Name: simple detection of primary cilia by immunofluorescence
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Difesa della Repubblica Ceca - Piano di sviluppo dell'organizzazione a lungo termine Aspetti medici delle armi di distruzione di massa della Facoltà di Scienze della salute militare, Università della Difesa; il Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport, repubblica Ceca (Progetto di Ricerca Specifico n. Grazie anche a Daniel Diaz per la sua gentile assistenza nella revisione in lingua inglese.

1. Preparazione di mezzi di coltura, soluzioni e piatti
<ol><li>Autoclave le copertine (22 x 22 mm). Preparare 6 piastre di pozzo. Scongelare il siero bovino fetale (FBS) e la penicillina/streptomicina antibiotica e riscaldare la temperatura ambiente media e ambiente di coltura (RT). Utilizzare trypsin-EDTA (0,25%) e 1x PBS (fosfato tamponato salino con calcio e magnesio) per passare le cellule.</li>
	<li>Preparare la paraformaldeide fresca del 4% (PFA) in dH2O (800 mg di PFA in 20 mL di dH2O). Il...

<ol>
	<li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+primary+cilia:+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells,+but+a+"sleeping+beauty"+in+cultured+cells.">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li><li>Sloboda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primary cilia. , (2009).</li><li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control.">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts.">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation.">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li><li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length.">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li><li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys.">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).</li><li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism.">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li><li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neurons+show+a+primary+cilium.">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li><li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium.">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption,+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors.">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li><li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase,+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1.">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li><li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cilium:+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit.">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li><li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autophagy-Cilia+Axis:+An+Intricate+Relationship.">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905 (2019).</li><li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+primary+cilia+dynamics+using+fluorescence+microscopy.">Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2012).</li><li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia.">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li><li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+(ACDC).">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1 (2019).</li><li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis.">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+novel+machineries+required+for+both+ciliogenesis+and+cell+cycle+arrest+upon+serum+starvation.">Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).</li><li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer:+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues.">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li><li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li><li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding.">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).</li><li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling.">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5 (2017).</li><li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models.">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11 (2015).</li><li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy.">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li></ol>

Diversi autori hanno descritto diversi metodi per il rilevamento delle ciglia primarie, a volte anche descrivendo vari metodi di fissazione che possono influenzare il lororilevamento 6,20,21,22. Indipendentemente da ciò, è difficile trovare un protocollo completo e diretto per il rilevamento. La disponibilità di tale metodo sarebbe indubbiamente di grande aiuto per lo studio dell'indagine pr...

Le ciglia primarie sono strutture sensoriali, solitarie, legate alla membrana e nonmotile associate alla centriola madre della cellula. Le ciglia primarie si trovano sulla maggior parte delle cellule vertebrate, ad eccezione dei globuli rossi, degli adidociti1e degli epariti2. Le ciglia primarie sono formate come un asceone allungato composto da microtubuli, il cui componente principale è la tubulina. L'ascia cresce dal corpo basale, strutturato γ-tubulina. La lunghezza delle ciglia primarie varia tra 2 e 10 m; tuttavia, le sue dimensioni possono cambiare durante la glicilazione, la fame, l'ipossia, lo stress citotossico o dopo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti3,4,5,6,7. Di solito, le cellule hanno un solo cilio primario, che è coinvolto nella morfogenesi e nei percorsi di segnalazione cellulare importanti per la proliferazione cellulare e la differenziazione8,9.
Le ciglia primarie sono regolate dinamicamente durante la progressione del ciclo cellulare, in particolare durante le fasi G0/G1, e riassorbite prima di entrare nella mitosi in un processo associato alla deacetilazione della tubulina mediata da HDAC6 (deacetilase istone 6)10. Il momento esatto della riassorbimento delle ciglia primarie dipende dal tipo di cellula e dall'espressione dei geni direttamente coinvolti in questo processo, come Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. A seconda del tipo di cellula, le ciglia primarie esprimono diversi tipi di recettori, canali ioni e percorsi di segnalazione attivi. Questi includono i più importanti recettori di segnalazione che influenzano la proliferazione e la sopravvivenza, EGFR, PDGFR, e FGFR. Sono inclusi anche alcuni dei percorsi di segnalazione che possono influenzare la funzione di uno o più organi, tra cui Riccio, Notch, e Wnt. Grazie a questi recettori e vie di segnalazione, le ciglia primarie svolgono anche una funzione chemiosensoriale. Questa funzione consente alle ciglia primarie di rilevare ligand specifici per Notch, ormoni, e sostanze biologicamente attive come serotonina o somatostatina. Altre funzioni specifiche esposte da ciglia primarie di diverse lunghezze includono la reazione ai cambiamenti di temperatura, gravità e osmolalità14.
Le ciglia primarie possono essere visualizzate attraverso vari metodi, come la visualizzazione dal vivo, la microscopia elettronica a trasmissione, l'imaging 3D o il software per il rilevamento automatico delle cigliaprimarie 5,15,16,17. Tuttavia, questi metodi sono altamente specializzati e la ricerca in corso ha bisogno di metodi di base, veloci e facili per colorare le ciglia primarie in ogni fase della ricerca. Descritto è un metodo facile e utile per il rilevamento delle ciglia primarie nelle cellule culture.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1301px;" width="1301">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">6-well plate</td>
			<td style="width:217px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92406</td>
			<td style="width:581px;">Dimensions 128x86x22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">111-546-047</td>
			<td>AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Goat Anti-Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Anti-Tubulin &#947;</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T5192</td>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">C2C12</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1772</td>
			<td>Myoblast (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Cy3</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2181</td>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab&#8242;)2 fragment&#8211;Cy3 antibody produced in sheep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dapi (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s medium</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td>High glucose, No glutamine, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:384px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td>With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">MEF</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">SCRC-1039</td>
			<td>Mouse embryonic fibroblast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7451</td>
			<td>Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">NHLF</td>
			<td style="width:217px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2512</td>
			<td>Primary lung fibroblasts (human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127-500G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:384px;">Skin fibroblasts</td>
			<td style="width:217px;">Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Kr&#225;lov&#233;.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Square Cover Slips</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22X22-1.5</td>
			<td>Borosilicate glass, 22x22mm, Square</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple detection of primary cilia by immunofluorescence

Le ciglia primarie sono regolate dinamicamente durante la progressione del ciclo cellulare, in particolare durante le fasi G0/G1 del ciclo cellulare, che vengono riassorbite prima della mitosi. Le ciglia primarie possono essere visualizzate con metodi altamente sofisticati, tra cui la microscopia elettronica a trasmissione, l'imaging 3D o l'utilizzo di un software per il rilevamento automatico delle ciglia primarie. Tuttavia, per eseguire questi metodi è necessaria una colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie. Questa pubblicazione descrive un protocollo per la facile rilevazione delle ciglia primarie in vitro colorando la tubulina alfa acetilatata (axoneme) e la tubulina gamma (corpo basale). Questo protocollo di colorazione immunofluorescente è relativamente semplice e si traduce in immagini di alta qualità. Il presente protocollo descrive come quattro linee cellulari (C2C12, MEF, NHLF e fibroblasti cutanei) che esprimono ciglia primarie sono state fissate, immunizzate e immagini con un microscopio fluorescente o confocale.

La colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di alta qualità. In questi esperimenti, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie erano fissati, immunosorizzati e ritrattati in un microscopio fluorescente o confocale seguendo il protocollo sopra descritto. Il cilium primario è stato rilevato utilizzando l'acetilata tubulina e γ-tubulina. La valutazione delle ciglia primarie può essere eseguita su vari livelli e qualsiasi cambiamento in que...

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Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Le ciglia primarie sono strutture extracellulari associate al centriole. Il rilevamento delle ciglia primarie mediante colorazione immunofluorescente è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di altissima qualità. In questo protocollo, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie sono stati fissati, immunizzati e immagini in un microscopio fluorescente o confocale.

Semplice rilevamento delle ciglia primarie per immunofluorescenza

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Questo protocollo consente un rilevamento rapido e semplice delle ciglia primarie nelle cellule coltivate, all'interno di una varietà di sforzi di ricerca. Il metodo potrebbe essere utilizzato in disordine che colpisce i corpi basali delle ciglia primarie. Questa procedura può essere applicata anche per la colorazione delle ciglia primarie nel tessuto incorporato di paraffina o per altri esperimenti in cui è necessaria la fluorescenza.Inizia con l'autoclave di 22 per 22 millimetri scivola e prepara i materiali per l'esperimento. Scongelare FBS e streptomicina penicillina e riscaldare la coltura a temperatura media-ambiente. Passare le cellule con tripside EDTA e PBS.Preparare la paraformaldeide fresca al 4%, il terreno di coltura e la soluzione di gelatina all'1%, secondo le indicazioni del manoscritto. Quindi pulire la cappa di flusso laminare con il 70% di etanolo e posizionare tutti i materiali necessari all'interno. La paraformaldeide è estremamente pericolosa.I DPI adeguati devono essere indossati in ogni momento e dovrebbero essere maneggiati solo in una cappa chimica. Dopo aver fatto crescere le cellule desiderate al 70% di confluenza, rimuoverle dall'incubatrice e posizionarle nella cappa di flusso laminare. Rimuovere il mezzo di coltura e sciacquare le cellule due volte con PBS.Aggiungere circa due millilitri dello 0,25% di tripside EDTA al pallone da coltura e incubarlo a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Controllare periodicamente le cellule sul microscopio invertito per monitorare il distacco. Quando le cellule si sono staccate delicatamente riutilizzandole in 10 millilitri di mezzo di coltura, pipettando attentamente per creare una singola sospensione cellulare.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugarla a 200 volte G'per cinque minuti. Decantare il supernatante quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo di coltura e rimescolare delicatamente il pellet. Prendi 20 microlitri della sospensione cellulare e mescolala con il blu tripano con un rapporto volume uno a uno.Quindi contare le cellule usando l'emocitometria standard. Posizionare un coperchio scivolare all'interno di ogni pozzo di una piastra di sei pozza e rivestire il coperchio scivolare con due millilitri della soluzione di gelatina, che aiuterà le cellule attaccate al coperchio a scivolare. Rimuovere la gelatina e lasciare asciugare la piastra all'aria per alcuni minuti.Seme 100.000 fibroblasti in ogni pozzo e aggiungere due millilitri di mezzo di coltura. Quindi incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius, anidride carbonica al 5% e umidità relativa del 90%. Dopo l'incubazione trattare le cellule per indurre la ciliazione.Riscaldare la paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente e preparare pipette da pascolo, ABS, un contenitore di rifiuti, tubi conici da 15 milliliter, micro pipette e punte. Prendi le cellule dall'incubatrice e mettile sul banco del laboratorio. Rimuovere i supporti da ogni pozzo, lasciando il coperchio scivolare.Lavare delicatamente le cellule tre volte con due millilitri di PBS. Quindi aggiungere due millilitri del 4%PFA in ogni pozzo per fissare le celle. Incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere il PFA e ripetere i lavaggi con PBS.Aggiungere due millilitri dello 0,5%Triton X-100 ad ogni pozzo e incubare la piastra per 15 minuti. Quindi lavare i pozzi quattro volte con PBS. Per creare la soluzione di blocco, scongelare un siero di capra per cinque minuti e diluirlo in PBS con un rapporto uno a 20.Aggiungere 150 microlitri di questa soluzione a ogni slittamento del coperchio e incubare la piastra per 20 minuti. Scongelare gli anticorpi primari per cinque minuti e diluirli separatamente in PBS, come descritto nel manoscritto testuale. Rimuovere la soluzione di blocco dagli scivolamenti del coperchio e aggiungere 150 microlitri di entrambe le soluzioni anticorpali.Quindi incubare la piastra per 60 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere gli anticorpi primari e lavare delicatamente il coperchio scivola tre volte con due millilitri di PBS. Diluire Cy3 Sheep Anti-Mouse e Alexa fluor 488 Goat anti-Rabbit in PBS, con un rapporto da uno a 300, e aggiungere 150 microlitri di entrambe le soluzioni anticorpali secondarie allo scivolo di copertura.Preparare una soluzione DAPI funzionante diluendo 10 microlitri del materiale in 50 millilitri di PBS e aggiungere due millilitri di questa diluizione ai coperchi. Incubare il piatto per cinque minuti al buio, a temperatura ambiente. Prima di posizionare il coperchio scivola sulle diapositive, preparare due aghi, pinzette e supporti di montaggio ed etichettare tutte le diapositive.Rimuovere la soluzione DAPI dai pozzi e lavarli tre volte con PBS. Mettere una goccia di supporti di montaggio su ogni diapositiva. Utilizzare l'ago per sollevare delicatamente lo scivolamento del coperchio dal fondo del pozzo.Quindi capovolgerlo e posizionarlo delicatamente sopra la goccia di supporti di montaggio utilizzando le pinzette. Rimuovere con cura eventuali bolle. Proteggere le diapositive dalla luce e conservarle durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo utilizzare un microscopio fluorescente o confocale con un alto ingrandimento per visualizzare le ciglia primarie. Questo protocollo è stato utilizzato per correggere l'immunosostenibile e l'immagine di varie linee cellulari che esprimono ciglia primarie. Quando i mioblasti di topo sono stati esposti a radiazioni ionizzanti a varie dosi, si è scoperto che dosi più elevate inducono la comparsa di più ciglia primarie.Mentre basse dosi hanno portato alla comparsa di singole ciglia primarie. Allo stesso modo, quando i fibroblasti polmonari umani sono stati irradiati a bassa dose, singole ciglia primarie sono state rilevate dall'immunofluorescenza. Un aumento della ciglia primaria è stato osservato nei fibroblasti embrionali di topo che sono stati affamati, dimostrando che lo stress metabolico influisce sugli incidenti delle ciglia primarie.Quando i fibroblasti cutanei sono stati trattati con 120 doxorubicina nanomolare, hanno espresso un singolo cilio primario. Dosi più elevate inducono la comparsa di ciglia primarie multiple. I fibroblasti trattati con 1,25 taxolo nanomolare hanno anche espresso un singolo cilio primario.Ma ciglia multiple non sono state rilevate dopo il trattamento con dosi più elevate. Quando si apre questo protocollo assicurarsi di seguire tutte le normative DPI. Tieni presente le esigenze di coltura della tua linea cellulare preferita e scegli attentamente i tuoi anticorpi.Questa procedura non può essere seguita direttamente da altre procedure, poiché le celle sono irrecuperabili. Al contrario, gli esperimenti paralleli dovrebbero essere programmati.

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