Name: simple detection of primary cilia by immunofluorescence
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

Detta arbete stöddes av försvarsministeriet i Tjeckien - Långsiktig organisation utvecklingsplan Medicinska Aspekter av massförstörelsevapen vid fakulteten för militära hälsovetenskaper, Försvarshögskolan; ministeriet för utbildning, ungdomsfrågor och idrott, Tjeckien (särskilt forskningsprojekt nr: SV/ FVZ201703) och PROGRES Q40/06. Tack också till Daniel Diaz för hans vänliga hjälp i engelska språkrevidering.

1. Beredning av kultur media, lösningar, och rätter
<ol><li>Autoklavera täcksliparna (22 x 22 mm). Förbered 6 brunnsplåtar. Thaw fetala bovin serum (FBS) och antibiotika penicillin/streptomycin och värma odlingsmediet till rumstemperatur (RT). Använd trypsin-EDTA (0,25%) och 1x PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning med kalcium och magnesium) för att få passage av cellerna.</li>
	<li>Bered färsk paraformaldehyd (PFA) med 4 % i dH2O (800 mg PFA i 20 mL dH2O). PFA måste vara nyförberedd för...

<ol>
	<li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+primary+cilia:+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells,+but+a+"sleeping+beauty"+in+cultured+cells.">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li><li>Sloboda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primary cilia. , (2009).</li><li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control.">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts.">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation.">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li><li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length.">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li><li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys.">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).</li><li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism.">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li><li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neurons+show+a+primary+cilium.">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li><li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium.">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption,+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors.">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li><li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase,+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1.">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li><li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cilium:+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit.">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li><li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autophagy-Cilia+Axis:+An+Intricate+Relationship.">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905 (2019).</li><li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+primary+cilia+dynamics+using+fluorescence+microscopy.">Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2012).</li><li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia.">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li><li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+(ACDC).">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1 (2019).</li><li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis.">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+novel+machineries+required+for+both+ciliogenesis+and+cell+cycle+arrest+upon+serum+starvation.">Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).</li><li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer:+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues.">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li><li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li><li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding.">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).</li><li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling.">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5 (2017).</li><li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models.">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11 (2015).</li><li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy.">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li></ol>

Flera författare har beskrivit olika metoder för detektering av primära cilier, ibland också beskriva olika fixeringsmetoder som kan påverka deras upptäckt6,20,21,22. Oavsett är det svårt att hitta ett komplett och okomplicerat protokoll för identifiering. Den färdiga tillgången på en sådan metod skulle utan tvekan vara till stor hjälp för att studera primär cilier utredning, s?...

Primära cilier är sensoriska, solitary, membran-bundna, nonmotile strukturer som är associerade med cellens moder centriole. Primära cilier finns på de flesta ryggradsdjur celler med undantag av röda blodkroppar, adipocyter1, och hepatocyter2. Primära cilier bildas som en avlång axoneme komponerad av mikrotubuli, vars huvudkomponent är α-tubulin. Axonemen växer från den basala kroppen, som är strukturerad från γ-tubulin. Längden på den primära cilier varierar mellan 2–10 μm; dess dimensioner kan dock förändras under glykoliation, svält, hypoxi, cytotoxisk stress, eller efter exponering för joniserande strålning3,4,5,6,7. Vanligtvis har celler bara en primärcilium, som är involverad i morfogenes och cellsignaleringsvägar som är viktiga för cellproliferation och differentiering8,9.
Primära cilier regleras dynamiskt under cellcykelns förlopp, specifikt under G0/G1-faserna, och resorbed innan man går in mitos i en process som är associerad med tubulin deacetylation medierad av HDAC6 (hitondeacetylase 6)10. Det exakta ögonblicket för primär cilier resorption beror på celltyp och uttrycket av gener som är direkt involverade i denna process, såsom Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. Beroende på celltyp uttrycker de primära cilierna olika typer av receptorer, jonkanaler och aktiva signalvägar. Dessa inkluderar de viktigaste signalreceptorerna som påverkar proliferation och överlevnad, EGFR, PDGFR, och FGFR. Också ingår några av de signalervägar som kan påverka funktionen av ett eller flera organ, inklusive Hedgehog, Notch, och Wnt. Tack vare dessa receptorer och signalvägar, den primära cilier också utföra en chemosensory funktion. Denna funktion gör det möjligt för primära cilier att upptäcka specifika ligander för Notch, hormoner, och biologiskt aktiva substanser såsom serotonin eller somatostatin. Andra specifika funktioner som uppvisas av primära cilier av olika längder inkluderar reaktion på förändringar i temperatur, gravitation, och osmolalitet14.
Primära cilier kan visualiseras genom olika metoder, såsom livevisualisering, transmissionselektronmikroskopi, 3D-avbildning, eller genom programvara för automatisk detektering av primär cilier5,15,16,17. Emellertid, dessa metoder är mycket specialiserade och pågående forskning behöver grundläggande, snabb, och enkla metoder för färgning primära cilier i varje skede av forskningen. Beskrivs är en enkel och användbar metod för detektion av primära cilier i odlade celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1301px;" width="1301">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">6-well plate</td>
			<td style="width:217px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92406</td>
			<td style="width:581px;">Dimensions 128x86x22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">111-546-047</td>
			<td>AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Goat Anti-Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Anti-Tubulin &#947;</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T5192</td>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">C2C12</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1772</td>
			<td>Myoblast (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Cy3</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2181</td>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab&#8242;)2 fragment&#8211;Cy3 antibody produced in sheep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dapi (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s medium</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td>High glucose, No glutamine, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:384px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td>With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">MEF</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">SCRC-1039</td>
			<td>Mouse embryonic fibroblast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7451</td>
			<td>Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">NHLF</td>
			<td style="width:217px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2512</td>
			<td>Primary lung fibroblasts (human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127-500G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:384px;">Skin fibroblasts</td>
			<td style="width:217px;">Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Kr&#225;lov&#233;.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Square Cover Slips</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22X22-1.5</td>
			<td>Borosilicate glass, 22x22mm, Square</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple detection of primary cilia by immunofluorescence

Primära cilier regleras dynamiskt under cellcykelns förlopp, specifikt under faserna G0/G1 av cellcykeln, som resorberas före mitos. Primära cilier kan visualiseras med mycket sofistikerade metoder, inklusive transmissionselektronmikroskopi, 3D-avbildning, eller med hjälp av programvara för automatisk detektering av primära cilier. Men immunofluorescent färgning av primära cilier behövs för att utföra dessa metoder. Denna publikation beskriver ett protokoll för enkel upptäckt av primära cilier in vitro genom färgning acetylerat alfa tubulin (axoneme) och gamma tubulin (basal kropp). Detta immunofluorescerande färgningsprotokoll är relativt enkelt och resulterar i bilder av hög kvalitet. Det föreliggande protokollet beskriver hur fyra cellinjer (C2C12, MEF, NHLF och hudfibroblaster) som uttrycker primära cilier var fasta, immunstainerade och avbildade med ett fluorescerande eller konfokalmikroskop.

Den immunofluorescerande färgning av primära cilier är en relativt enkel procedur som resulterar i högkvalitativa bilder. I dessa experiment, fibroblaster uttrycker primära cilier var fast, immunostained och avbildas i en fluorescerande eller confocal mikroskop efter protokollet som beskrivs ovan. Den primära cilium upptäcktes med hjälp av acetylerade α-tubulin och γ-tubulin. Utvärderingen av primära cilier kan utföras på olika nivåer och varje förändring i detta avseende kan kopplas till exponering för...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primära cilier är extracellulära strukturer som är associerade med centriole. Primära cilier upptäckt av immunofluorescent färgning är en relativt enkel procedur som resulterar i extremt högkvalitativa bilder. I detta protokoll, fibroblaster uttrycker primära cilier var fast, immunostained och avbildas i en fluorescerande eller confocal mikroskop.

Enkel Detektion av primär Cilier genom immunofluorescens

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Detta protokoll möjliggör snabb och enkel upptäckt av primära cilier i odlade celler, inom en mängd olika forskning strävanden. Metoden skulle kunna utnyttjas i oordning som påverkar de basala organ primära cilier. Detta förfarande kan också tillämpas för färgning primära cilier i paraffin inbäddad vävnad eller för andra experiment där fluorescens behövs.Börja med att autoklavera 22 av 22 millimeters täckslir, och förbereda material för experimentet. Tina FBS och penicillin streptomycin, och värma odlingsmediet till rumstemperatur. Passage cellerna med trypsin EDTA och PBS.Förbered färsk 4%paraformaldehyd, odlingsmedium och 1%gelatinlösning, enligt manuskriptriktningar. Rengör sedan laminär flödeshuven med 70%etanol, och placera alla erforderliga material inuti. Paraformaldehyd är extremt farligt.Korrekt personlig skyddsutrustning måste alltid bäras, och den ska bara hanteras i en kemisk huva. Efter odling av de önskade cellerna till 70%sammanflödet ta bort dem från inkubatorn, och placera dem i laminär flöde huva. Ta bort odlingsmediet och skölj cellerna två gånger med PBS.Tillsätt ungefär två milliliter på 0,25%trypsin EDTA till odlingskolven, och inkubera den i 37 grader Celsius i fem minuter. Kontrollera cellerna med jämna mellanrum på det inverterade mikroskopet för att övervaka lösgöring. När cellerna har lossnat försiktigt resuspend dem i 10 milliliter av kultur medium, pipettering försiktigt för att skapa en enda cell suspension.Överför cellupphängningen till ett koniskt rör på 50 milliliter och centrifug den vid 200 gånger G'i fem minuter. Dekantera supernatanten tillsätt sedan 10 milliliter odlingsmedium, och försiktigt återanvända pelleten. Ta 20 mikroliter av cellen suspension och blanda det med trypan blå på en en-till-en volymförhållande.Räkna sedan cellerna med hjälp av vanlig hemocytometry. Placera en täckslir inuti varje brunn av en sex brunnsplatta, och täck täckslilen med två milliliter av gelatinlösningen, vilket kommer att hjälpa de celler som är fästa vid täckslilen. Ta bort gelatinet och låt plattan lufttorka i några minuter.Seed 100, 000 fibroblaster i varje brunn och tillsätt två milliliter av odlingsmedium. Sedan inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 grader Celsius, fem procent koldioxid, och 90% relativ luftfuktighet. Efter inkubationen behandla cellerna för att inducera ciliation.Värm 4%paraformaldehyd till rumstemperatur, och förbereda en betesmark pipetter, ABS, en avfallsbehållare, 15 milliliter koniska rör, mikropipetter och tips. Ta cellerna från inkubatorn, och placera dem på labbbänken. Ta bort media från varje brunn och lämna luckan.Tvätta försiktigt cellerna tre gånger med två milliliter PBS. Lägg sedan till två milliliter av 4%PFA i varje brunn för att fixa cellerna. Inkubera plattan i 10 minuter i rumstemperatur, ta sedan bort PFA, och upprepa tvättar med PBS.Tillsätt två milliliter på 0,5%Triton X-100 till varje brunn, och inkubera plattan i 15 minuter. Tvätta sedan brunnarna fyra gånger med PBS. För att göra blockeringslösningen tina ett getserum i fem minuter och späda ut den i PBS i ett till 20-förhållande.Tillsätt 150 mikroliter av denna lösning till varje täcksli, och inkubera plattan i 20 minuter. Tina de primära antikropparna i fem minuter, och späd ut dem separat i PBS, som beskrivs i textmanuskriptet. Ta bort blockeringslösningen från täcksliorna och tillsätt 150 mikroliter av båda antikroppslösningarna.Därefter inkubera plattan i 60 minuter i rumstemperatur. Ta bort de primära antikropparna och tvätta försiktigt locket glider tre gånger med två milliliter PBS. Späd Cy3 Får Anti-Mouse och Alexa fluor 488 Get anti-Rabbit i PBS, vid en ett till 300 förhållande, och tillsätt 150 mikroliter av både sekundära antikropp lösningar till locket slip.Bered en fungerande DAPI-lösning genom att späda 10 mikroliter av beståndet i 50 milliliter PBS, och tillsätt två milliliter av denna utspädning till täcksliorna. Inkubera plattan i fem minuter i mörker, vid rumstemperatur. Innan du placerar locket glider på bilderna, förbereda två nålar, pincett, och monteringsmedia, och etikett alla diabilder.Ta bort DAPI-lösningen från brunnarna, och tvätta dem tre gånger med PBS. Sätt en droppe monteringsmedia på varje bild. Använd nålen för att försiktigt lyfta täckslitten från brunnens botten.Vänd sedan den och placera den försiktigt över släpp av monteringsmedia med hjälp av pincetten. Ta försiktigt bort eventuella bubblor. Skydda diabilderna från ljus och förvara dem över natten vid fyra grader Celsius.På nästa dag använda en fluorescerande eller konfokalmikroskop med en hög förstoring för att visualisera den primära cilier. Detta protokoll användes för att fixa immunostain, och bild olika cellinjer uttrycker primära cilier. När mus myoblaster utsattes för joniserande strålning vid olika doser, konstaterades det att högre doser inducera utseendet på flera primära cilier.Medan låga doser resulterade i utseendet på enda primära cilier. På samma sätt, när mänskliga lung fibroblaster utstrålades vid en låg dos, single primära cilier upptäcktes av immunofluorescens. En ökning av primära cilier observerades i mus embryonala fibroblaster som var utsvulten, visar att metabolisk stress påverkar incidenter primära cilier.När huden fibroblaster behandlades med 120 nanomolar doxorubicin, uttryckte de en enda primär cilium. Högre doser inducerar utseendet av flera primära cilier. Fibroblaster som behandlats med 1,25 nanomolar Taxol uttryckte också ett enda primärcilium.Men flera cilier upptäcktes inte efter behandling med högre doser. När du öppnar detta protokoll se till att följa alla PPE-föreskrifter. Tänk på kulturbehoven hos din cellinje val och valde dina antikroppar noggrant.Detta förfarande kan inte följas direkt av andra förfaranden, eftersom cellerna är oåterkalleliga. I stället bör parallella experiment programmeras.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Immunofluorescens Upptäckt av två tymidinanaloger (CldU och IDU) i Primär Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Upptäckt av Funktionell metalloproteinaser av Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Upptäckt av post-translationella modifieringar på inhemska intakt nukleosomer med ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Detektering av viralt RNA genom Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Analys av geners funktion och Visualisering av Cilia-genererade vätskeflöde i Kupffer s vesikel

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Upptäckt av Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler genom PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Analys av apoptos i Zebrafish embryon genom Hela montering Immunofluorescence att upptäcka Aktiverad Caspas 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fekal Glukokortikoid Analys: Icke-invasiv Adrenal Övervakning av equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Detektering av ligand-aktiverade G-proteinkopplade receptorer Interna genom konfokalmikroskopi

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...