführt werden und jede Änderung in ...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primäre Zilien sind extrazelluläre Strukturen, die mit dem Centriole verbunden sind. Der primäre Ziliennachweis durch immunfluoreszierende Färbung ist ein relativ einfaches Verfahren, das zu extrem hochwertigen Bildern führt. In diesem Protokoll wurden Fibroblasten, die primäre Zilien exdrücken, fixiert, immungefärbt und in einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop abgebildet.

Einfacher Nachweis der primären Cilia durch Immunfluoreszenz

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und einfache Erkennung von primären Zilien in kultivierten Zellen, innerhalb einer Vielzahl von Forschungsbemühungen. Die Methode könnte bei Unordnung verwendet werden, die die Basalkörper der primären Zilien beeinflussen. Dieses Verfahren kann auch zur Färbung der primären Zililia im paraffineingebetteten Gewebe oder für andere Experimente angewendet werden, bei denen Fluoreszenz erforderlich ist.Beginnen Sie mit dem Autoklavieren von 22 mal 22 Millimetern Deckschscheinen und der Vorbereitung von Materialien für das Experiment. FBS und Penicillin Streptomycin auftauen und das Kulturmedium auf Raumtemperatur erwärmen. Durchfahrt der Zellen mit Trypsin EDTA und PBS.Bereiten Sie frische 4%Paraformaldehyd, Kulturmedium und 1%Gelatinelösung nach Manuskriptrichtungen vor. Reinigen Sie dann die laminare Durchflusshaube mit 70% Ethanol und platzieren Sie alle benötigten Materialien darin. Paraformaldehyd ist extrem gefährlich.Richtige PSA muss zu jeder Zeit getragen werden, und es sollte nur in einer chemischen Haube behandelt werden. Nach dem Wachstum der gewünschten Zellen auf 70%Konfluss entfernen Sie sie aus dem Inkubator und legen Sie sie in die laminare Strömungshaube. Entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS.Fügen Sie etwa zwei Milliliter 0,25% Trypsin EDTA in den Kulturkolben und inkubieren Sie ihn bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Überprüfen Sie die Zellen regelmäßig auf dem invertierten Mikroskop, um die Ablösung zu überwachen. Wenn die Zellen sich gelöst haben, halten Sie sie vorsichtig in 10 Milliliter Kulturmedium ab, und pipetieren Sorgfältig, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen.Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 Milliliter konisches Rohr und zentrieren Sie sie bei 200 mal G'für fünf Minuten. Dekantieren Sie den Überstand dann fügen Sie 10 Milliliter Kulturmedium, und sanft das Pellet wieder aufhängen. Nehmen Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension und mischen Sie sie mit Trypan blau im Verhältnis zu einem Volumen.Zählen Sie dann die Zellen mit der Standardhäozytometrie. Legen Sie einen Deckelschlupf in jeden Brunnen einer sechs Brunnenplatte, und beschichten Sie den Deckelschlupf mit zwei Milliliter der Gelatinelösung, die den Zellen, die an der Abdeckung befestigt sind, helfen, zu rutschen. Entfernen Sie die Gelatine und lassen Sie die Platte für ein paar Minuten lufttrocknen.Samen 100. 000 Fibroblasten in jedem Brunnen und fügen Sie zwei Milliliter Kulturmedium. Dann inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid und 90% relative Luftfeuchtigkeit. Nach der Inkubation behandeln Sie die Zellen, um Dieziation zu induzieren.Erwärmen Sie das 4%paraformaleDehyd auf Raumtemperatur und bereiten Sie eine Weidepipetten, ABS, einen Abfallbehälter, 15 Milliliter konische Rohre, Mikropipetten und Spitzen vor. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und legen Sie sie auf die Laborbank. Entfernen Sie die Medien von jedem Brunnen, so dass der Deckel schlupf.Waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern PBS dreimal. Fügen Sie dann zwei Milliliter der 4%PFA in jeden Brunnen hinzu, um die Zellen zu fixieren. Inkubieren Sie die Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie dann die PFA, und wiederholen Sie die Waschungen mit PBS.Fügen Sie zwei Milliliter 0,5%Triton X-100 zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Platte für 15 Minuten. Dann waschen Sie die Brunnen viermal mit PBS. Um die Blockierlösung zu machen, tauen Sie ein Ziegenserum für fünf Minuten auf und verdünnen Sie es in PBS im Verhältnis eins bis 20.Fügen Sie 150 Mikroliter dieser Lösung zu jedem Deckschlupf hinzu und inkubieren Sie die Platte für 20 Minuten. Die primären Antikörper fünf Minuten lang auftauen und separat in PBS verdünnen, wie im Textmanuskript beschrieben. Entfernen Sie die Blockierlösung aus den Abdeckzetteln und fügen Sie 150 Mikroliter beider Antikörperlösungen hinzu.Dann inkubieren Sie die Platte für 60 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die primären Antikörper und waschen Sie die Abdeckungsrutschen mit zwei MilliliterPBS dreimal. Verdünnen Sie Cy3 Sheep Anti-Mouse und Alexa fluor 488 Goat Anti-Rabbit in PBS, im Verhältnis eins bis 300, und fügen Sie 150 Mikroliter der beiden sekundären Antikörperlösungen in den Deckelschlupf.Bereiten Sie eine funktionierende DAPI-Lösung vor, indem Sie 10 Mikroliter des Lagerbestands in 50 Milliliter PBS verdünnen und zwei Milliliter dieser Verdünnung zu den Abdeckzetteln hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte für fünf Minuten im Dunkeln, bei Raumtemperatur. Bevor Sie die Deckelscheine auf die Folien legen, bereiten Sie zwei Nadeln, eine Pinzette und Einbaumedien vor, und beschriften Sie alle Folien.Entfernen Sie die DAPI-Lösung aus den Brunnen, und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Legen Sie einen Tropfen Montagemedien auf jede Folie. Verwenden Sie die Nadel, um den Deckelrutsch vorsichtig vom Boden des Brunnens zu heben.Dann kippen Sie es und legen Sie es vorsichtig über den Tropfen der Montagemedien mit der Pinzette. Entfernen Sie vorsichtig alle Blasen. Schützen Sie die Dias vor Licht und lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag verwenden Sie ein fluoreszierendes oder konfokales Mikroskop mit hoher Vergrößerung, um die primäre Zilien zu visualisieren. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Immunostain zu fixieren und verschiedene Zelllinien abzubilden, die primäre Zilien exdrücken. Wenn Maus-Myoblasten ionisierender Strahlung in verschiedenen Dosen ausgesetzt waren, wurde festgestellt, dass höhere Dosen das Auftreten mehrerer primärer Zilien induzieren.Während niedrige Dosen führten zum Auftreten von einzelnen primären Zilien. In ähnlicher Weise wurden bei der Abstrahlung menschlicher Lungenfibroblasten in niedriger Dosis einzelne primäre Zilien durch Immunfluoreszenz nachgewiesen. Eine Zunahme der primären Zilien wurde bei mausembryonalen Fibroblasten beobachtet, die verhungert waren, was zeigt, dass metabolischer Stress die Vorfälle der primären Zilien beeinflusst.Wenn Hautfibroblasten mit 120 nanomolaren Doxorubicin behandelt wurden, drückten sie ein einziges primäres Cilium aus. Höhere Dosen induzieren das Auftreten von mehreren primären Zilien. Fibroblasten, die mit 1,25 Nanomolar Taxol behandelt wurden, exprimierten auch ein einziges primäres Cilium.Aber mehrere Zilien wurden nach der Behandlung mit höheren Dosen nicht nachgewiesen. Achten Sie beim Öffnen dieses Protokolls darauf, dass sie alle PSA-Vorschriften befolgen. Denken Sie an die Kulturbedürfnisse Ihrer Zelllinie Ihrer Wahl und wählen Sie Ihre Antikörper sorgfältig aus.Diesem Verfahren können nicht direkt andere Verfahren folgen, da die Zellen unwiederbringlich sind. Stattdessen sollten parallele Experimente programmiert werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Immunfluoreszenz-Nachweis von zwei Thymidinanaloga (CldU und IDU) in primärem Gewebe

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Forschung

Biologie

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Erkennung von Functional Matrix-Metalloproteinasen durch Zymographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen von Whole-mount Immunfluoreszenz an aktivierte Caspase 3 Detect

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...