Name: simple detection of primary cilia by immunofluorescence
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Forsvarsdepartementet i Tsjekkia - Langsiktig organisasjon utviklingsplan Medisinske aspekter av masseødeleggelsesvåpen av Fakultet for militære helsevitenskap, Forsvarsuniversitet; Kunnskapsdepartementet, Ungdom og idrett, Tsjekkia (Spesifikt forskningsprosjekt nr: SV/ FVZ201703) og PROGRES Q40/06. Takk også til Daniel Diaz for hans vennlige hjelp i engelsk språkrevisjon.

1. Utarbeidelse av kulturmedier, løsninger og retter
<ol><li>Autoklav dekkslips (22 x 22 mm). Forbered 6 brønnplater. Tin fosterbovinserum (FBS) og antibiotika penicillin/streptomycin og varm kulturmediet til romtemperatur (RT). Bruk trypsin-EDTA (0,25 %) og 1x PBS (fosfat bufret saltvann med kalsium og magnesium) for å passere cellene.</li>
	<li>Forbered fersk 4 % paraformaldehyd (PFA) i dH2O (800 mg PFA i 20 ml dH2O). PFA må være nylaget for hvert eksperiment. Rør og varm oppløsningen ved...

<ol>
	<li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+primary+cilia:+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells,+but+a+"sleeping+beauty"+in+cultured+cells.">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li><li>Sloboda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primary cilia. , (2009).</li><li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control.">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts.">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation.">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li><li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length.">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li><li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys.">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).</li><li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism.">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li><li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neurons+show+a+primary+cilium.">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li><li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium.">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption,+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors.">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li><li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase,+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1.">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li><li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cilium:+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit.">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li><li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autophagy-Cilia+Axis:+An+Intricate+Relationship.">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905 (2019).</li><li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+primary+cilia+dynamics+using+fluorescence+microscopy.">Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2012).</li><li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia.">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li><li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+(ACDC).">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1 (2019).</li><li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis.">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+novel+machineries+required+for+both+ciliogenesis+and+cell+cycle+arrest+upon+serum+starvation.">Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).</li><li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer:+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues.">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li><li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li><li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding.">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).</li><li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling.">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5 (2017).</li><li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models.">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11 (2015).</li><li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy.">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li></ol>

Flere forfattere har beskrevet ulike metoder for påvisning av primære flimmerhår, noen ganger også beskriver ulike fikseringsmetoder som kan påvirkederes deteksjon 6,20,21,22. Uansett er det vanskelig å finne en komplett og grei protokoll for deteksjon. Den klare tilgjengeligheten av en slik metode ville utvilsomt være til stor hjelp til studiet av primær flimmerhårundersøkelse, spesi...

Primær flimmerhår er sensoriske, ensomme, membranbundne, ikke-motile strukturer forbundet med cellens mor centriole. Primære flimmerhår finnes på de fleste virveldyrceller med unntak av røde blodlegemer, adipocytter1og hepatocytter2. Primær flimmerhår dannes som en langstrakt axoneme sammensatt av mikrotubuli, hvis hovedkomponent er α-tubulin. Aksonmen vokser fra basalkroppen, som er strukturert fra γ-tubulin. Lengden på den primære cilia varierer mellom 2-10 μm; imidlertid kan dimensjonene endres under glyylering, sult, hypoksi, cytotoksisk stress, eller etter eksponering for irioniserendestråling 3,4,5,6,7. Vanligvis har celler bare en primær cilium, som er involvert i morfogenese og cellesignalveier som er viktige for cellespredning og differensiering8,,9.
Primær flimmerhårene reguleres dynamisk under cellesyklusprogresjon, spesielt i G0/G1-fasene, og resorberes før de går inn i mitose i en prosess forbundet med tubulin deacetylering mediert av HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Det nøyaktige øyeblikket for primær cilia resorpsjon avhenger av celletype og uttrykk for gener direkte involvert i denne prosessen, for eksempel Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. Avhengig av celletypen uttrykker den primære beholderen ulike typer reseptorer, iionkanaler og aktive signalveier. Disse inkluderer de viktigste signalreseptorene som påvirker spredning og overlevelse, EGFR, PDGFR og FGFR. Også inkludert er noen av signalveiene som kan påvirke funksjonen til ett eller flere organer, inkludert Hedgehog, Notch og Wnt. Takket være disse reseptorene og signalveiene utfører primærflimmeri også en kjemosensorisk funksjon. Denne funksjonen gjør det mulig for primære flimmerhår å oppdage spesifikke ligander for hakk, hormoner og biologisk aktive stoffer som serotonin eller somatostatin. Andre spesifikke funksjoner utstilt av primære flimmerhår av forskjellige lengder inkluderer reaksjon på endringer i temperatur, tyngdekraft og osmolalitet14.
Primær flimmerhår kan visualiseres gjennom ulike metoder, for eksempel live visualisering, transmisjonselektronmikroskopi, 3D-bildebehandling eller ved programvare for automatisk påvisning av primære cilia5,,15,,16,,17. Disse metodene er imidlertid svært spesialiserte og pågående forskningsbehov grunnleggende, raske og enkle metoder for farging av primærflimmerhår i alle stadier av forskningen. Beskrevet er en enkel og nyttig metode for påvisning av primære flimmerhår i kultiverte celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1301px;" width="1301">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">6-well plate</td>
			<td style="width:217px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92406</td>
			<td style="width:581px;">Dimensions 128x86x22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">111-546-047</td>
			<td>AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Goat Anti-Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Anti-Tubulin &#947;</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T5192</td>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">C2C12</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1772</td>
			<td>Myoblast (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Cy3</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2181</td>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab&#8242;)2 fragment&#8211;Cy3 antibody produced in sheep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dapi (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s medium</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td>High glucose, No glutamine, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:384px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td>With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">MEF</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">SCRC-1039</td>
			<td>Mouse embryonic fibroblast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7451</td>
			<td>Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">NHLF</td>
			<td style="width:217px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2512</td>
			<td>Primary lung fibroblasts (human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127-500G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:384px;">Skin fibroblasts</td>
			<td style="width:217px;">Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Kr&#225;lov&#233;.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Square Cover Slips</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22X22-1.5</td>
			<td>Borosilicate glass, 22x22mm, Square</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple detection of primary cilia by immunofluorescence

Primær flimmerhår er dynamisk regulert under cellesyklusprogresjon, spesielt under G0/G1-fasene av cellesyklusen, som resorberes før mitose. Primær flimmerhår kan visualiseres med svært sofistikerte metoder, inkludert transmisjonselektronmikroskopi, 3D-bildebehandling eller bruk av programvare for automatisk påvisning av primære flimmerhår. Imidlertid er immunofluorescerende farging av primær flimmerhår nødvendig for å utføre disse metodene. Denne publikasjonen beskriver en protokoll for enkel påvisning av primære flimmerhår in vitro ved farging acetylated alfa tubulin (axoneme) og gamma tubulin (basal kropp). Denne immunofluorescerende fargeprotokollen er relativt enkel og resulterer i bilder av høy kvalitet. Den nåværende protokollen beskriver hvordan fire cellelinjer (C2C12, MEF, NHLF og hudfibroblaster) som uttrykker primære flimmerhår ble fikset, immunostet og avbildet med et fluorescerende eller konfokalt mikroskop.

Immunofluorescerende farging av primære flimmerhår er en relativt enkel prosedyre som resulterer i bilder av høy kvalitet. I disse eksperimentene ble fibroblaster som uttrykte primære flimmerhårene faste, immunostained og avbildet i et fluorescerende eller konfokalt mikroskop etter protokollen beskrevet ovenfor. Det primære ciliumet ble oppdaget ved hjelp av acetylated α-tubulin og γ-tubulin. Evalueringen av primære flimmerhår kan utføres på ulike nivåer, og enhver endring i denne forbindelse kan knyttes til...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primær flimmerhår er ekstracellulære strukturer forbundet med centriole. Primær deteksjon av flimmerhår av immunofluorescerende farging er en relativt enkel prosedyre som resulterer i ekstremt bilder av høy kvalitet. I denne protokollen ble fibroblaster som uttrykte primære flimmerhårene faste, immunostained og avbildet i et fluorescerende eller konfokalt mikroskop.

Enkel påvisning av primær cilia ved immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Denne protokollen muliggjør rask og enkel påvisning av primære flimmerhår i kultiverte celler, innenfor en rekke forskningsbestrebelser. Metoden kan benyttes i lidelse som påvirker basallegemene til primærflimmerhårene. Denne prosedyren kan også brukes for farging primære flimmerhår i parafin innebygd vev eller for andre eksperimenter der fluorescens er nødvendig.Begynn med autoklavering 22 med 22 millimeter dekselslips, og forbereder materialer for eksperimentet. Tin FBS og penicillin streptomycin, og varm kulturmediet til romtemperatur. Passage cellene med trypsin EDTA og PBS.Forbered fersk 4% paraformaldehyd, kulturmedium og 1% gelatinløsning, i henhold til manuskriptretninger. Rengjør deretter laminærstrømningshetten med 70% etanol, og legg alle nødvendige materialer inni. Paraformaldehyd er ekstremt farlig.Riktig PPE må brukes til enhver tid, og det bør bare håndteres i en kjemisk hette. Etter å ha vokst de ønskede cellene til 70% samløpet, fjern dem fra inkubatoren, og plasser dem i laminær strømningshette. Fjern kulturmediet og skyll cellene to ganger med PBS.Legg til omtrent to milliliter på 0,25% trypsin EDTA til kulturkolben, og inkuber den ved 37 grader Celsius i fem minutter. Kontroller cellene regelmessig på det inverterte mikroskopet for å overvåke løsrivelse. Når cellene har løsnet forsiktig resuspend dem i 10 milliliter kultur medium, pipettering nøye for å skape en enkelt celle suspensjon.Overfør cellefjæringen til et konisk rør på 50 milliliter og sentrifuger den ved 200 ganger G'i fem minutter. Dekanter supernatanten og tilsett deretter 10 milliliter kulturmedium, og forsiktig resuspend pellet. Ta 20 mikroliter av cellefjæringen og bland den med trypan blå med et en-til-en-volumforhold.Tell deretter cellene ved hjelp av standard hemocytometry. Plasser et deksel slip inne i hver brønn av en seks brønnplate, og belegge dekselet slip med to milliliter av gelatin løsning, som vil hjelpe cellene festet til dekselet slip. Fjern gelatinen og la platen lufttørke i noen minutter.Seed 100, 000 fibroblaster i hver brønn og legg til to milliliter kulturmedium. Deretter inkubere cellene i 24 timer ved 37 grader Celsius, fem prosent karbondioksid og 90% relativ fuktighet. Etter inkubasjonen behandle cellene for å indusere ciliation.Varm 4% paraformaldehyd til romtemperatur, og lag en beitepipetter, ABS, en avfallsbeholder, 15 milliliter koniske rør, mikropipetter og tips. Ta cellene fra inkubatoren, og plasser dem på laboratoriebenken. Fjern utskriftsmaterialet fra hver brønn, slik at dekselet glir.Vask forsiktig cellene tre ganger med to milliliter PBS. Legg deretter til to milliliter av 4% PFA i hver brønn for å fikse cellene. Inkuber platen i 10 minutter ved romtemperatur, fjern deretter PFA, og gjenta vaskene med PBS.Tilsett to milliliter på 0,5% Triton X-100 til hver brønn, og inkuber platen i 15 minutter. Vask deretter brønnene fire ganger med PBS. For å lage blokkeringsløsningen, tin et geiteserum i fem minutter, og fortynne den i PBS med ett til 20-forhold.Tilsett 150 mikroliter av denne oppløsningen til hver dekkslipp, og inkuber platen i 20 minutter. Tin de primære antistoffene i fem minutter, og fortynne dem separat i PBS, som beskrevet i tekstmanuskriptet. Fjern blokkeringsløsningen fra dekselslippene og tilsett 150 mikroliter av begge antistoffløsningene.Inkuber deretter platen i 60 minutter ved romtemperatur. Fjern de primære antistoffene og vask forsiktig dekselet tre ganger med to milliliter PBS. Fortynn Cy3 Sheep Anti-Mouse og Alexa fluor 488 Geit anti-Rabbit i PBS, med ett til 300-forhold, og legg til 150 mikroliter av begge sekundære antistoffløsninger til dekkslipen.Forbered en fungerende DAPI-løsning ved å fortynne 10 mikroliter av aksjen i 50 milliliter PBS, og tilsett to milliliter av denne fortynningen til dekselslippene. Inkuber platen i fem minutter i mørket, ved romtemperatur. Før du plasserer dekselet glir på lysbildene, forberede to nåler, pinsett, og monteringsmedier, og merke alle lysbildene.Fjern DAPI-løsningen fra brønnene, og vask dem tre ganger med PBS. Sett én dråpe monteringsmedier på hvert lysbilde. Bruk nålen til å løfte dekselet forsiktig fra brønnens bunn.Snu den og plasser den forsiktig over dråpen med monteringsmedier ved hjelp av pinsettene. Fjern forsiktig eventuelle bobler. Beskytt lysbildene mot lys og lagre dem over natten på fire grader Celsius.Neste dag bruker du et fluorescerende eller konfokalt mikroskop med høy forstørrelse for å visualisere den primære flimmerhårene. Denne protokollen ble brukt til å fikse immunstain, og bilde ulike cellelinjer som uttrykker primære flimmerhår. Når mus myoblaster ble utsatt for iioniserende stråling ved ulike doser, ble det funnet at høyere doser induserer utseendet av flere primære flimmerhår.Mens lave doser resulterte i utseendet av enkelt primære flimmerhår. Tilsvarende, når humane lunge fibroblaster ble utstrålt ved en lav dose, ble enkelt primære flimmerhårene oppdaget ved immunofluorescence. En økning i primærflimmerhår ble observert i embryonale fibroblaster som ble sultet, noe som viste at metabolsk stress påvirker hendelsene i primærflimmerhårene.Når hudfibroblaster ble behandlet med 120 nanomolar doksorubicin, uttrykte de en enkelt primærcilium. Høyere doser induserer utseendet av flere primære flimmerhår. Fibroblaster behandlet med 1,25 nanomært Taxol uttrykte også en enkelt primærcilium.Men flere flimmerhår ble ikke påvist etter behandling med høyere doser. Når du åpner denne protokollen, må du følge alle PPE-forskrifter. Husk kulturbehovene til din cellelinje av valget og valgte antistoffene dine nøye.Denne prosedyren kan ikke følges direkte av andre prosedyrer, siden cellene er uopprettelige. I stedet bør parallelle eksperimenter programmeres.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Påvisning av virale RNA ved fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Analyse av gen-funksjon og visualisering av Cilia-generert Væskestrøm i Kupffer sin Vesikkel

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Påvisning av Levende<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecal Glukokortikoid analyse: Ikke-invasiv Adrenal Monitoring i Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Påvisning av ligand-aktiverte G-protein-koblet reseptor Internalisering ved hjelp av konfokal mikroskopi

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...