Name: simple detection of primary cilia by immunofluorescence
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00
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이 작품은 체코 국방부에 의해 지원되었다 - 장기 조직 개발 계획 군사 보건 과학 학부의 대량 살상 무기의 의료 측면, 국방부; 교육부, 청소년 및 스포츠, 체코 (특정 연구 프로젝트 번호: SV / FVZ201703) 및 PROGRES Q40/06. 또한 다니엘 디아즈에게 영어 개정에 대한 그의 친절한 도움에 감사드립니다.

1. 문화 매체, 솔루션 및 요리 준비
<ol><li>커버립(22 x 22mm)을 자동 클래브합니다. 6 개의 잘 접시를 준비하십시오. 태아 소 혈청 (FBS) 및 항생제 페니실린 / 연쇄 절제술을 하고 문체 배지를 실온 (RT)으로 따뜻하게합니다. 트립신-EDTA 사용 (0.25%) 및 1x PBS (칼슘과 마그네슘을 곁들인 인산염 완충식식염)이 세포를 통과한다.</li>
	<li>dH2O (800 mg의 PFA 에서 dH2O)로 신선한 4 % 파라 포름알데히?...

<ol>
	<li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+primary+cilia:+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells,+but+a+"sleeping+beauty"+in+cultured+cells.">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li><li>Sloboda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primary cilia. , (2009).</li><li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control.">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts.">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation.">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li><li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length.">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li><li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys.">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).</li><li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism.">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li><li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neurons+show+a+primary+cilium.">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li><li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium.">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption,+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors.">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li><li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase,+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1.">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li><li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cilium:+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit.">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li><li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autophagy-Cilia+Axis:+An+Intricate+Relationship.">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905 (2019).</li><li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+primary+cilia+dynamics+using+fluorescence+microscopy.">Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2012).</li><li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia.">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li><li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+(ACDC).">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1 (2019).</li><li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis.">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+novel+machineries+required+for+both+ciliogenesis+and+cell+cycle+arrest+upon+serum+starvation.">Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).</li><li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer:+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues.">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li><li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li><li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding.">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).</li><li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling.">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5 (2017).</li><li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models.">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11 (2015).</li><li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy.">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li></ol>

몇몇 저자는 1 차적인 섬모의 검출을 위한 다양한 방법을 기술했습니다, 때때로6또한 그들의 검출6,20,,21,,22에영향을 미칠 수 있는 각종 고정 방법을 기술합니다. 에 관계없이 탐지를 위한 완전하고 간단한 프로토콜을 찾기가 어렵습니다. 이러한 방법의 준비 가용성은 의심 할 여지없이 1 차 섬모 조사?...

1 차 적인 섬모는 세포의 어머니 중심과 관련 되 었던 감각, 독방, 막 바인딩, 비 momotile 구조. 1 차 섬모는 적혈구, 백혈구1,및 간세포2를제외한 대부분의 척추 동물 세포에서 발견된다. 1차 섬모는 마이크로튜부에 의해 구성된 길쭉한 축소메로 형성되며, 그 주요 성분은 α-tubulin이다. 축 사 메는 기저체에서 성장, 이는 γ-tubulin에서 구조화. 기본 섬모의 길이는 2-10 μm 사이다릅니다. 그러나, 그 치수는 글리시션, 기아, 저산소증, 세포독성 스트레스, 또는 이온화 방사선3,,4,,5,,6,,7에노출 된 후 변경 될 수 있습니다. 일반적으로, 세포는 세포 증식 및 분화8,,9에중요한 형태 발생 및 세포 신호 경로에 관여하는 단 하나의 1 차실을 갖는다.
1차 섬모는 세포 주기 진행 중에, 특히 G0/G1 단계 동안 동적으로 조절되며, HDAC6(히스톤 deacetylase 6)10에의해 매개되는 튜룰린 탈염과 관련된 과정에서 미토시스를 입력하기 전에 재조판된다. 1차 섬모 재흡수의 정확한 순간은 오로라 A, Plk1, TcTex-1 11,1112,13과같은 이 과정에 직접 관여하는 유전자의 세포 유형 및 발현에 따라 달라집니다.,, 세포 유형에 따라, 1 차 적인 섬모는 수용체의 다른 모형을 표현합니다, 이온 채널, 및 액티브 신호 통로. 이들은 증식및 생존에 영향을 미치는 가장 중요한 신호 수용체를 포함, EGFR, PDGFR, 및 FGFR. 또한 고슴도치, 노치 및 Wnt. 이러한 수용체 및 신호 경로 덕분에 하나 이상의 장기의 기능에 영향을 줄 수 있는 신호 경로 중 일부가 포함되어 있으며, 1차 섬모는 또한 화학 감각 기능을 수행합니다. 이 기능을 통해 1 차 적인 섬모 는 노치에 대 한 특정 리간드를 감지 할 수 있습니다., 호르몬, 그리고 세로토닌 또는 somatostatin 같은 생물학적 활성 물질. 다른 길이의 기본 섬모에 의해 전시 된 다른 특정 기능은 온도, 중력 및 진동(14)의변화에 대한 반응을 포함한다.
1차 섬모는 라이브 시각화, 전송 전자 현미경, 3D 이미징, 또는 1차,섬모5,15,,5,16,17의자동 검출을 위한 소프트웨어에 의해 다양한 방법을 통해 시각화될 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 고도로 전문화 하 고 지속적인 연구 연구의 모든 단계에서 기본, 신속 하 고 쉬운 방법을 필요. 기재된 배양된 세포에서 1차 섬모를 검출하기 위한 쉽고 유용한 방법이기 다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1301px;" width="1301">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">6-well plate</td>
			<td style="width:217px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92406</td>
			<td style="width:581px;">Dimensions 128x86x22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">111-546-047</td>
			<td>AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Goat Anti-Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Anti-Tubulin &#947;</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T5192</td>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">C2C12</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1772</td>
			<td>Myoblast (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Cy3</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2181</td>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab&#8242;)2 fragment&#8211;Cy3 antibody produced in sheep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dapi (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s medium</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td>High glucose, No glutamine, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:384px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td>With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">MEF</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">SCRC-1039</td>
			<td>Mouse embryonic fibroblast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7451</td>
			<td>Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">NHLF</td>
			<td style="width:217px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2512</td>
			<td>Primary lung fibroblasts (human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127-500G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:384px;">Skin fibroblasts</td>
			<td style="width:217px;">Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Kr&#225;lov&#233;.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Square Cover Slips</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22X22-1.5</td>
			<td>Borosilicate glass, 22x22mm, Square</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple detection of primary cilia by immunofluorescence

1 차 적인 섬모는 세포 주기 진행 도중 동적으로 통제됩니다, 특히 세포 주기의 G0/G1 단계 도중, 미토시스의 앞에 resorbed되고. 1 차 섬모는 전송 전자 현미경 검사법, 3D 이미징, 또는 1 차 섬모의 자동 검출을 위한 소프트웨어를 사용하는 것을 포함하여 고도로 정교한 방법으로 시각화될 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법을 수행하기 위해서는 1차 섬모의 면역형성 염색이 필요하다. 이 간행물은 아세틸화 알파 튜룰린 (axoneme)과 감마 튜룰린 (기저 몸)을 염색하여 체외에서 1 차 섬모를 쉽게 검출하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 면역 형광 염색 프로토콜은 비교적 간단하고 고품질의 이미지를 초래합니다. 본 프로토콜은 1차 섬모를 발현하는 4개의 세포주(C2C12, MEF, NHLF 및 피부 섬유아세포)가 어떻게 고정되고 면역염색되고 형광 또는 공초점 현미경으로 이미지되었는지를 설명합니다.

1 차 적인 섬모의 면역 형광 염색은 고품질 심상을 초래하는 상대적으로 간단한 절차입니다. 이러한 실험에서, 1차 섬모를 발현하는 섬유아세포는 위에서 설명한 프로토콜에 따라 형광 또는 공초점 현미경으로 고정, 면역염색, 이미지화되었다. 1차 실륨은 아세틸화된 α-tubulin 및 γ-tubulin을 사용하여 검출되었다. 1차 섬모의 평가는 다양한 수준에서 수행될 수 있으며 이와 관련하여 임의의 변화는 ?...

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Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

1 차적인 섬모는 센티미터와 관련되었던 세포 외 구조물입니다. 면역 형광 염색에 의한 1 차 적인 섬모 검출은 매우 높은 품질의 심상을 초래하는 비교적 간단한 절차입니다. 이 프로토콜에서, 1 차적인 섬모를 표현하는 섬유아세포는 형광 또는 공초점 현미경으로 고정되고, 면역 염색되고, 심상화되었습니다.

면역 형광에 의한 1 차 적인 섬모의 간단한 검출

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

이 프로토콜은 다양한 연구 노력 내에서 배양 된 세포에서 1 차 적인 섬모를 빠르고 쉽게 감지 할 수 있습니다. 방법은 1 차적인 섬모의 기초 바디에 영향을 미치는 무질서에서 이용될 수 있었습니다. 이 절차는 또한 파라핀 임베디드 조직에서 1 차적인 섬모를 염색하거나 형광이 필요한 그밖 실험을 위해 적용될 수 있습니다.22~22mm 커버 슬립을 오토클레이핑하고 실험을 위한 재료를 준비한다. FBS와 페니실린 연쇄 절제술을 해, 그리고 문체 매체를 실온으로 따뜻하게 합니다. 트립신 EDTA 및 PBS로 세포를 통과합니다.원고 의 방향에 따라 신선한 4 % 파라 포름 알데히드, 문화 매체 및 1 % 젤라틴 솔루션을 준비하십시오. 그런 다음 70 %에탄올로 라미나르 흐름 후드를 청소하고 필요한 모든 재료를 내부에 놓습니다. 파라포름알데히드는 매우 위험합니다.적절한 PPE는 항상 착용해야하며 화학 적 후드에서만 처리해야합니다. 원하는 세포를 70%로 성장한 후 인큐베이터에서 분리하여 라미나르 플로우 후드에 놓습니다. 배양 배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 헹구는 다.배양 플라스크에 0.25%의 트립신 EDTA의 약 2밀리리터를 추가하고 5분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 분리를 모니터링하기 위해 반전 된 현미경에서 세포를 주기적으로 확인하십시오. 세포가 분리되면 배양 배지의 10 밀리리터에서 부드럽게 다시 중단하여 단일 셀 서스펜션을 만들기 위해 조심스럽게 파이펫팅합니다.셀 서스펜션을 50밀리리터 원내 튜브로 옮기고 원심분리기를 5분 동안 200배 G'로 옮긴다. 상류제를 데칭한 다음 10 밀리리터의 배양 배지를 추가하고 펠릿을 부드럽게 재보냅니다. 셀 서스펜션의 마이크로리터 20개를 사용하여 일대일 볼륨 비율로 트라이팬 블루와 혼합하십시오.그런 다음 표준 혈중계를 사용하여 세포를 계산합니다. 6개의 웰 플레이트의 각 웰 안에 커버 슬립을 놓고 커버 슬립을 젤라틴 용액의 2밀리리터로 코팅하여 커버 슬립에 부착된 세포가 미끄러지는 데 도움이 됩니다. 젤라틴을 제거하고 접시가 몇 분 동안 공기 건조하게하십시오.씨앗 100, 000 각 우물에 섬유 아세포와 배양 배지의 두 밀리리터를 추가. 그런 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 상대 습도 90%로 24시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 세포를 치료하여 섬광을 유도한다.4%의 파라포름알데히드를 실온으로 데우고 목초지 파이펫, ABS, 폐기물 용기, 15밀리리터 원판 튜브, 마이크로 파이펫 및 팁을 준비합니다. 인큐베이터에서 세포를 가져 와서 실험실 벤치에 놓습니다. 각 우물에서 미디어를 제거하고 덮개가 미끄러져 둡깁니다.PBS의 두 밀리리터로 셀을 세 번 부드럽게 씻으십시오. 그런 다음 세포를 고치기 위해 각 웰에 4 %PFA의 2 밀리리터를 추가합니다. 상온에서 10분 동안 플레이트를 배양한 다음 PFA를 제거하고 PBS로 세척을 반복합니다.각 웰에 0.5%트리톤 X-100의 밀리리터 2개를 넣고 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 PBS로 우물을 네 번 씻으시면 됩니다. 차단 용액을 만들려면 염소 세럼을 5분 동안 해동하고 PBS에서 1 대 20 비율로 희석합니다.이 솔루션의 마이크로리터 150개를 각 커버 슬립에 넣고 플레이트를 20분 동안 배양합니다. 1차 항체를 5분 동안 해동하고, 텍스트 원고에 설명된 대로 PBS에서 별도로 희석한다. 커버 슬립에서 차단 용액을 제거하고 두 항체 용액의 150 마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 상온에서 60 분 동안 접시를 배양하십시오. 1차 항체를 제거하고 PBS의 2밀리리터로 커버 슬립을 세 번 부드럽게 씻습니다. CY3 양 항마우스 및 알렉사 플루오 488 염소 안티 토끼PBS에서 1 ~ 300 비율로 희석하고, 커버 슬립에 두 이차 항체 용액의 150 마이크로 리터를 추가합니다.PBS의 50 밀리리터에 10 마이크로리터를 희석하여 작동하는 DAPI 솔루션을 준비하고 이 희석제 2밀리리터를 커버 슬립에 추가합니다. 상온에서 어둠 속에서 5분 동안 접시를 배양합니다. 커버를 슬라이드에 놓기 전에 두 개의 바늘, 핀셋 및 장착 미디어를 준비하고 모든 슬라이드에 레이블을 지정합니다.우물에서 DAPI 용액을 제거하고 PBS로 세 번 세척합니다. 각 슬라이드에 마운팅 미디어를 한 방울 만 넣습니다. 바늘을 사용하여 우물 바닥에서 커버 슬립을 부드럽게 들어 올립니다.그런 다음 그것을 뒤집어 핀셋을 사용하여 장착 매체의 드롭 위에 부드럽게 놓습니다. 조심스럽게 거품을 제거합니다. 슬라이드를 빛으로부터 보호하고 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오.다음 날에는 높은 배율로 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 1 차 적인 섬모를 시각화합니다. 이 프로토콜은 면역스테인을 고치고, 1차 섬모를 발현하는 다양한 세포주를 이미지화하는 데 사용되었다. 마우스 근세포가 다양한 용량에서 이온화 방사선에 노출되었을 때, 더 높은 용량이 다중 1차 섬모의 출현을 유도하는 것으로 나타났다.낮은 복용량 단일 기본 섬모의 출현 귀 착되 게 하는 동안. 유사하게, 인간 폐 섬유아세포가 저용량으로 방사되었을 때, 단일 1차 섬모는 면역형광에 의해 검출되었다. 1 차적인 섬모에 있는 증가는 신진 대사 스트레스가 1 차적인 섬모의 사건에 영향을 미친다는 것을 보여주는 굶주린 마우스 배아 섬유아세포에서 관찰되었습니다.피부 섬유아세포가 120 나노몰러 독소루비신으로 치료되었을 때, 그들은 단일 1 차실을 표현했다. 더 높은 복용량 여러 기본 섬모의 모양을 유도. 1.25 나노 몰라 탁솔로 치료 된 섬유 아세포도 단일 기본 실륨을 표현했다.그러나 다중 섬모는 더 높은 복용량으로 처리 후에 검출되지 않았습니다. 이 프로토콜을 열 때 모든 PPE 규정을 따라야 합니다. 선택의 세포주의 배양 요구를 명심하고 신중하게 항체를 선택하십시오.이 절차는 세포가 복구할 수 없기 때문에 다른 절차를 직접 따를 수 없습니다. 대신 병렬 실험을 프로그래밍해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

기본 조직의 두 Thymidine의 Analogues의 Immunofluorescent 검색 (CldU 및 이두)

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

연구

생물학

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Zymography의 기능 매트릭스 Metalloproteinases의 감지

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Kupffer의 소포의 유전자 기능 및 속눈썹 생성 된 유체 흐름의 시각화 분석

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

라이브의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; O157 : PMA-qPCR에 의한 H7 셀

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 G 단백질 결합 수용체 내재화 검출

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...