Name: preparation of cell extracts by cryogrinding in an automated freezer mill
Uploaded: 2021-01-29T13:00:00
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군얀 연구소의 연구는 국립 보건 원, 국립 과학 재단 및 플로리다 보건부의 자금 지원을 받고 있습니다. 우리는 기술 지원을 학부 학생 존 파커 감사합니다.

1. 효모 팝콘 준비
<ol><li>YPD 매체의 0.5 L에서 효모 세포를 1 x 107 세포/mL의 밀도로 성장시다. 쿨터 카운터 또는 다른 수단을 사용하여 셀을 계산합니다.</li>
	<li>원심분리기 세포는 2,400g 및 4°C에서 10분 동안.</li>
	<li>각 샘플을 얼음냉이 500mL로 1회 세척하여 18메가 옴 밀리-Q 수로 세척합니다.</li>
	<li>얼음차가운 리시스 버퍼 15mL의 펠릿 재연 [20m HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0.1% 트웬, 10% 글리세롤, ?...

<ol>
	<li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Dunn, B., Wobbe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+protein+extracts+from+yeast.">Preparation of protein extracts from yeast.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li><li>Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+efficient+method+for+isolating+DNA+from+yeast.">A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast.</a> Gene. 42 (2), 169-173 (1986).</li><li>Nandakumar, M. P., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+lysis+methods+and+preparation+protocols+for+one-+and+two-dimensional+electrophoresis+of+Aspergillus+oryzae+intracellular+proteins.">Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins.</a> Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).</li><li>Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+yeast+DNA+extraction+by+boiling+and+freeze-thawing+without+using+chemical+reagents+and+DNA+purification.">Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification.</a> Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).</li><li>Baldwin, C., Robinson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Saccharomyces+cerevisiae+using+enzymatic+lysis+combined+with+high-pressure+homogenization.">Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization.</a> Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+yeast+mitochondrial+DNA+in+high+yield.">Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).</li><li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function,+interactions,+and+post-translational+modifications.">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).</li><li>Bzducha-Wr&#243;bel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficiency+of+different+disruption+methods+on+yeast+cell+wall+preparation+for+&#946;-glucan+isolation.">Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for &#946;-glucan isolation.</a> Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).</li><li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3'+splice+site+selection.">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes &amp; Development. 9 (7), 855-868 (1995).</li><li>Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+to+the+sampling+of+dental+DNA.">A systematic approach to the sampling of dental DNA.</a> Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).</li><li>Sweet, D., Hildebrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+DNA+from+human+teeth+by+cryogenic+grinding.">Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding.</a> Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).</li><li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+of+RNA+isolation+from+loblolly+pine+(P.+taeda+L.)+and+other+conifer+species.">An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1751 (2010).</li><li>Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Cryogenic+Grinding+on+Release+of+Protein+and+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).</li><li>Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+levels+are+regulated+by+phosphorylation+and+ubiquitylation-dependent+proteolysis.">Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).</li><li>Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+dosage+regulates+DNA+damage+sensitivity+in+a+checkpoint-independent+manner+by+the+homologous+recombination+pathway.">Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway.</a> Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).</li><li>Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+E3+ubiquitin+ligases+that+regulate+histone+protein+levels+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (5), 36295 (2012).</li><li>Gunjan, A., Verreault, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rad53+kinase-dependent+surveillance+mechanism+that+regulates+histone+protein+levels+in+S.+cerevisiae.">A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae.</a> Cell. 115 (5), 537-549 (2003).</li><li>Gill, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+remains+of+the+Romanov+family+by+DNA+analysis.">Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis.</a> Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).</li><li>Alain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extractions+from+deep+subseafloor+sediments:+novel+cryogenic-mill-based+procedure+and+comparison+to+existing+protocols.">DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).</li><li>Mohammad, F., Buskirk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+Ribosome+Profiling+in+Bacteria.">Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria.</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3468 (2019).</li><li>Liew, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microRNAs+in+the+coral+Stylophora+pistillata.">Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata.</a> PLoS One. 9 (3), 91101 (2014).</li><li>Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications:+a+comparison+of+yeast+lysis+methods.">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5 (14), (2004).</li><li>Grant, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+plant+cell+walls+with+adsorbed+polyphenols+alter+porcine+faecal+bacterial+communities+during+in+vitro+fermentation.">Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation.</a> Food &amp; Function. 11 (1), 834-845 (2020).</li><li>Lolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenic+grinding+pre-treatment+improves+extraction+efficiency+of+fluoroquinolones+for+HPLC-MS/MS+determination+in+animal+tissue.">Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).</li><li>Santos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Cd+and+Pb+in+food+slurries+by+GFAAS+using+cryogenic+grinding+for+sample+preparation.">Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).</li><li>da Silva, E. G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+method+for+the+determination+of+copper,+manganese+and+iron+in+seafood+samples.">Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).</li><li>Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+preparation+of+hair+slurries+using+cryogenic+grinding+and+water-soluble+tertiary-amines+medium.">A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium.</a> Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).</li><li>Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sr-87/Sr-86+ratios+in+modern+and+fossil+food-webs+of+the+Sterkfontein+Valley:+Implications+for+early+hominid+habitat+preference.">Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference.</a> Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).</li><li>Nielsen-Marsh, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+preservation+of+osteocalcin+protein+and+mitochondrial+DNA+in+bison+bones+older+than+55+ka.">Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka.</a> Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).</li></ol>

효모에서 토착 단백질을 연구하는 한계는 그들의 힘든 세포 벽 때문에 효모 세포의 비효율적인 lysis입니다. 여러 가지 방법이 개발되었지만, 우리 손에 가장 일관되고 효율적인 방법은 팝콘으로 얼어 붙은 효모 세포의 냉동 분쇄입니다. 이 방법은 다른 용해 방법에 비해 신진 효모에서 고품질 전세포 추출물의 신뢰할 수있는 준비를 할 수 있습니다. 대표적인 결과는 저온분쇄가 4°C(도<strong class="xf...

효모는 단백질 연구를 위한 인기 있는 모형 유기체입니다, 연구원을 위해 유효한 유전 및 생화확적인 공구의 풍부를 가진 간단한 진핵 생물이기 때문에1. 그들의 튼튼한 세포 벽 때문에, 연구원이 직면하는 한 가지 도전은 세포 내용을 손상시키지 않고 효율적으로 세포를 lysing에 있습니다. 다른 방법은 효소 용해 (zymolyase)2,3,화학 용해4,동결 해동5, 압력 기반 (프랑스 프레스)6,7,기계 (유리 구슬, 커피 분쇄기)8,9,초음파 기반10 및 cryogenic2,11을포함하는 효모 세포의 중단을 통해 단백질 추출물을 얻을 수 있습니다. 세포 용해및 단백질 수율의 효율은 채택된 기술에 따라 상당히 달라질 수 있으므로 용액에 대한 원하는 다운스트림 적용에 대한 최종 결과 또는 적합성에 영향을 미칩니다. 불안정한 단백질을 연구할 때, 번역 후 잠시 변형이 있거나 온도에 민감하며, 준비하는 동안 시료 손실이나 저하를 최소화하는 방법을 사용하는 것이 특히 중요합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>추출 준비 기술</td>
			<td>세부 정보</td>
			<td>장점</td>
			<td>단점</td>
			<td>다운스트림 분석</td>
			<td>참조</td>
		</tr><tr><td>프랑스 언론: Zymolyase를 사용하여 효소 전처리를 하는 고압 균질화제(일명 미세유체제)</td>
			<td>Zymolyase-20T, 미세 유체화기 고압 균질화제. 파괴기는 공기 구동, 고압 펌프 (비율 1:250; 필요한 기압 0.6-l MPa)와 추가 역압 장치가있는 특수 중단 챔버로 구성됩니다. 처리하려면 최소 샘플 크기가 20mL입니다.</td>
			<td>결합 된 프로토콜을 사용하여 얻은 최종 총 중단은 Zymolyase없이 균질화를 사용하여 95 MPa에서 4 패스로 32 %의 중단과 비교하여 95 MPa의 압력에서 4 패스로 100 %에 접근했습니다.</td>
			<td>소규모 응용 프로그램에는 적합하지 않습니다. 효소는 대규모 준비를 위해 비싸지 않습니다.</td>
			<td>단백질 정제</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>비드 비터 : 빠른 준비 기기에서 유리 구슬로 lysed Zymolyase 처리 된 세포</td>
			<td>대략 감기, 건조, 산 세척 0.5mm 유리 구슬의 동일한 볼륨은 용해 완충제에 있는 세포 펠릿의 주어진 부피에 추가되고 세포는 격렬한 수동 동요에 의해 중단됩니다.</td>
			<td>단백질 정화보다는 의도적으로 많은 다른 작은 효모 배양에서 추출하는 것이 특히 유용합니다.</td>
			<td>유리 비드 시술 동안 단백질은 단백질 성변으로 이어지는 광범위한 발포를 유발하는 가혹하게 치료됩니다. 세포 파손의 양은 다양하지만, 단백질의 프로테오분해뿐만 아니라 변형은 기계적 파손 시 4°C 이상의 추출물의 가열로 인해 발생할 수 있습니다.</td>
			<td>주로 DNA & RNA 분석, 하지만 또한 젤 전기 전화제를 데스팅 하 여 단백질 분석, 또는 서양 얼룩 없이.</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>삼투성 충격과 두드러기 균질화의 조합을 사용하여 용해다음 Zymolyase 치료</td>
			<td>세포벽의 효소 소화 후, 구엽세포는 Dounce 균질화에서 15~20스트로크의 타이트한 유봉(클리어런스 1~ 3 μm)으로 분해됩니다.</td>
			<td>BJ926 또는 EJ101과 같은 프로테이즈 결핍 균주를 사용하는 것이 유리합니다. 이것은 효모 세포를 분해하는 가장 부드러운 방법이며 따라서 복잡한 효소 기능 (예를 들어, 번역, 전사, DNA 복제)을 수행 할 수있는 추출물을 준비하는 데 가장 적합하며 거시 분자 구조 (예 : 리보솜, 스플리솜)의 무결성을 유지해야합니다. 또한 크로마틴 연구(블룸 앤 카본, 1982) 또는 핵 단백질 추출물(Lue and Kornberg, 1987)에 사용할 수 있는 온전한 핵을 분리하는 데도 유용합니다.</td>
			<td>구형 세포 용해 절차의 주요 단점은 상대적으로 지루하고 비싸다는 것입니다, 특히 대규모 제제 (>10 리터), 긴 잠복기간은 proteolysis 또는 단백질 수정으로 이어질 수 있습니다.  크로마틴 제제의 경우, 차동 원심분리에 의해 생성된 품질보다 다양하거나 낮은 품질(뉴클레오터 래더 무결성기준)이 있는 것으로 보입니다.</td>
			<td>크로마틴 연구를 위한 손상되지 않은 핵 분리, 복잡한 효소 기능을 수행할 수 있는 추출물, 의 무결성을 요구하는 추출물 거대 분자 구조, 핵 단백질 추출물.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>박격포/유봉 또는 블렌더를 사용하여 액체 질소에서 분쇄하여 플래시 냉동 세포의 세포 중단</td>
			<td>세포는 액체 질소에서 즉시 동결된 다음 유봉을 사용하여 모르타르에서 수동으로 연마하거나 액체 질소가 있는 동안 워링 블렌더를 사용하여 용액을 제거합니다.</td>
			<td>프로토콜은 빠르고 쉽습니다. 그것은 매우 큰 배양을 포함하여 효모 세포의 다양한 양을 수용할 수 있습니다. 그것의 주요 장점은 세포가 액체 질소로 적극적으로 성장하는 상태에서 즉시 취한다는 것입니다 (−196°C), 단백질을 수정하는 활동뿐만 아니라 프로테아제와 뉴클레아제와 같은 분해 효소 활동뿐만 아니라 단백질 (예를 들어, 인산염 및 키나아제). 그것은 대규모 단백질 정제를 위한 단 하나 효모 배양에서 전세포 추출물을 만들기에 특히 적합합니다.</td>
			<td>조금 지저분하고 부주의 한 수사관에게 잠재적으로 위험합니다. 작은 샘플(즉, 10-100ml 효모 배양)은 블렌더에서 효과적으로 골절할 수 있는 냉동 세포 덩어리의 질량이 충분하지 않기 때문에 쉽게 처리되지 않습니다. 개별 샘플을 처리하고 사용 사이의 장비를 청소하는 데 시간이 많이 걸립니다.</td>
			<td>대규모 단백질 정제를 위한 단일 효모 배양에서 온전세포 추출물.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>자동 분리, 비드 밀</td>
			<td>pH 5.0, 50°C, 24시간, 200rpm/Ø 0.5mm, 5× 3분/3분</td>
			<td>특히 소규모 추출물 준비를 위한 빠르고 효율적인 용해</td>
			<td>열 생성은 거대 분자의 분해 및 저하로 이어집니다. 비드 구타 장비가 필요합니다.</td>
			<td>소규모 분석.</td>
			<td rowspan="2">10</td>
		</tr><tr><td>자동 변기, 초음파 처리</td>
			<td>pH 5.0, 50°C, 24시간, 200rpm, 4× 5분/2분, 펄스80%, 파워 80%</td>
			<td>초음파 처리 장비는 일반적으로 대부분의 기관에서 사용할 수 있습니다.</td>
			<td>열 생성은 거대 분자의 분해 및 저하로 이어집니다. 초음파 장치 필요. 느린 리시스는 24 시간 이상 걸릴 수 있습니다.</td>
			<td>효모 세포 벽 준비.</td>
		</tr><tr><td>끓는 및 동결 해동 공정</td>
			<td>표준 냉동고와 난방 블록 또는 온수 욕조 이외에는 특수 장비가 필요하지 않습니다.</td>
			<td>효율적이고, 재현 가능하며, 간단하고 저렴합니다.</td>
			<td>열 생성은 거대 분자의 분해 및 저하로 이어집니다.</td>
			<td>PCR에 의한 DNA 분석.</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 효모 추출물의 제조에 사용할 수 있는 방법의 비교.
극저온 분쇄(일명 극저온 분쇄/극저온 밀링)는 일반적으로 정량적 또는 질적 분석을 위해 신뢰할 수 있는 방식으로 온도에 민감한 샘플에서 핵산, 단백질 또는 화학 물질을 회수하는 데 사용됩니다. 생명 공학, 독물학, 법의학12,13,환경 과학, 식물 생물학14 및 식품 과학을 포함한 다양한 분야에서 여러 응용 분야에 성공적으로 사용되었습니다. 손상되지 않은 생물학적 거대 분자의 격리는 일반적으로 온도에 매우 의존합니다. 극히 낮은 온도로 프로테아제와 뉴클레아제가 비활성 상태를 유지하여 후속 분석을 위해 손상되지 않은 단백질, 핵산 및 기타 거대 분자를 안정적으로 분리합니다. 실제로, 냉동고 공장은 전형적으로 -196°C(LN2의비등점)의 시료 온도를 유지하므로 DNA/RNA 또는 단백질 분해 및 분해를 최소화한다.
냉동고 공장은 스테인레스 스틸 엔드 플러그 사이에 분쇄될 시료를 포함하는 유리병 내에서 고체 금속 막대 또는 실린더를 앞뒤로 빠르게 이동하는 전자기 분쇄 챔버를 사용합니다. 계측기는 연삭 챔버 내에서 자기장을 생성하고 빠르게 반전시깁니다. 자기장이 앞뒤로 이동함에 따라 자석은 플러그에 대한 샘플을 분쇄하여 '냉동 분쇄'와 팝콘의 분쇄를 달성합니다. 냉동고 밀은 모르타르와 유봉을 대체하고 여러 샘플(또는 최대 4개의 작은 샘플)을 높은 재현성으로 순차적으로 처리할 수 있게 해주며 수동 연삭과 관련된 사용자 간 가변성을 방지합니다. 샘플이 처리되면 셀 추출물을 다양한 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL polycarbonate tubes with screw caps</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357002</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosiences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Yeast YPD media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosiences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Yeast YPD media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Avanti centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B38624</td>
			<td>High speed centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA-9.1000</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>366754</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Dextrose Anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>901521</td>
			<td>Yeast YPD media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf A-4-44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22637461</td>
			<td>Swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5150-1GA</td>
			<td>Volume excluder and cryoprotectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>FisherBiotech</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS6 antibody</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70796</td>
			<td>Antibody for HIS tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td>Salt for maintaining ionic strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG-132</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>474790</td>
			<td>Proteasome Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P7170-1L</td>
			<td>Protein Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor JLA 25.500</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>JLA 25.500</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate</td>
			<td>EM Science</td>
			<td>BX2165-1</td>
			<td>Histone Deacetylase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6521</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Vanadate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>159664</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium &#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13408-09-8</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex Certiprep 6850 freezer mill</td>
			<td>SPEX Sample Prep</td>
			<td>6850</td>
			<td>Freezer Mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td>BD Biosiences</td>
			<td>635502</td>
			<td>For pulling down HIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>VW1521-07</td>
			<td>Non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>M131-250ML</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cell extracts by cryogrinding in an automated freezer mill

유전자 조작의 용이성과 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae에서 진핵 세포 기계의 강한 진화 적 보존은 저명한 유전 모델 유기체를 만들었습니다. 그러나 효율적인 단백질 절연은 세포의 최적의 중단에 달려 있기 때문에 세포 단백질의 생화학 적 분석을위한 효모의 사용은 효소적으로 소화하는 데 비용이 많이 드는 세포 벽 (lyticase 또는 zymolyase 사용)에 의해 방해되며, 기계적으로 중단하기 어렵고 (전통적인 비터, 프랑스 프레스 또는 커피 분쇄기를 사용하여) 시료의 가열을 유발하지 않고 단백질 분해를 유발합니다. 모르타르와 유봉을 사용하여 액체 질소 (LN2)에서효모 세포의 수동 연삭은 시료의 과열을 방지하지만, 작업자 사이의 세포 용해의 가변성에 따라 노동 집약적이며 변동이 적용됩니다. 수년 동안 우리는 자동화된 냉동고 공장에서 세포의 극저온 분쇄를 사용하여 고품질 효모 추출물을 성공적으로 준비해 왔습니다. LN2의 사용으로 달성된 -196°C의 온도는 프로테아제 및 뉴클레아제에 의한 분해로부터 생물학적 물질을 보호하여 그대로 단백질, 핵산 및 기타 거대 분자의 회수를 허용합니다. 여기서 우리는 "팝콘"으로 알려진 세포의 냉동 액적을 생성하기 위해 LN2에 드롭 와이즈 추가를 통해 처음으로 리시스 버퍼에서 세포의 현탁액을 동결 포함 신진 효모 세포를 위해 자세히이 기술을 설명합니다. 이 팝콘은 냉동고 밀에서 LN2 에서 분쇄되어 천천히 해동되고 원심분리에 의해 명확히 하여 불용성 이물질을 제거합니다. 결과 추출물은 단백질 또는 핵산 정제, 프로테오믹 분석 또는 공동 면역 침전 연구와 같은 다운스트림 응용 분야에 대한 준비가 되어 있습니다. 이 기술은 다양한 미생물, 식물 및 동물 조직, 산호를 포함한 해양 표본뿐만 아니라 법의학 및 퍼머 프로스트 화석 표본에서 DNA / RNA를 분리하는 세포 추출물 준비에 널리 적용됩니다.

효모 세포 용해, 즉 유리 비드 밀링에 대한 두 가지 다른 방법, 즉 4°C에서 유리 비드 밀링 및 -196°C의 자동 냉동 분쇄 방법을 비교하여 두 가지 방법으로 제조된 세포 추출물의 상대적 회수 단백질을 평가하였다. 이 연구를 위해, 우리는 신진 효모 균주 YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2:ura3 ubi3-Δ2:ura3 ubi3-Δub-2.2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB221]) 16 [pUB221])...

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Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

우리는 단백질의 분해 및 분해를 최소화하는 극저온 냉동고 밀을 사용하여 효모 또는 다른 세포에서 온전세포 추출물의 제조를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 세포 추출물은 기능성 단백질 복합체의 정화, 프로테오믹 분석, 공동 면역 침전 연구 및 음순 단백질 수정의 검출에 적합합니다.

자동 냉동고 밀에서 냉동 분쇄에 의한 세포 추출물 준비

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

효모는 유전 연구뿐만 아니라 야생 유형 및 돌연변이 효모 균주에서 추출 한 단백질 및 기타 거대 분자의 생화학 연구를위한 인기있는 모델 유기체입니다. 그러나, 그들의 힘든 세포 벽 때문에, 연구원이 직면 하는 주요 도전은 세포 콘텐츠를 손상 하지 않고 효 모 세포의이 효율적인 lysis. 그대로 생물학적 거대 분자의 분리는 일반적으로 온도에 따라 중요합니다.저온에서 추출물을 준비하면 세포내 프로테아제와 뉴클레아제가 비활성 상태로 유지되어 충분한 용액을 위한 그대로 단백질, 핵산 및 기타 거대 분자의 신뢰할 수 있는 절연이 발생합니다. 효소, 화학 적 및 물리적 용액을 통해 효모 추출물을 얻기위한 다양한 방법이 있습니다. 그러나 효소 용해는 세포벽을 소화하기 위해 정제 효소의 요구 사항으로 인해 비용이 많이 들므로 적은 수의 세포의 사용을 제한합니다.또한 효소 반응은 세포의 소화와 조기 용액을 방지하기 위해 밀접하게 모니터링되어야합니다. 강력한 데진제를 사용하는 화학적 방법은 효과적이지만 단백질의 변성 등의 결과를 초래하며, 단백질 복합체 또는 기능성 효소의 분리에 적합하지 않다. 프랑스 프레스에서 고압하에서 리시스와 같은 물리적 방법은 4섭씨에서 추위속에서 수행될 수 있지만 모든 토착 단백질의 분해및 분해를 방지할 만큼 춥지 않습니다.다른 인기있는 물리적 방법은 용해 버퍼에서 다시 중단 효모 세포를 분쇄하고 물방울또는 연삭 및 빠른 준비 비터 밀 또는 초음파 처리에 의한 용해로 유리 구슬과 효모의 혼합물로 냉동하는 박격포와 유봉, 믹서기 또는 커피 분쇄기의 사용입니다. 그러나 수동 연삭은 노동 집약적이며, 그 결과 단백질 수율은 블렌더, 커피 분쇄기 또는 비드 비터 밀에서 초음파 처리 또는 연삭에 의해 용해하면서 사용되는 기술에 따라 상당히 달라질 수 있으며, 이는 단백질 분해 및 저하를 초래한다. 따라서, 기능성 단백질 복합체의 정화, 생화학적 작용 제의 또는 짧은 번역 후 수정의 검출과 같은 응용분야에 대한 최소한의 분해와 함께 자국 에서 단백질로 효모 세포 용액을 얻으려면, 세포 수량에 관계없이 효율적인 라이시스를 허용하면서 열 생성을 최소화할 수 있는 확장가능한 용해 방법을 사용하는 것이 필수적이다.여기서 우리는 동결된 세포 추출물을 생성하는 영하 196섭에서 액체 질소에 있는 세포의 용해에 대한 냉동고 밀을 사용하여 단백질이나 DNA 및 RNA와 같은 온전한 기능성 거대 분자의 회복을 허용하는 방법을 설명하며, 이는 매우 낮은 온도에서 분해 및 분해를 최소화합니다. 이 방법은 법의학 및 고대 샘플을 포함하여 모든 종에서 모든 유형의 세포 또는 조직 샘플과 함께 사용하기 위해 쉽게 적응 할 수 있습니다 고고학 유적지에서 회수되거나 퍼머 프로스트에서 얼어 붙은 것으로 나타났습니다. 냉동고 공장은 스테인레스 스틸 엔드 플러그 사이에 분쇄될 샘플을 포함하는 폴리카보네이트 파일 내에서 고체 금속 막대를 앞뒤로 빠르게 이동하는 초전도 전자기 분쇄 챔버를 사용합니다.이 물리적 셀 용해 방법은 보다 효율적인 용해를 허용하고 재현적으로 더 나은 품질의 추출물을 초래합니다. 효모 세포는 밀 당 1천만 개의 세포 농도로 성장하였다. 이러한 효모 세포는 미리 차가운 원심분리기 병을 배치하고 스핀이 완료되면 2, 400 G.에서 10 분 동안 회전하여 펠릿 세포를 방해하지 않고 상류제를 데칭하였다.이 펠릿은 소량의 얼음 차가운 물로 재중단되었으며, 세포를 세척하기 위해 배양의 초기 부피의 약 절반정도가 재주중단되었다. 다시 중단 된 세포는 다시 2, 400 G.에서 또 다른 10 분 동안 회전했다. 이 펠릿은 다시 중단되고 얼음 차가운 리시스 버퍼 15 ML이 됩니다.펠릿이 완전히 다시 중단되었는지 확인합니다. 다시 중단된 세포는 다음 단계를 준비할 때까지 미리 표시된 튜브의 얼음 위에 남아 있어야 합니다. 안전 안경, 손 보호 및 실험실 코트와 같은 액체 질소를 취급할 때 항상 개인 보호 장비를 착용하십시오.손재주를 극대화하기 위해 두 쌍의 니트릴 장갑 사이에 끼워진 흰색 열 장갑을 착용하는 경우가 많습니다. 액체 질소에 노출된 후 쉽게 찢어지면서 외부 및 니트릴 장갑을 자주 교체합니다. 우리의 실험실에서, 우리는 작은 5 리터 액체 질소 용기에 액체 질소의 알리쿼트전송.액체 질소는 드라이 아이스에 미리 냉각 된 50 ML 튜브에 부어. 50 ML 튜브가 액체 질소로 가득 차면 효모 추출물을 천천히 추가하여 1.5 밀리리터 단위로 튜브에 현명한 방식으로 떨어뜨립니다. 대형 팝콘 펠릿의 형성을 최소화하기 위해 효모 서스펜션이 원형 동작으로 추가됩니다.대형 팝콘 펠릿의 형성을 더욱 막기 위해 대형 포셉을 사용하여 모든 펠릿이 직경 0.3~0.5cm 사이인지 확인합니다. 액체 질소는 항상 증발하기 때문에 효모 현탁액의 각 1.5 mil 알리쿼트를 추가하기 전에 액체 질소로 튜브를 다시 채웁니다. 모든 효모 현탁액이 팝콘으로 만들어지면 팝콘이있는 튜브가 2 ~ 3 분 동안 뚜껑없이 앉을 수 있어 잔류 액체 질소가 모두 증발하게합니다.모든 액체 질소가 증발했는지 확인하려면 뚜껑을 거의 완전히 닫고 부드럽게 흔들어 주세요. 히싱 노이즈가 있는 경우 액체 질소가 아직 완전히 증발하지 않았다는 것을 나타냅니다. 뚜껑을 단단히 닫기 전에 나머지 액체 질소가 증발할 수 있도록 뚜껑을 1분 정도 열어 주세요.뚜껑이 조기에 닫히면 튜브내 잔류 액체가 폭발을 일으킬 수 있습니다. 이 효모 팝콘은 영하 80도 C.에 거의 무기한 저장될 수 있습니다.적어도 5개의 샘플의 경우 30~35리터의 액체 질소를 사용할 수 있는지 확인합니다. 냉동고 밀을 전체 선으로 채우고 뚜껑을 닫아 냉동실 공장이 몇 분 동안 식기를 미리 식힐 수 있도록 하십시오.다시 말하지만, 액체 질소를 다룰 때 항상 개인 보호 장비를 착용해야합니다. 폴리카보네이트 연삭 바이알, 스테인리스 스틸 엔드 플러그 및 임펙터 바는 액체 질소로 미리 냉각되어야 합니다. 액체 질소가 버블링을 멈출 때까지 이러한 성분을 물에 담그십시오.전체 연삭 과정이 완료 될 때까지 드라이 아이스에 모든 팝콘 샘플을 유지하는 것을 기억하십시오. 연삭 바이알에서 모든 액체 질소를 꺼내 서 유리병에 팝콘을 전송. 연삭 바이알에도 마그네틱 임펙터 바를 배치하는 것을 잊지 마십시오.스테인레스 스틸 플러그를 연삭 유리병 끝에 고르게 배치하여 연삭 유리알을 밀봉하십시오. 우리는 최종 플러그가 올바르게 배치되고 연삭 유리병을 단단히 밀봉하는 것을 보장하기 위해 진동 흡수 고무 백업나무 브레드 보드에 연삭 유리병의 각 끝을 강타합니다. 엔드 플러그를 고정하여 플러그가 느슨해지지 않도록 하고 분쇄 과정에서 샘플이 냉동고 공장에서 유출되도록 하는 것이 중요합니다.냉동실 분쇄실에 연삭 유리병을 놓고 제자리에 고정하십시오. 냉동고 밀 뚜껑을 닫고 14의 분쇄 속도로 사이클 당 2 분에서 3 사이클로 샘플을 갈아. 분쇄 주기가 완료 된 후 냉동 분말 셀 lysate와 유리병의 잠금을 해제합니다.용해가 해동되지 않도록 하려면 개구부 도구를 사용하여 최종 플러그 중 하나를 풀기 위해 신속하고 신중하게 작업하십시오. 바이알이 열리면 임펙터 바를 제거하고 냉동 분말 추출물을 미리 차가운 플라스틱 계량 접시에 신속하게 전달합니다. 나무 빵보드에 유리병을 두드리며 가능한 한 많이 냉동 추출물을 회수합니다.모든 분말이 유리병에서 제거되면 모든 분말 추출물을 미리 라벨이 부착된 15밀 튜브로 빠르게 전달하여 드라이 아이스에 보관합니다. 단백질 분해를 최소화하기 위해 즉시 추출물을 해동하고 사용하는 것이 가장 좋습니다만, 냉동 분말 용액은 필요한 경우 영하 80에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다. 얼음 양동이에 마그네틱 교반 바를 사용하여 지속적으로 순환되는 얼음 슬러리에서 분말 을 천천히 해동하십시오.해동을 용이하게 하기 위해 튜브 바깥쪽에서 자주 발생하는 얼음을 약 5분마다 제거합니다. 일단 추출물이 단백질 분해를 방지하기 위해 1X 프로테아제 억제제 칵테일과 10 마이크로몰라 프로테모솜 억제제 MG132에서 해동하기 시작합니다. 샘플이 완전히 해동되면 1 시간 이상 걸릴 수 있으며 샘플을 섭씨 4도에서 20 분 동안 3, 220 G로 회전하십시오.이 스핀은 lysate에서 세포 파편의 대부분을 제거합니다. 스핀이 완료되면 상체를 얼음에 미리 냉각된 폴리 카보네이트 병으로 옮기고 펠릿을 폐기합니다. 16, 000 G에서 16, 000 G에서 20분 동안 초판 및 샘플을 원심분리하여 추출물을 명확히 합니다.스핀이 완료된 후, 원심분리기 튜브 의 하단에 있는 조각이나 펠렛 이물질을 포함하는 흐린 층을 방해하지 않고 액체 컬럼 의 중간에서 명확한 상체만 조심스럽게 복구하십시오. 맑은 리세이트를 신선한 사전 냉장 15 밀 튜브로 옮춥니다. 나머지 흐린 액체는 최근 5 분 동안 동일한 속도로 리퓨징되어 일부 도매 용액을 회수 할 수 있습니다.추출물은 이제 단백질 복합체의 정제 및 면역 강수량과 같은 실험에 사용할 준비가 되었습니다. 우리는 효모 세포 리시스의 두 가지 다른 방법, 즉 유리 비드 밀링 4 섭씨에서 및 마이너스 196 섭씨에서 자동화 된 냉동 분쇄 방법을 비교하여 두 가지 방법으로 제조 된 상대적 회수 된 단백질과 세포 추출물을 평가했습니다. 이 연구에서 우리는 함께 HIS-MYC 태그 유비퀴틴을 표현하는 높은 복사 플라스미드를 들고 신진 효모 변형을 사용하기로 결정했습니다.그래서 우리는 탈론 코발트 HIS 태그 선호도 구슬을 사용하여 친화 정화에 따라 도매 추출물에서 태그된 폴리비비퀴티네이트 단백질의 회복의 선호도를 평가할 수 있으며, 그 다음으로 모노클론 HIS 태그 항체로 서양 블로팅을 할 수 있습니다. 일반적으로 유비퀴틴 프로테솜 기계에 의한 급속한 분해로 인해 매우 수명이 짧은 폴리비비쿼터트 단백질은 다른 방법으로 제조된 도매 추출물의 품질을 비교할 수 있는 아주 좋은 방법을 제공합니다. 우리는 Ponceau 스테인드 멤브레인 막의 오른쪽 절반에 의해 볼 수 있듯이, 우리는 도매 추출물 차선 을 통해 더 집중적인 Ponceau 염색에 의해 판단으로 냉동고 밀 프로토콜에 의해 제조 된 도매 추출물에서 더 높은 총 단백질 수율을 회복.이것은 냉동고 공장 전체 추출물 차선의 하부 및 상부에서 특히 분명합니다. 또한, HIS 태그 서양 얼룩의 오른쪽 절반에 의해 표시된 바와 같이, 우리는 동결 연삭에 의해 제조 된 도매 추출물에서 탈론 구슬을 사용하여 아래로 당겨 다음 HIS-MYC 태그 유비쿼터트 단백질의 더 나은 회복을 관찰했다. 우리는 극저온 냉동고 공장이 특히 다운스트림 적용을 위해 기능성 거대 분자가 필요한 경우 세포 추출물의 제조를 위한 다른 방법보다 우수하다는 결론을 내립니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

흩뿌려진의 제목 셀 캡슐화

연구

생물학

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Xenopus laevis 에그의 작성과 분류는 압축을 풉니다

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Fractionated Xenopus 에그 추출물을 사용하여 체외 핵 어셈블리

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

시토크롬의 세포질 Microinjection 의한 Apoptosis의 활성화 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

유전자 표현 기계의 기능 Assays을위한 소규모 핵 추출물

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

본래 식물을 표백제로 또는 추출물의 열처리에 의한 담배 숙주 세포 단백질 제거 방법의 비교

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

자동 이미징 시스템을 사용한 iPSC의 합류점 측정.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...