Name: simple detection of primary cilia by immunofluorescence
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

この作業は、チェコ共和国の防衛省によって支援されました - 長期組織開発計画軍事保健科学部の大量破壊兵器の医療側面、防衛大学;チェコ共和国教育・青年スポーツ省(特定研究プロジェクト第一:SV/FVZ201703)とPROGRES Q40/06また、英語の改訂で彼の親切な支援のためのダニエル・ディアスに感謝します。

1. 文化メディア、ソリューション、料理の準備
<ol><li>カバーリップをオートクレーブ(22 x 22 mm)にします。6つのウェルプレートを準備します。ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質ペニシリン/ストレプトマイシンを解凍し、培養培地を室温(RT)まで温める。トリプシン-EDTAを使用する (0.25%)1x PBS(リン酸緩衝食塩分カルシウムとマグネシウム)を細胞を通過させる。</li>
	<li>新鮮な4%パラホルムアルデ?...

<ol>
	<li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+primary+cilia:+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells,+but+a+"sleeping+beauty"+in+cultured+cells.">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li><li>Sloboda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primary cilia. , (2009).</li><li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control.">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts.">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation.">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li><li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length.">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li><li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys.">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).</li><li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism.">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li><li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neurons+show+a+primary+cilium.">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li><li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium.">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption,+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors.">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li><li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase,+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1.">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li><li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cilium:+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit.">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li><li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autophagy-Cilia+Axis:+An+Intricate+Relationship.">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905 (2019).</li><li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+primary+cilia+dynamics+using+fluorescence+microscopy.">Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2012).</li><li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia.">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li><li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+(ACDC).">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1 (2019).</li><li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis.">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+novel+machineries+required+for+both+ciliogenesis+and+cell+cycle+arrest+upon+serum+starvation.">Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).</li><li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer:+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues.">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li><li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li><li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding.">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).</li><li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling.">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5 (2017).</li><li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models.">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11 (2015).</li><li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy.">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li></ol>

いくつかの,著者は、プライマリ繊毛の検出のための多様な方法を説明し、時には検出6、20、21、2220,に影響を与えることができる様々な固定方法も記述している。62122いずれにせよ、検出のための完全でわかりやすいプロトコルを見つけることは困難です。このような方法の準備ができたのは、特...

原性繊毛は、細胞の母中心に関連する感覚的、孤独な、膜結合性、非モタイル構造である。原発性繊毛は、赤血球、血液胞子1、および肝細胞2を除くほとんどの脊椎動物細胞に見られる。原繊毛は、細管によって構成される細長い軸索として形成され、その主成分はαチューブリンである。アキソンムは、γチューブリンから構成される基底体から成長する。プライマリ繊毛の長さは2~10μmの間で変化する。しかし、その寸法は、グリチル化、飢餓、低酸素、細胞毒性ストレス、または電離放射線33、4、5、6、74,5,6,7への暴露後に変化する可能性があります。通常、細胞は一次シリウムを1つしか持っていないが、これは形態形成および細胞シグナル伝達経路に関与し、細胞増殖および分化に重要な8,99である。
一次繊毛は、細胞周期進行中、特にG0/G1相中に動的に調節され、HDAC6(ヒストンデアセチルラーゼ6)10によって媒介される管内脱アセチル化に関連する過程で有糸分裂に入る前10にリソードされる。一次繊毛吸収の正確な瞬間は,、オーロラA、Plk1、TcTex-1 11、12、1311,など、このプロセスに直接関与する細胞の種類と遺伝子の発現に依存する。1213細胞の種類に応じて、プライマリ繊毛は異なるタイプの受容体、イオンチャネル、および活性シグナル伝達経路を発現する。これらには、増殖および生存に影響を及ぼす最も重要なシグナル伝達受容体、EGFR、PDGFR、およびFGFRが含まれる。また、ヘッジホッグ、ノッチ、Wntを含む1つ以上の器官の機能に影響を与える可能性のあるシグナル伝達経路のいくつかも含まれています。この機能により、原発性繊毛は、ノッチ、ホルモン、セロトニンまたはソマトスタチンなどの生物学的に活性な物質に対する特異的なリガンドを検出することができます。異なる長さの一次繊毛によって示される他の特定の機能は、温度、重力、および浸透病性14の変化に対する反応を含む。
一次繊毛は、ライブビジュアライゼーション、透過電子顕微鏡、3Dイメージング、または一,次繊毛5、15、16、1715の5自動検出のためのソフトウェアなど、さまざまな方法を通じて可視化することができる。,1617しかし、これらの方法は高度に専門化されており、研究のあらゆる段階で原型繊毛を染色するための基本的で迅速で簡単な方法が必要です。記載は、培養細胞における一次繊毛の検出に対する簡易で有用な方法である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1301px;" width="1301">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">6-well plate</td>
			<td style="width:217px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92406</td>
			<td style="width:581px;">Dimensions 128x86x22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">111-546-047</td>
			<td>AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Goat Anti-Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Anti-Tubulin &#947;</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T5192</td>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">C2C12</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1772</td>
			<td>Myoblast (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Cy3</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2181</td>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab&#8242;)2 fragment&#8211;Cy3 antibody produced in sheep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dapi (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s medium</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td>High glucose, No glutamine, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:384px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td>With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">MEF</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">SCRC-1039</td>
			<td>Mouse embryonic fibroblast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7451</td>
			<td>Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">NHLF</td>
			<td style="width:217px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2512</td>
			<td>Primary lung fibroblasts (human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127-500G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:384px;">Skin fibroblasts</td>
			<td style="width:217px;">Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Kr&#225;lov&#233;.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Square Cover Slips</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22X22-1.5</td>
			<td>Borosilicate glass, 22x22mm, Square</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple detection of primary cilia by immunofluorescence

一次繊毛は、細胞周期進行中、特に細胞周期のG0/G1段階の間に動的に調節され、有糸分裂の前に再調節される。一次繊毛は、透過型電子顕微鏡、3Dイメージング、または一次繊毛の自動検出のためのソフトウェアを使用するなど、高度に洗練された方法で視覚化することができます。しかしながら、これらの方法を行うためには、一次繊毛の免疫蛍光染色が必要である。本書では、アセチル化アルファチューブリン(axoneme)とガンマ管(基底体)を染色することにより、インビトロで一次繊毛を容易に検出するためのプロトコルについて説明する。この免疫蛍光染色プロトコルは比較的単純であり、高品質の画像をもたらします。本プロトコルは、原性繊毛を発現する4つの細胞株(C2C12、MEF、NHLF、および皮膚線維芽細胞)を、どのように固定し、免疫染色し、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化した方法を記述する。

原繊毛の免疫蛍光染色は、高品質の画像をもたらす比較的簡単な手順です。これらの実験では、原発繊毛を発現する線維芽細胞を固定し、免疫染色し、上記のプロトコルに従って蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化した。一次シリウムはアセチル化αチューブリンおよびγチューブリンを用いて検出した。原繊毛の評価は、種々のレベルで行うことができるし、この点に関する任意の変化...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

一次繊毛は、中心に関連する細胞外構造である。免疫蛍光染色による一次繊毛検出は、非常に高品質な画像をもたらす比較的簡単な手順です。このプロトコルでは、原発繊毛を発現する線維芽細胞を固定し、免疫染色し、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化した。

免疫蛍光による原発性繊毛の簡易検出

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

このプロトコルは、様々な研究努力の中で、培養細胞内の原発繊の迅速かつ容易な検出を可能にする。この方法は、原発繊毛の基底体に影響を与える障害で利用することができる。この手順は、パラフィン埋め込み組織での原発繊毛の染色や、蛍光が必要な他の実験にも適用できます。22 x 22ミリメートルのカバースリップをオートクレーブし、実験用の材料を準備します。FBSおよびペニシリンストレプトマイシンを解凍し、培養培地を室温に温める。トリプシンEDTAおよびPBSで細胞を通過させる。原稿の指示に従って、新鮮な4%パラホルムアルデヒド、培養培地、および1%ゼラチン溶液を調製する。その後、70%エタノールで層流フードを洗浄し、すべての必要な材料を内部に入れます。パラホルムアルデヒドは非常に危険です。適切なPPEは常に着用する必要があり、それは化学フードでのみ処理する必要があります。所望の細胞を70%合流に成長した後、インキュベーターからそれらを取り除き、層流フードに入れます。培養液を取り出し、PBSで細胞を2回リンスします。培養フラスコに0.25%トリプシンEDTAの約2ミリリットルを加え、摂氏37度で5分間インキュベートします。反転顕微鏡で細胞を定期的にチェックして、剥離を監視します。細胞が10ミリリットルの培養培地で穏やかに再懸濁した場合、慎重にピペット処理して単一の細胞懸濁液を作り出す。細胞懸濁液を50ミリリットル円錐形チューブに移し、200倍G'5分間遠心分離します。上清をデカントし、10ミリリットルの培養培地を加え、ペレットを軽く再懸濁します。細胞懸濁液を20マイクロリットル取り、1対1の体積比でトリパンブルーと混ぜます。次に、標準的なヘモサイトメトリーを使用して細胞を数えます。6つのウェルプレートの各ウェルの中にカバースリップを置き、カバースリップに2ミリリットルのゼラチン溶液をコーティングします。ゼラチンを取り出し、プレートを数分間空気乾燥させます。種子100,000の線維芽細胞を各ウェルに入れ、2ミリリットルの培養培地を添加する。その後、セルを摂氏37度、二酸化炭素5%、相対湿度90%で24時間インキュベートします。培養後、毛様体化を誘導するために細胞を治療する。4%パラホルムアルデヒドを室温まで温め、牧草地のピペット、ABS、廃容器、15ミリリットルの円錐管、マイクロピペット、および先端を準備します。インキュベーターから細胞を取り出し、ラボベンチに置きます。カバースリップを残して、各井戸からメディアを取り外します。2ミリリットルのPBSで細胞を3回軽く洗います。その後、細胞を固定するために各ウェルに4%PFAの2ミリリットルを追加します。プレートを室温で10分間インキュベートし、PFAを取り出し、PBSで洗い洗いを繰り返します。各ウェルに0.5%トリトンX-100の2ミリリットルを加え、プレートを15分間インキュベートします。その後、PBSで井戸を4回洗います。ブロッキング溶液を作るために、ヤギの血清を5分間解凍し、PBSで1〜20の比率で希釈します。各カバースリップにこの溶液の150マイクロリットルを加え、20分間プレートをインキュベートします。一次抗体を5分間解凍し、テキスト原稿に記載されているようにPBSで別々に希釈する。カバースリップからブロッキング溶液を取り除き、両方の抗体溶液の150マイクロリットルを加えます。その後、プレートを室温で60分間インキュベートします。一次抗体を取り除き、カバースリップを2ミリリットルのPBSで3回軽く洗います。希釈Cy3羊抗マウスとアレクサフルーター488ヤギ抗ウサギをPBSで1〜300の比率で、カバースリップに両方の二次抗体溶液の150マイクロリットルを追加します。50ミリリットルのPBSで10マイクロリットルのストックを希釈して作業DAPI溶液を調製し、この希釈液をカバースリップに2ミリリットル加えます。室温で、暗闇の中で5分間プレートをインキュベートします。スライドにカバースリップを配置する前に、2本の針、ピンセット、取り付けメディアを準備し、すべてのスライドにラベルを付けます。ウェルからDAPI溶液を取り出し、PBSで3回洗浄します。各スライドに取り付けメディアを1滴置きます。針を使って、カバースリップをウェルの底からそっと持ち上げます。その後、それを反転し、ピンセットを使用して取り付けメディアのドロップの上にそっと置きます。気泡を慎重に取り除きます。スライドを光から保護し、摂氏4度で一晩保管してください。翌日には蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、高倍率で一次繊毛を可視化します。このプロトコルは、免疫染色体を固定するために使用され、一次繊毛を発現する様々な細胞株を画像化した。マウス筋芽細胞が様々な線量で電離放射線にさらされたとき、高用量が複数の一次繊毛の出現を誘発することを発見した。低用量では、単一の一次繊毛の出現をもたらした.同様に、ヒト肺線維芽細胞を低用量で放射した場合、単一の原発繊毛は免疫蛍光によって検出された。飢えたマウス胚性線維芽細胞では原発繊の増加が観察され、代謝ストレスが原発性繊毛の事件に影響を及ぼすことが示された。皮膚線維芽細胞を120ナノモルドキソルビシンで処理したところ、単一の一次シリウムを発現した。高用量は、複数の一次繊毛の出現を誘発する。1.25ナノモルタキソールで処理された線維芽細胞も単一の一次シリウムを発現した。しかし、高用量で治療した後、複数の繊毛は検出されなかった。このプロトコルを開く際は、すべてのPPE規制に従ってください。選択した細胞ラインの培養ニーズを念頭に置き、抗体を慎重に選択してください。細胞は取り返しのつかないため、この手順を他の手順で直接実行することはできません。代わりに、並列実験をプログラムする必要があります。

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

一次組織の二つのチミジン類似体の免疫蛍光検出（CldUとIDU）

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

ザイモグラフィーによる機能マトリックスメタロプロテイナーゼの検出

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

クッパー胞における遺伝子機能と繊毛発生する流体の流れの可視化の分析

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

糞便グルココルチコイド分析：ウマにおける非侵襲性副腎モニタリング

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡により、リガンド活性化Gタンパク質共役型受容体内在化の検出

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...