Name: simple detection of primary cilia by immunofluorescence
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

Bu çalışma Çek Cumhuriyeti Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir - Uzun vadeli organizasyon geliştirme planı Askeri Sağlık Bilimleri Fakültesi, Savunma Üniversitesi Kitle İmha Silah Tıbbi Yönleri; Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı, Çek Cumhuriyeti (Özel Araştırma Projesi No: SV/ FVZ201703) ve PROGRES Q40/06. Ayrıca Daniel Diaz İngilizce dil revizyon yaptığı tür yardım için teşekkür ederiz.

1. Kültür ortamının, çözümlerinin ve yemeklerinin hazırlanması
<ol><li>Otoklav kapakları (22 x 22 mm). 6 iyi plaka hazırlayın. Çözülme fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotik penisilin / streptomisin ve oda sıcaklığına kültür ortamı sıcak (RT). Tripsin-EDTA (%0.25) kullanın ve 1x PBS (kalsiyum ve magnezyum ile tamponlu salin) hücreleri geçmesi.</li>
	<li>DH2O'nda taze %4 paraformaldehit (PFA) (20 mL dH2O'da 800 mg PFA) hazırlayın. PfA her deney için yeni olarak haz?...

<ol>
	<li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+primary+cilia:+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells,+but+a+"sleeping+beauty"+in+cultured+cells.">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li><li>Sloboda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primary cilia. , (2009).</li><li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control.">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts.">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li><li>Filipov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation.">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li><li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length.">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li><li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys.">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).</li><li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism.">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li><li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neurons+show+a+primary+cilium.">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li><li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium.">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption,+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors.">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li><li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase,+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1.">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li><li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cilium:+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit.">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li><li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autophagy-Cilia+Axis:+An+Intricate+Relationship.">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905 (2019).</li><li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+primary+cilia+dynamics+using+fluorescence+microscopy.">Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2012).</li><li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia.">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li><li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+(ACDC).">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1 (2019).</li><li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis.">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+novel+machineries+required+for+both+ciliogenesis+and+cell+cycle+arrest+upon+serum+starvation.">Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).</li><li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer:+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues.">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li><li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li><li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding.">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).</li><li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling.">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5 (2017).</li><li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models.">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11 (2015).</li><li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy.">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li></ol>

Çeşitli yazarlar birincil silya tespiti için çeşitli yöntemler açıklanan, bazen de kendi algılama etkileyebilir çeşitli fiksasyon yöntemleri açıklayan6,20,21,22. Ne olursa olsun, algılama için tam ve basit bir protokol bulmak zordur. Böyle bir yöntemin hazır kullanılabilirliği şüphesiz birincil silya soruşturma çalışmasına büyük yardımcı olacaktır, özellikle ar...

Primer silia duyusal, soliter, membrana bağlı, hücrenin ana centriole ile ilişkili nonmotile yapılardır. Primer silya kırmızı kan hücreleri hariç en omurgalı hücrelerde bulunur, adipositler1, ve hepatositler2. Primer silya, ana bileşeni α-tubulin olan mikrotübüllerden oluşan uzamış bir aksonme olarak oluşur. Aksonme γ-tubulin yapılandırılır bazal gövde, yetişir. Primer silyanın uzunluğu 2-10 μm arasında değişir; ancak, boyutları glisilasyon sırasında değişebilir, açlık, hipoksi, sitotoksik stres, ya da iyonlaştırıcıradyasyonamaruz kaldıktan sonra 3,4,5,6,7. Genellikle, hücrelerin sadece bir birincil cilium var, hangi morfogenez ve hücre sinyalyolları hücre çoğalması ve farklılaşma için önemli yer almaktadır8,9.
Primer silia, özellikle G0/G1 evrelerinde hücre döngüsü ilerlemesi sırasında dinamik olarak düzenlenir ve HDAC6 (histone deacetylaz 6)10aracılı tubulin deasetilasyonu ile ilişkili bir süreçte mitoz bölünmeye girmeden önce rezorbe edilir. Primer silia rezorpsiyon tam an hücre tipi ve doğrudan aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13gibi bu süreçte yer genlerin ekspresyonuna bağlıdır.13 Hücre tipine bağlı olarak, primer silya reseptörleri farklı ifade, iyon kanalları, ve aktif sinyal yolları. Bunlar arasında proliferasyon ve sağkalımı etkileyen en önemli sinyal reseptörleri, EGFR, PDGFR ve FGFR bulunmaktadır. Kirpi, Çentik ve Wnt gibi bir veya daha fazla organın işlevini etkileyebilecek sinyal yollarından bazıları da dahildir. Bu fonksiyon birincil silya Çentik için belirli ligands tespit sağlar, hormonlar, ve serotonin veya somatostatin gibi biyolojik olarak aktif maddeler. Farklı uzunluklarda primer silya tarafından sergilenen diğer özel fonksiyonlar sıcaklık, yerçekimi ve osmolality14değişikliklere reaksiyon içerir.
Birincil silia canlı görselleştirme, iletim elektron mikroskobu, 3D görüntüleme, ya da birincil silia55,15,,16,17otomatik algılama için yazılım gibi çeşitli yöntemlerle görselleştirilmiş olabilir. Ancak, bu yöntemler son derece uzmanlaşmış ve devam eden araştırma araştırma her aşamasında birincil silya boyama için temel, hızlı ve kolay yöntemler ihtiyacı vardır. Açıklanan kültürlü hücrelerde birincil silya tespiti için kolay ve yararlı bir yöntemdir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1301px;" width="1301">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">6-well plate</td>
			<td style="width:217px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92406</td>
			<td style="width:581px;">Dimensions 128x86x22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Alexa Fluor488</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">111-546-047</td>
			<td>AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Goat Anti-Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Anti-Tubulin &#947;</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T5192</td>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">C2C12</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1772</td>
			<td>Myoblast (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Cy3</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2181</td>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab&#8242;)2 fragment&#8211;Cy3 antibody produced in sheep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dapi (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s medium</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td>High glucose, No glutamine, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:384px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td>With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">MEF</td>
			<td style="width:217px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">SCRC-1039</td>
			<td>Mouse embryonic fibroblast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7451</td>
			<td>Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">NHLF</td>
			<td style="width:217px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2512</td>
			<td>Primary lung fibroblasts (human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:217px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127-500G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:384px;">Skin fibroblasts</td>
			<td style="width:217px;">Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Kr&#225;lov&#233;.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Square Cover Slips</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22X22-1.5</td>
			<td>Borosilicate glass, 22x22mm, Square</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:217px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Sterile-Filtered, Gibco</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple detection of primary cilia by immunofluorescence

Primer silya, hücre döngüsünün ilerlemesi sırasında, özellikle hücre döngüsünün G0/G1 evreleri sırasında, mitoz dan önce rezorbe edilir. Primer silia iletim elektron mikroskobu, 3D görüntüleme, ya da primer silia otomatik algılama için yazılım kullanarak dahil olmak üzere son derece sofistike yöntemlerle görselleştirilmiş olabilir. Ancak bu yöntemlerin gerçeklefltirilmesi için primer silyanın immünüdüoresan boyamasi gerekmektedir. Bu yayın asetilli alfa tubulin boyama tarafından primer silia in vitro kolay tespiti için bir protokol açıklar (aksoneme) ve gama tubulin (bazal vücut). Bu immünofloresan boyama protokolü nispeten basittir ve yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanır. Bu protokol, primer silya'yı ifade eden dört hücre hattının (C2C12, MEF, NHLF ve deri fibroblastları) nasıl sabit, immünosülvetli ve floresan veya konfokal mikroskopla görüntülenmiş olduğunu açıklamaktadır.

Primer silianın immünoresan boyama yüksek kaliteli görüntüler le sonuçlanan nispeten basit bir işlemdir. Bu deneylerde, primer silya ifade eden fibroblastlar, yukarıda açıklanan protokole göre floresan veya konfokal mikroskopiçinde sabit, immünoskoplu ve görüntülendi. Primer cilyum asetilatlı α-tubulin ve γ-tubulin kullanılarak saplandı. Primer silianın değerlendirilmesi çeşitli düzeylerde yapılabilir ve bu konudaki herhangi bir değişiklik iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalma ile bağlan...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence at JoVE.com

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primer silia centriole ile ilişkili hücre dışı yapılardır. İmmünfloresan boyama ile primer silia tespiti son derece yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanan nispeten basit bir işlemdir. Bu protokolde primer silya yı ifade eden fibroblastlar sabit, immünolekeli ve floresan veya konfokal mikroskopta görüntülendi.

İmmünfluoresan siyon ile Primer Silya'nın Basit Tespiti

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Bu protokol, çeşitli araştırma çalışmaları içinde, kültürlü hücrelerde birincil silya hızlı ve kolay tespit sağlar. Yöntem primer silya bazal organları etkileyen bozukluk kullanılabilir. Bu işlem aynı zamanda parafin gömülü dokuda primer silia boyama veya floresan gerekli diğer deneyler için uygulanabilir.22'ye 22 milimetrelik kapak fişlerini otomatikleştirerek ve deney için malzeme hazırlayarak başlayın. Çözülme FBS ve penisilin streptomisin, ve oda sıcaklığına kültür orta Sıcak. Tripsin EDTA ve PBS ile hücreleri geçiş.El yazması talimatlara göre taze %4 paraformaldehit, kültür ortamı ve %1 jelatin çözeltisi hazırlayın. Daha sonra laminar akış başlığı %70 etanol ile temizleyin ve gerekli tüm malzemeleri içine yerleştirin. Paraformaldehit son derece tehlikelidir.Uygun PPE her zaman giyilmelidir, ve sadece kimyasal bir başlık ele alınmalıdır. İstenilen hücreleri %70'e çıkardıktan sonra kuvözden çıkarın ve laminar akış kaputuna yerleştirin. Kültür ortamını çıkarın ve pbs ile hücreleri iki kez durula.Kültür şişesine yaklaşık iki mililitre 0.25% tripsin EDTA ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Müfrezeyi izlemek için hücreleri ters mikroskopta periyodik olarak kontrol edin. Hücreler yavaşça kültür orta 10 mililitre onları resuspend ayırdı, tek bir hücre süspansiyon oluşturmak için dikkatle pipetting.Hücre süspansiyonuna 50 mililitrelik konik bir tüp verin ve 5 dakika boyunca 200 kez G'santrifüj edin. Decant supernatant sonra kültür orta 10 mililitre ekleyin ve yavaşça pelet resuspend. Hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini alın ve bire bir hacim oranında trypan mavisi ile karıştırın.Sonra standart hemositometri kullanarak hücreleri saymak. Altı kuyu plakasının her kuyusunun içine bir kapak fişi yerleştirin ve kapak kaymasına bağlı hücrelere yardımcı olacak iki mililitre jelatin çözeltisi ile kapak fişini kaplayın. Jelatini çıkarın ve plakanın birkaç dakika kurumasına izin verin.Tohum 100, 000 fibroblastlar her kuyuya ve kültür orta iki mililitre ekleyin. Sonra hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece, yüzde beş karbondioksit ve %90 bağıl nemde kuluçkaya yatırın. Kuluçka dan sonra siliasyon indüklemek için hücreleri tedavi.Oda sıcaklığına % 4 paraformaldehit ısıtın ve bir mera pipetleri, ABS, bir atık konteyner, 15 mililitre konik tüpler, mikro pipetler ve ipuçları hazırlayın. Kuvözdeki hücreleri alın ve laboratuar bankına yerleştirin. Her kuyudan ortamı çıkarın ve kapak fişini bırakarak.Hücreleri iki mililitre PBS ile üç kez hafifçe yıkayın. Sonra hücreleri düzeltmek için her kuyuiçine% 4 PFA iki mililitre ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın, ardından PFA'yı çıkarın ve PBS ile yıkarları tekrarlayın.Her kuyuya %0,5 Triton X-100'ün iki mililitresini ekleyin ve tabağı 15 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra pbs ile kuyuları dört kez yıkayın. Engelleme çözeltisi yapmak için, beş dakika boyunca bir keçi serumu eritin ve PBS bir ila 20 oranında seyreltin.Her kapak kayma için bu çözeltinin 150 mikrolitre ekleyin ve 20 dakika boyunca plaka kuluçka. Birincil antikorları beş dakika boyunca eritin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi PBS'de ayrı ayrı seyreltin. Kapak fişlerinden bloke solüsyonu çıkarın ve her iki antikor çözeltisinden 150 mikrolitre ekleyin.Sonra oda sıcaklığında 60 dakika boyunca plaka kuluçka. Birincil antikorları çıkarın ve iki mililitre PBS ile kapağı üç kez hafifçe yıkayın. Seyreltik Cy3 Koyun Anti-Mouse ve Alexa flor 488 Keçi anti-Rabbit PBS, bir ila 300 oranında, ve kapak kayma her iki ikincil antikor çözümleri 150 mikrolitre ekleyin.PBS 50 mililitre stok 10 mikrolitre seyreltme tarafından çalışan bir DAPI çözeltisi hazırlayın ve kapak fişleri için bu seyreltme iki mililitre ekleyin. Tabağı karanlıkta, oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Kapak fişlerini slaytlara yerleştirmeden önce, iki iğne, cımbız ve montaj ortamı hazırlayın ve tüm slaytları etiketlayın.DAPI çözeltisini kuyulardan çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın. Her slayta bir damla montaj ortamı koyun. Kapağı kuyunun dibinden hafifçe kaldırmak için iğneyi kullanın.Sonra çevirin ve yavaşça cımbız kullanarak montaj ortamı damla üzerine yerleştirin. Dikkatlice herhangi bir kabarcıklar kaldırın. Slaytları ışıktan koruyun ve bir gecede dört santigrat derecede saklayın.Ertesi gün primer silya görselleştirmek için yüksek büyütme ile bir floresan veya konfokal mikroskop kullanın. Bu protokol immünleke düzeltmek için kullanılmıştır, ve görüntü çeşitli hücre hatları birincil silya ifade. Fare miyoblastları çeşitli dozlarda iyonlaştırıcı radyasyona maruz kaldığında, daha yüksek dozlarda birden fazla primer silia görünümünü indüklediği bulunmuştur.Düşük dozlarda tek primer silya görünümünü neden iken. Benzer şekilde, insan akciğer fibroblastları düşük dozda yayıldığında, immünoresans tarafından tek primer silya saptandı. Açlıktan ölen fare embriyonik fibroblastlarında primer silyada artış gözlendi ve metabolik stresin primer silya olaylarını etkilediğini gösterdi.Deri fibroblastları 120 nanomolar doksorubisin ile tedavi edildiğinde, tek bir primer cilium ifade. Yüksek dozlarda birden fazla primer silya görünümünü indükler. Fibroblastlar 1.25 nanomolar Taxol ile tedavi de tek bir birincil cilium ifade.Ama birden fazla silya yüksek dozlarda tedaviden sonra tespit edilmedi. Bu protokolü açarken tüm PPE yönetmeliklerine uyun. Seçtiğiniz hücre hattının kültür ihtiyaçlarını unutmayın ve antikorlarınızı dikkatle seçtiniz.Hücreler geri alınamaz olduğundan, bu yordam doğrudan diğer yordamlar tarafından takip edilemez. Bunun yerine, paralel deneyler programlanmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

İlköğretim Doku İki timidin analogları Immunofluorescent Algılama (CldU ve IDU)

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Zymography Fonksiyonel Matrix Metalloproteinazlar Tespiti

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

ELISA yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom Post-translasyonel modifikasyonlar Algılama

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Kupffer en veziküllü Gen Fonksiyonu ve Cilia Oluşturulan Akışkanın Görselleştirme Analizi

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif G protein-eşli reseptör özümseme tespiti

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...