Name: preparation of cell extracts by cryogrinding in an automated freezer mill
Uploaded: 2021-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill at JoVE.com

A pesquisa no laboratório Gunjan é apoiada por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde, Fundação Nacional de Ciência e do Departamento de Saúde da Flórida. Agradecemos ao estudante de graduação John Parker pela assistência técnica.

1. Preparação de Pipoca de Levedura
<ol><li>Cultivar células de levedura em 0,5 L de mídia YPD a uma densidade de 1 x 107 células/mL. Conte células usando um Contador Coulter ou qualquer outro meio.</li>
	<li>Centrífugas por 10 min a 2.400 g e 4 °C.</li>
	<li>Lave cada amostra uma vez com 500 mL de água desionizada de gelo 18 mega Ohm Milli-Q.</li>
	<li>Pelotas resuspend em 15 mL de tampão de lyse gelado [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glicerol, com agente redutor recém-adicio...

<ol>
	<li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Dunn, B., Wobbe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+protein+extracts+from+yeast.">Preparation of protein extracts from yeast.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li><li>Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+efficient+method+for+isolating+DNA+from+yeast.">A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast.</a> Gene. 42 (2), 169-173 (1986).</li><li>Nandakumar, M. P., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+lysis+methods+and+preparation+protocols+for+one-+and+two-dimensional+electrophoresis+of+Aspergillus+oryzae+intracellular+proteins.">Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins.</a> Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).</li><li>Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+yeast+DNA+extraction+by+boiling+and+freeze-thawing+without+using+chemical+reagents+and+DNA+purification.">Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification.</a> Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).</li><li>Baldwin, C., Robinson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Saccharomyces+cerevisiae+using+enzymatic+lysis+combined+with+high-pressure+homogenization.">Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization.</a> Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. 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(80), e50921 (2013).</li><li>Bzducha-Wr&#243;bel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficiency+of+different+disruption+methods+on+yeast+cell+wall+preparation+for+&#946;-glucan+isolation.">Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for &#946;-glucan isolation.</a> Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).</li><li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3'+splice+site+selection.">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes &amp; Development. 9 (7), 855-868 (1995).</li><li>Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+of+RNA+isolation+from+loblolly+pine+(P.+taeda+L.)+and+other+conifer+species.">An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1751 (2010).</li><li>Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Cryogenic+Grinding+on+Release+of+Protein+and+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).</li><li>Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+levels+are+regulated+by+phosphorylation+and+ubiquitylation-dependent+proteolysis.">Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).</li><li>Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+dosage+regulates+DNA+damage+sensitivity+in+a+checkpoint-independent+manner+by+the+homologous+recombination+pathway.">Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway.</a> Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).</li><li>Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+E3+ubiquitin+ligases+that+regulate+histone+protein+levels+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (5), 36295 (2012).</li><li>Gunjan, A., Verreault, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rad53+kinase-dependent+surveillance+mechanism+that+regulates+histone+protein+levels+in+S.+cerevisiae.">A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae.</a> Cell. 115 (5), 537-549 (2003).</li><li>Gill, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+remains+of+the+Romanov+family+by+DNA+analysis.">Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis.</a> Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).</li><li>Alain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extractions+from+deep+subseafloor+sediments:+novel+cryogenic-mill-based+procedure+and+comparison+to+existing+protocols.">DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).</li><li>Mohammad, F., Buskirk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+Ribosome+Profiling+in+Bacteria.">Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria.</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3468 (2019).</li><li>Liew, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microRNAs+in+the+coral+Stylophora+pistillata.">Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata.</a> PLoS One. 9 (3), 91101 (2014).</li><li>Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications:+a+comparison+of+yeast+lysis+methods.">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5 (14), (2004).</li><li>Grant, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+plant+cell+walls+with+adsorbed+polyphenols+alter+porcine+faecal+bacterial+communities+during+in+vitro+fermentation.">Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation.</a> Food &amp; Function. 11 (1), 834-845 (2020).</li><li>Lolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenic+grinding+pre-treatment+improves+extraction+efficiency+of+fluoroquinolones+for+HPLC-MS/MS+determination+in+animal+tissue.">Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).</li><li>Santos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Cd+and+Pb+in+food+slurries+by+GFAAS+using+cryogenic+grinding+for+sample+preparation.">Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).</li><li>da Silva, E. G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+method+for+the+determination+of+copper,+manganese+and+iron+in+seafood+samples.">Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).</li><li>Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+preparation+of+hair+slurries+using+cryogenic+grinding+and+water-soluble+tertiary-amines+medium.">A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium.</a> Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).</li><li>Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sr-87/Sr-86+ratios+in+modern+and+fossil+food-webs+of+the+Sterkfontein+Valley:+Implications+for+early+hominid+habitat+preference.">Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference.</a> Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).</li><li>Nielsen-Marsh, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+preservation+of+osteocalcin+protein+and+mitochondrial+DNA+in+bison+bones+older+than+55+ka.">Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka.</a> Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).</li></ol>

Uma limitação de estudar proteínas nativas a partir de levedura é a lise ineficiente das células de levedura devido à sua parede celular resistente. Embora vários métodos tenham sido desenvolvidos, o método mais consistente e eficiente em nossas mãos é o criogrinding de células de leveduras flash congelado como pipoca. Este método permite a preparação confiável de extratos celulares inteiros de alta qualidade de levedura brotante em comparação com outros métodos de lise. Os resultados representativos d...

A levedura é um organismo modelo popular para estudos de proteínas, pois é um simples organismo eucariótico com abundância de ferramentas genéticas e bioquímicas disponíveis para pesquisadores1. Por causa de sua parede celular resistente, um desafio que os pesquisadores enfrentam é desaformar as células sem danificar o conteúdo celular. Diferentes métodos estão disponíveis para a obtenção de extratos proteicos através da interrupção de células de levedura que incluem lise enzimática (zymolyase)2,3, lise química4, lise física por congelamento5,à base de pressão (imprensa francesa)6,7, mecânica (contas de vidro, moedor de café)8,9, baseado em sônicação10 e criogênico2,11. A eficiência da lise celular e o rendimento da proteína podem variar consideravelmente dependendo da técnica empregada, afetando assim o resultado final ou a adequação para a aplicação a jusante desejada para o lise. Ao estudar proteínas instáveis, ter modificações pós-transacionais fugazes ou sensíveis à temperatura, é particularmente importante usar um método que minimize a perda ou a degradação da amostra durante a preparação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Técnica de preparação de extrato</td>
			<td>Detalhes</td>
			<td>Vantagens</td>
			<td>Desvantagens</td>
			<td>Análise a jusante</td>
			<td>Referência</td>
		</tr><tr><td>Imprensa francesa: Homogeneizador de alta pressão (também conhecido como Microfluidizer) com pré-tratamento enzimático usando Zymolyase</td>
			<td>Zymolyase-20T, um homogeneizador de alta pressão microfluidizador. O disruptor consiste em uma bomba de alta pressão acionada a ar (razão 1:250; pressão de ar necessária 0,6-l MPa) e uma câmara de interrupção especial com uma unidade de pressão traseira adicional. É necessário um tamanho amostral mínimo de 20 mL para o processamento.</td>
			<td>A interrupção total final obtida usando o protocolo combinado aproximou-se de 100 % com 4 passes a uma pressão de 95 MPa, em comparação com apenas 32 % de interrupção com 4 passes a 95 MPa usando apenas homogeneização sem o Zymolyase.</td>
			<td>Não é apropriado para aplicações em pequena escala. As enzimas podem ficar caras para preparações em grande escala.</td>
			<td>Purificação de proteínas</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Batedor de contas: células tratadas com zymolyase com contas de vidro em um instrumento fastprep</td>
			<td>Aproximadamente um volume igual de contas de vidro frias, secas e lavadas com ácido é adicionado a um determinado volume de pelotas de célula no tampão de lise e as células são interrompidas por uma agitação manual vigorosa.</td>
			<td>É particularmente útil ao fazer extratos de muitas culturas de leveduras pequenas diferentes para fins de ensaio, em vez de para purificação de proteínas.</td>
			<td>Durante o procedimento das contas de vidro, as proteínas são tratadas severamente causando espuma extensiva levando à desnaturação proteica. A quantidade de quebra celular varia, enquanto a proteólise, bem como a modificação das proteínas podem resultar do aquecimento do extrato acima de 4°C durante a quebra mecânica.</td>
			<td>Principalmente análises de DNA e RNA, mas também análises de proteínas por eletrofiorese de gel desnaturing, com ou sem manchas ocidentais.</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>Tratamento zymolyase seguido de lise usando uma combinação de choque osmótico e homogeneização do Dounce</td>
			<td>Após a digestão enzimática das paredes celulares, os esferoplastos são líssedos com 15 a 20 traçados de um pilão apertado (folga de 1 a 3 μm) em um homogeneizador do Dounce.</td>
			<td>Vantajoso para o uso de cepas deficientes protease, como BJ926 ou EJ101. Esta é a maneira mais suave de quebrar células de levedura e, portanto, é mais adequada para o preparo de extratos que podem realizar funções enzimáticas complexas (por exemplo, tradução, transcrição, replicação de DNA) e em que a integridade das estruturas macromoleculares (por exemplo, ribossomos, emendas) deve ser mantida. Também é útil para isolar núcleos intactos que podem ser usados para estudos de cromatina (Bloom and Carbon, 1982) ou para extratos de proteína nuclear (Lue e Kornberg, 1987).</td>
			<td>As principais desvantagens do procedimento de lise esferoplastia são que ele é relativamente tedioso e caro, especialmente para preparações em larga escala (>10 litros), e os longos períodos de incubação podem levar à proteólise ou modificação de proteínas.  Para as preparações de cromatina, elas parecem ser de qualidade variada ou inferior às produzidas pela centrifugação diferencial (baseada na integridade da escada nucleossomo).</td>
			<td>Isolando núcleos intactos para estudos de cromatina, extratos que podem realizar funções enzimáticas complexas, extratos que requerem a integridade de estruturas macromoleculares, extratos de proteínanuclear.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Interrupção celular de células congeladas flash moendo em nitrogênio líquido usando uma argamassa/pilão ou um liquidificador</td>
			<td>As células são congeladas imediatamente em nitrogênio líquido e depois líricas moendo manualmente em uma argamassa usando um pilão, ou usando um liquidificador Waring na presença de nitrogênio líquido.</td>
			<td>O protocolo é rápido e fácil. Pode acomodar quantidades variadas de células de levedura, incluindo culturas muito grandes. Sua principal vantagem é que as células são imediatamente retiradas do estado de crescimento ativo em nitrogênio líquido (−196°C), diminuindo as atividades de enzimas degradativas, como proteases e nucleases, bem como atividades que modificam proteínas (por exemplo, fosfates e quinases). É particularmente adequado para fazer extratos de células inteiras a partir de uma única cultura de levedura para purificação de proteínas em larga escala.</td>
			<td>Um pouco confuso e potencialmente perigoso para o investigador descuidado. Pequenas amostras (ou seja, culturas de levedura de 10 a 100 ml) não são facilmente processadas porque não há massa suficiente de aglomerados de células congeladas para fraturar efetivamente no liquidificador. É demorado processar amostras individuais e limpar o equipamento entre os usos.</td>
			<td>Extratos de células inteiras de uma única cultura de levedura para purificação de proteínas em larga escala.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Autolise, fábrica de contas</td>
			<td>pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min</td>
			<td>Lise rápida e eficiente, especialmente para preparação de extratos em pequena escala</td>
			<td>A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas. Equipamento de espancamento de contas necessário.</td>
			<td>Análises em pequena escala.</td>
			<td rowspan="2">10</td>
		</tr><tr><td>Autolise, Sonicação</td>
			<td>pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, potência 80%</td>
			<td>Os equipamentos de sonicação geralmente estão disponíveis na maioria das instituições.</td>
			<td>A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas. Equipamento de sonicação necessário. A lise lenta pode levar mais de 24 horas.</td>
			<td>Preparações da parede celular de levedura.</td>
		</tr><tr><td>Processo de ebulição e congelamento</td>
			<td>Nenhum equipamento especializado é necessário além de um freezer padrão e um bloco de aquecimento ou banho de água quente.</td>
			<td>Eficiente, reprodutível, simples e barato.</td>
			<td>A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas.</td>
			<td>Análises de DNA por PCR.</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Comparação dos métodos disponíveis para a preparação de extratos de levedura.
A criogrinding (também conhecida como moagem criogênica/moagem criogênica) é comumente empregada para recuperar ácidos nucleicos, proteínas ou produtos químicos de amostras sensíveis à temperatura de forma confiável para análises quantitativas ou qualitativas. Tem sido usado com sucesso para múltiplas aplicações em diversas áreas, incluindo biotecnologia, toxicologia, ciência forense12,13, ciência ambiental, biologia vegetal14 e ciência de alimentos. O isolamento de macromoléculas biológicas intactas é geralmente criticamente dependente da temperatura. Temperaturas extremamente baixas garantem que as proteases e núcleos permaneçam inativos, resultando em um isolamento confiável de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas para análises subsequentes. De fato, um moinho de congelador normalmente mantém uma temperatura amostral de -196 °C (o ponto de ebulição da LN2), minimizando assim o DNA/RNA ou desnaturação e degradação de proteínas.
A fábrica de congeladores emprega uma câmara de moagem eletromagnética que move rapidamente uma barra de metal sólido ou cilindro para frente e para trás dentro de um frasco contendo a amostra a ser pulverizada entre plugues finais de aço inoxidável. O instrumento cria e rapidamente inverte um campo magnético dentro da câmara de moagem. À medida que o campo magnético muda para frente e para trás, o ímã esmaga a amostra contra os plugues, alcançando assim o "criogrinding" e a pulverização da pipoca. A fábrica de congeladores substitui a argamassa e o pilão e permite o processamento sequencial de várias amostras (ou até 4 amostras menores simultaneamente) com alta reprodutibilidade e evita a variabilidade usuário-usuário associada à moagem manual. Uma vez que as amostras são processadas, os extratos celulares podem ser usados para uma variedade de aplicações a jusante.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL polycarbonate tubes with screw caps</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357002</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosiences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Yeast YPD media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosiences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Yeast YPD media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Avanti centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B38624</td>
			<td>High speed centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA-9.1000</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>366754</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Dextrose Anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>901521</td>
			<td>Yeast YPD media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf A-4-44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22637461</td>
			<td>Swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5150-1GA</td>
			<td>Volume excluder and cryoprotectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>FisherBiotech</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS6 antibody</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70796</td>
			<td>Antibody for HIS tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td>Salt for maintaining ionic strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG-132</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>474790</td>
			<td>Proteasome Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P7170-1L</td>
			<td>Protein Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor JLA 25.500</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>JLA 25.500</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate</td>
			<td>EM Science</td>
			<td>BX2165-1</td>
			<td>Histone Deacetylase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6521</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Vanadate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>159664</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium &#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13408-09-8</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex Certiprep 6850 freezer mill</td>
			<td>SPEX Sample Prep</td>
			<td>6850</td>
			<td>Freezer Mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td>BD Biosiences</td>
			<td>635502</td>
			<td>For pulling down HIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>VW1521-07</td>
			<td>Non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>M131-250ML</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cell extracts by cryogrinding in an automated freezer mill

A facilidade da manipulação genética e a forte conservação evolutiva das máquinas celulares eucarióticas na levedura saccharomyces cerevisiae tornou-a um organismo modelo genético preeminente. No entanto, uma vez que o isolamento eficiente da proteína depende da interrupção ideal das células, o uso de levedura para análise bioquímica de proteínas celulares é dificultado por sua parede celular que é cara para digerir enzimaticamente (usando lyticase ou zymolyase), e difícil de interromper mecanicamente (usando um batedor de contas tradicional, uma prensa francesa ou um moedor de café) sem causar aquecimento de amostras, o que por sua vez causa denaturação e degradação de proteínas. Embora a moagem manual de células de levedura sob nitrogênio líquido (LN2) usando uma argamassa e pilão evite o superaquecimento das amostras, é trabalhosa intensiva e sujeita à variabilidade na lise celular entre os operadores. Por muitos anos, temos preparado com sucesso extratos de levedura de alta qualidade usando criogrinding de células em uma fábrica de congelador automatizada. A temperatura de -196 °C alcançada com o uso da LN2 protege o material biológico da degradação por proteases e núcleos, permitindo a recuperação de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas. Aqui descrevemos esta técnica em detalhes para células de levedura brotante que envolve primeiro o congelamento de uma suspensão de células em um tampão de lise através de sua adição dropwise em LN2 para gerar gotículas congeladas de células conhecidas como "pipoca". Esta pipoca é então pulverizada sob LN2 em um moinho de congelador para gerar um extrato congelado "em pó" que é descongelado lentamente e esclarecido por centrifugação para remover detritos insolúveis. Os extratos resultantes estão prontos para aplicações a jusante, como purificação de proteínas ou ácidos nucleicos, análises proteômicas ou estudos de co-imunoprecipitação. Esta técnica é amplamente aplicável para a preparação de extratos celulares de uma variedade de microrganismos, tecidos vegetais e animais, espécimes marinhos, incluindo corais, bem como isolar DNA/RNA de espécimes fósseis forenses e permafrost.

Comparamos dois métodos diferentes para a lise celular de levedura, a moagem de contas de vidro a 4 °C e um método automatizado de criogrinding a -196 °C, para avaliar as proteínas de recuperação relativa nos extratos celulares preparados com ambos os métodos. Para este estudo, optou-se por usar uma levedura brotante YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3 -Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])16</su...

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Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

Descrevemos um método confiável para a preparação de extratos celulares inteiros de leveduras ou outras células usando uma fábrica de congelador criogênico que minimiza a degradação e a desnaturação de proteínas. Os extratos celulares são adequados para purificação de complexos proteicos funcionais, análises proteômicas, estudos de co-imunoprecipitação e detecção de modificações de proteína labile.

Preparação de extratos celulares por criogrinding em um moinho de congelador automatizado

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

A levedura é um organismo modelo popular, não apenas para estudos genéticos, mas também para estudos bioquímicos de proteínas e outras macromoléculas extraídas do tipo selvagem e cepas de leveduras mutantes. No entanto, devido às suas paredes celulares resistentes, um grande desafio que os pesquisadores enfrentam é essa lise eficiente das células de levedura sem danificar o conteúdo celular. O isolamento de macromoléculas biológicas intactas é geralmente crítico, dependente da temperatura.A preparação dos extratos em baixa temperatura garante que as proteases e núcleos intracelulares permaneçam inativos, resultando em isolamento confiável de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas para lise suficiente. Vários métodos estão disponíveis para a obtenção de extratos de levedura através de enzimática, química e lise física. No entanto, a lise enzimática é cara devido à exigência de enzimas purificadas para digerir a parede celular, limitando assim o uso de menor número de células.Além disso, as reações enzimáticas devem ser monitoradas de perto para evitar a digestão excessiva e a lise prematura das células. Métodos químicos utilizando agentes de desnaturação fortes, embora eficazes, resultam na desnaturação de proteínas e, como tal, não são adequados para o isolamento de complexos proteicos ou enzimas funcionais. Métodos físicos, como a lise sob alta pressão em uma imprensa francesa, podem ser realizados no frio a quatro Celsius, mas que não é frio o suficiente para evitar a degradação e a desnaturação de todas as proteínas nativas.Outros métodos físicos populares são o uso de uma argamassa e pilão, liquidificador ou moedor de café para moer células de levedura resuspended em um tampão de lise e congelado como gotículas ou moagem e mistura de contas de vidro e levedura em um moinho de batedor de contas de preparação rápida ou uma lise por sônica. No entanto, a moagem manual é intensiva em mão-de-obra e o rendimento da proteína resultante pode variar consideravelmente dependendo das técnicas empregadas enquanto a lise por sônica ou moagem em um liquidificador, moedor de café ou moinho de batedor de contas gera uma quantidade substancial de calor, o que resulta em uma desnaturação e degradação proteica. Portanto, para obter lise celular de levedura com proteínas em seu estado natal com desnaturação mínima e degradação para aplicações como purificações de complexos proteicos funcionais, ensaios bioquímicos ou detecção de modificações pós-translacionais fugazes, é essencial usar um método de lise facilmente escalável que minimizará a geração de calor, permitindo uma lise eficiente, independentemente da quantidade de células.Aqui descrevemos um método que envolve o uso de uma fábrica de congeladores criologicamente para a lise das células em nitrogênio líquido a menos 196 Celsius para gerar extratos de células congeladas, permitindo assim a recuperação de macromoléculas funcionais intactas, como proteínas ou DNA e RNA, a uma temperatura muito baixa que minimiza a desnaturação e a degradação. Este método pode ser prontamente adaptado para uso com qualquer tipo de amostra de célula ou tecido de qualquer espécie, incluindo amostras forenses e até antigas recuperadas de sítios arqueológicos ou encontradas congeladas em permafrost. A fábrica de congeladores usa uma câmara de moagem eletromagnética supercondutora que move rapidamente uma barra de metal sólido para frente e para trás dentro de um arquivo de policarbonato contendo a amostra a ser pulverizada entre plugues finais de aço inoxidável.Este método de lise celular física permite uma lise mais eficiente e, reproduvelmente, resulta em um extrato de melhor qualidade. As células de levedura foram cultivadas a uma concentração de 10 milhões de células por mil. Estas células de levedura foram colocadas antes da garrafa de centrífuga gelada e foram giradas por 10 minutos a 2.400 G.Uma vez que o giro está completo, decantar o sobrenante sem perturbar as células pelleted.Esta pelota foi resuspended em uma pequena quantidade de água gelada, cerca de metade do volume inicial da cultura para lavar as células. As células resuspended foram novamente giradas para baixo por mais 10 minutos a 2.400 G.Uma vez que o próximo giro está completo, nós, novamente, decantamos todo o supernante sem perturbar a pelota. Esta pelota será então resuspended e 15 ML de tampão de lise gelada.Certifique-se de que a pelota está completamente resuspendida. As células resuspended devem permanecer no gelo em um tubo pré-marcado até estar pronto para o próximo passo. Use sempre equipamentos de proteção individual ao manusear nitrogênio líquido, como óculos de segurança, proteção manual e jalecos.Para maximizar nossa destreza, muitas vezes usamos um par de luvas térmicas brancas entre dois pares de luvas de nitrito. Troque as luvas externas e nitríis com frequência, pois elas rasgam facilmente após serem expostas a nitrogênio líquido. Em nosso laboratório, transferimos uma alíquota de nitrogênio líquido para um pequeno recipiente de nitrogênio líquido de cinco litros.O nitrogênio líquido é então derramado em um tubo de 50 ML que foi pré-refrigerado em gelo seco. Uma vez que o tubo de 50 ML esteja cheio de nitrogênio líquido, adicionamos o extrato de levedura lentamente, de forma sábia ao tubo em incrementos de 1,5 mililitro. Para minimizar a formação de grandes pelotas de pipoca, a suspensão da levedura é adicionada em um movimento circular.Para evitar ainda a formação de grandes pelotas de pipoca, usamos grandes fórceps para garantir que todas as pelotas estejam entre 0,3 e 0,5 centímetros de diâmetro. Como o nitrogênio líquido está sempre evaporando, certifique-se de reabastecer o tubo com nitrogênio líquido antes de adicionar cada 1,5 mil alíquotas de suspensão de levedura. Uma vez que toda a suspensão da levedura tenha sido feita em pipoca, permita que o tubo com pipoca fique sem a tampa por dois a três minutos para deixar que todo o nitrogênio líquido residual evaporasse.Para ter certeza de que todo o nitrogênio líquido evaporou, feche a tampa quase completamente e agite suavemente. Se há um ruído de assoante, indica que o nitrogênio líquido ainda não evaporou completamente. Abra a tampa por mais um minuto ou mais para permitir que o nitrogênio líquido restante evapore antes de fechar a tampa firmemente.O líquido residual no tubo pode causar uma explosão se a tampa for fechada prematuramente. Esta pipoca de levedura pode ser armazenada quase indefinidamente em menos 80 graus C.Para pelo menos cinco amostras, certifique-se de que você tenha 30 a 35 litros de nitrogênio líquido disponíveis. Encha o moinho de congelador na linha completa e feche a tampa para permitir que o moinho de congelador esfrie por alguns minutos.Mais uma vez, lembre-se sempre de usar equipamento de proteção pessoal ao lidar com nitrogênio líquido. Os frascos de moagem de policarbonato, os plugues de extremidade de aço inoxidável e a barra de impacto deve ser pré-refrigerado com nitrogênio líquido. Mantenha esses componentes submersos até que o nitrogênio líquido pare de borbulhar.Lembre-se de manter todas as amostras de pipoca em gelo seco até que todo o processo de moagem esteja completo. Retire todo o nitrogênio líquido dos frascos de moagem e transfira sua pipoca para o frasco. Não se esqueça de colocar uma barra de impacto magnético no frasco de moagem também.Sele o frasco de moagem colocando cuidadosamente o plugue de aço inoxidável uniformemente na extremidade do frasco de moagem. Nós batemos cada extremidade do frasco de moagem em uma tábua de madeira com uma vibração absorvendo apoio de borracha para garantir que os plugues finais sejam colocados corretamente e estejam selando os frascos de moagem firmemente. É importante fixar os plugues finais para garantir que eles não se soltem e permitam que as amostras derramem no moinho de congelador durante o processo de moagem.Coloque um frasco de moagem na câmara de moagem do moinho de congelador e bloqueie no lugar. Feche a tampa do moinho de congelador e triture a amostra por três ciclos a dois minutos por ciclo, a uma taxa de esmagamento de 14. Após os ciclos de moagem estiverem completos, desbloqueie o frasco com o lise de células congeladas em pó.Para evitar que o lisato descongele, trabalhe de forma rápida e cuidadosa para desaparafusar um dos plugues finais usando a ferramenta de abertura. Uma vez que o frasco esteja aberto, remova a barra impactor e transfira rapidamente o extrato de pó congelado em um prato de pesagem de plástico pré-refrigerado. Recupere o máximo possível do extrato congelado batendo o frasco na tábua de madeira.Uma vez que todo o pó é removido do frasco, transfira rapidamente todos os extratos de pó em um tubo pré-rotulado de 15 mil mantidos em gelo seco. Embora seja melhor prosseguir com o descongelamento e o uso dos extratos imediatamente para minimizar a degradação da proteína, o liseto em pó congelado pode ser armazenado durante a noite a menos 80, se necessário. Descongele o pó lentamente em um chorume de gelo que é continuamente circulado usando uma barra de agitação magnética em um balde de gelo.Para facilitar até mesmo o descongelamento, remova o gelo que se desenvolve na parte externa dos tubos com frequência, cerca de cinco minutos ou mais. Uma vez que os extratos começam a descongelar no coquetel inibidor de protease 1X e 10 micromolars proteasome inibidor MG132 para evitar a degradação da proteína. Uma vez que as amostras estejam completamente descongeladas, o que pode levar mais de uma hora, gire as amostras a 3.220 G por 20 minutos a quatro graus Celsius.Este giro removerá a maioria dos detritos celulares do liseto. Quando o giro estiver completo, transfira o supernatante em garrafas de policarbonato que foram pré-refrigerados no gelo e descarte a pelota. Centrifugar o supernato e amostras a 16.000 G a quatro graus Celsius por 20 minutos para esclarecer o extrato.Após a rotação estar completa, recupere apenas o supernatante claro cuidadosamente do meio da coluna líquida sem perturbar a camada nublada que contém a peça em cima ou os detritos pelleted na parte inferior do tubo de centrífuga. Transfira o lise claro para um tubo fresco pré-refrigerado de 15 Mil. O líquido nublado restante pode ser recentementerifuado por cinco minutos na mesma velocidade para permitir a recuperação de um pouco mais do lysate atacado.Os extratos estão agora prontos para uso em experimentos, como purificação de complexos proteicos e imunoprecipitação. Comparamos dois métodos diferentes de lise celular de levedura, a moagem de contas de vidro a quatro Celsius e um método automatizado de moagem crio em menos 196 Celsius para avaliar as proteínas relativas recuperadas e extratos celulares preparados com ambos os métodos. A partir deste estudo, optamos por usar uma cepa de levedura brotante carregando uma cópia alta plasmid expressando uma ubiquitina marcada por HIS-MYC.Assim, podemos avaliar a afinidade de recuperação de proteínas polibiquitinadas marcadas de extratos por atacado, seguindo a purificação de afinidade usando talon cobalto HIS tag affinity beed seguido por manchas ocidentais com um anticorpo monoclonal HIS tag. Proteínas polibiquitinadas que normalmente são de curta duração devido à sua rápida degradação pelo maquinário proteasome de ubiquitina e, assim, oferecem uma maneira muito boa de comparar a qualidade dos extratos por atacado preparados por diferentes métodos. Como vemos pela metade direita da membrana manchada de Ponceau, recuperamos um maior rendimento total de proteína nos extratos por atacado preparados pelo protocolo da fábrica de congeladores crios, como julgado pela mais intensa mancha de Ponceau em toda a faixa de extrato por atacado.Isto é especialmente claro nas partes inferior e superior das faixas inteiras de extratos da fábrica de congeladores. Além disso, como mostrado pela metade direita da mancha ocidental his tag, observamos uma melhor recuperação da proteína ubiquitinada his-MYC, seguida por puxar para baixo usando contas talon dos extratos de atacado preparados pela moagem criogênica. Concluímos que a fábrica de congeladores criogênicos é superior a outros métodos para a preparação de extratos celulares, especialmente quando macromoléculas funcionais são necessárias para a aplicação a jusante.

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

Encapsulation título celular por Droplets

Biologia

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Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

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Comparação de tabaco métodos de remoção de células hospedeiras de proteínas por descascamento plantas intactas ou por tratamento térmico de extratos

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Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

Medindo a confluência de iPSCs usando um sistema automatizado de imagem.

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